BIOTEHNOLOGII DE OBŢINERE

A SUBSTANŢELOR BIOLOGIC
ACTIVE
CAP. 3 – PRODUȘII
METABOLISMULUI
MICROBIAN
Ca urmare a activităţii metabolice (anabolism)
microorganismele produc:

metaboliţi primari

metaboliţi secundari

enzime
poliozide capsulate
proteine
biomasă celulară
 Metaboliţii primari
Sunt compuşi cu greutate moleculară mică
sintetizați în faza de creștere logaritmică.

Pot fi monomeri macromoleculari sau pot servi la

sinteza coenzimelor.

Sunt produşi în celula microbiană atât cât este

necesar pentru nevoile proprii; prin tehnici de
inginerie genetică se pot obţine tulpini care să
producă în exces metaboliţi primari.
Pe cale industrială, folosind microorganismele,
pot fi obţinuţi următorii metaboliţi primari:

Aminoacizi

Acizi organici

Vitamine

Solvenţi organici

Nucleotide purinice şi pirimidinice

Aminoacizi obţinuţi prin biosinteză
lizină
acid glutamic
serină
asparagină
glicocol
alanină
cisteină
metionină, etc
Acizi organici obținuți prin biosinteză

- acidul citric
- acidul acetic
- acidul lactic
- gluconic
- galic
- oxalic
 Acidul citric

Produs în special de fungi:

Aspergillus niger

1919 → James Currie şi

Jasper Kane (Pfizer)
introduc producerea
pe calea biosintezei la
scară industrială).
 Acidul acetic

- cel mai utilizat acid organic la nivel industrial,

servind la fabricarea cauciucului, materialelor
plastice, fibrelor de acetat, substanţelor
farmaceutice, insecticidelor;

- substrat de biosinteză pentru aminoacizi

(glutamic, lizină), conservant.
 Acidul lactic

Primul acid organic produs prin

biosinteză microbiană folosind
Lactobacillus delbrueckii → converteşte
glucoza pe calea fermentaţiei lactice.

Largă utilizare în:

- industria alimentară – produse lactate,
- industria textilă - coroziv,
- industria maselor plastice -
electrolustruire
Obţinerea de vitamine

Substanţe organice care în

cantităţi foarte mici îndeplinesc în
organism.

Nu pot fi sintetizate de
organismul animal, ci numai de
plante şi microorganisme:
Sacharomyces cerevisiae,
Ashbya gossypii,
Propionibacterium shermanii
 Obţinerea de solvenţi organici (alcooli)

Obţinuţi folosind microorganismele

pe calea fermentaţiei alcoolice.

Etanolul
Obţinut industrial cu levuri din
genul Saccharomyces s-au unele
bacterii:

Sarcina Bacillus
ventriculi macerans
 Metaboliţi secundari (idioliţi)

Sunt compuşi cu greutate moleculară redusă,

nefiind indispensabili creşterii şi dezvoltării
microorganismelor.

Sunt sintetizați la sfârșitul fazei de creștere și în

timpul celei staționare.

Microorganismele produc metaboliţii secundari

pe parcursul unei faze de sinteză (idiofaza)
când creşterea este încetinită, procesele
celulare limitându-se la sinteza idiolitului.
Metaboliţi secundari microbieni:

Antibioticele

Alcaloizii

Hormonii de creştere (giberilinele)

Toxinele
BIOTEHNOLOGII DE
OBŢINERE A
AMINOACIZILOR
 Importanţa producerii de aminoacizi cu
ajutorul microorganismelor

Plantele verzi îşi pot sintetiza aminoacizii necesari,

plecând de la compuşi anorganici simpli.

Animalele pot sintetiza doar o parte din aminoacizii

necesari, restul → aminoacizi esenţiali primindu-i
prin hrană.

Aminoacizi esenţiali: lizina, treonina, valina,

metionina, triptofanul, fenilalanina, leucina,
izoleucina.
Alte categorii de aminoacizi obţinuţi prin
biotehnologii:
- aminoacizi parţial esenţiali: histidina, arginina
- aminoacizi neesenţiali, utilizaţi în industrii: acidul
glutamic (ind. farmaceutică, alimentară)

Utilizarea aminoacizilor are ca rezultat creşterea

valorii nutritive a alimentelor de origine vegetală =
baza alimentaţiei numeroaselor popoare.

Alimente sărace în aminoacizi esenţiali:

- făina de porumb nu conţine triptofan şi lizină
- făina de grâu este săracă în lizină
 Domenii de utilizare a aminoacizilor
obţinuţi prin biotehnologii

→ Alimentaţia omului
→ Furajarea animalelor
→ Medicină
→ Industria farmaceutică şi cosmetică
→ Industria chimică

Utilizarea aminoacizilor se bazează pe valoarea

lor nutriţională, gust, activitate fiziologică şi
proprietăţile fizico-chimice.
 Căi de obţinere a aminoacizilor
1. hidroliza proteinelor (animale sau vegetale): L
glutamatul se obţinea în trecut pe această cale din
glutenul de grâu şi din melasă (metoda necesită
cantităţi uriaşe de materie primă).

2. sinteza chimică: greoaie şi costisitoare;

dezavantajul major: se obţin în final amestecuri
racemice care trebuie separate în cei doi antipozi
optici.

3. biosinteza microbiană.

4. cale enzimatică.
Cele mai folosite căi de obţinere a
aminoacizilor sunt biosinteza microbiană şi
calea enzimatică → avantaje şi
dezavantaje.

Metoda microbiologică prezintă avantajul

utilizării unor materii prime ieftine, însă
produşii finali necesită separare: pe lângă
aminoacizii doriţi se obţin şi alte categorii de
aminoacizi, impurităţi, celule microbiene
etc.
Capacitatea microorganismelor de a elimina în
mediu (la sfârşitul fazei de creştere
exponenţială) cantităţi mici de aminoacizi a fost
evidenţiată la:

- bacterii (1950): Arthrobacter, Mycobacterium,

Micrococcus, Corynebacterium, Brevibacterium

- drojdii (1952)

- mucegaiuri (1955)

- actinomicete (1958)
Amestecuri de aminoacizi întâlniţi în mediile
de cultură ale microorganismelor (1-2
mg/ml): alanina, acidul glutamic şi aspartic,
glicina, serina, valina şi leucina.

Celula microbiană produce cantităţi limitate

de aminoacizi (AA), funcţie de nevoile
proprii, biosinteza fiind controlată de
mecanismele de reglare la nivel molecular.

→ obţinerea unor cantităţi mari dintr-un

anumit AA se poate realiza cu modificarea
mecanismelor de reglare metabolică.
 Obţinerea AA cu ajutorul microorganismelor
presupune:

- stimularea pătrunderii în celulă a substanţelor

nutritive precursori pentru biosinteză

- împiedicarea reacţiilor secundare

- stimularea sintezei şi activităţii enzimelor implicate

în biosinteza AA respectiv

- inhibarea sau reducerea activităţii enzimelor care

produc degradarea AA

- stimularea eliberării AA respectiv în mediul de

cultură
 Realizarea acestor condiţii s-a făcut pe două căi
intercorelate:
1. folosirea tehnicilor de mutageneză – mutantele
auxotrofe
2. modificarea mecanismelor fine de reglare
metabolică la nivelul molecular

Producerea de AA se realizează cu:

- tulpini sălbatice (prototrofe): acidul L glutamic, L
valina, L prolina
- mutante auxotrofe: L lizina, L treonina, L leucina
- precursori de biosinteză: L triptofan, L izoleucină, L
serină, L histidină
Factori care condiţionează biosinteza AA

Cultura microbiană

Se utilizează de regulă mutante auxotrofe care

provin din populaţii naturale izolate, testate (din
punct de vedere calitativ şi cantitativ) şi supuse
mutagenezei (cu radiaţii UV, gama, etc).

Primele studii s-au efectuat în Japonia pe tulpini

bacteriene producătoare de acid glutamic →
mutante auxotrofe de AA capabile să producă un
anumit AA
 Exemple de AA obţinuţi cu ajutorul tulpinilor
auxotrofe:

- L lizină: Corynebacterium glutamicum (13 g/l),

Brevibacterium lactofermentum (20,2 g/l)

- L leucină: Corynebacterium glutamicum (16 g/l)

- L citrulină: Bacillus subtilis (16,5 g/l)

- L treonină: Arthrobacter paraffineus (9 g/l)

- L valină: Arthrobacter paraffineus (9 g/l)

Mediul de cultură

Sursa de C – unul din cei mai importanţi factori

pentru realizarea biosintezei de AA (glucoza,
zaharoza).

La nivel industrial se impune în permanenţă

testarea prealabilă a surselor de C folosite: unele
melase pot conţine factori inhibitori pentru
biosinteza AA.

Concentraţia optimă de zaharuri din mediile de

cultură: 5-15 g %.
 Sursa de N – depinde de necesităţile nutriţionale
specifice ale microorganismelor utilizate.

Tulpinile auxotrofe necesită ca sursă de N în

special săruri de NH4 sau nitraţi.

Se pot folosi şi hidrolizatele unor proteine:

- făina de soia,
- arahide,
- seminţe de bumbac,
- ureea (acidul glutamic şi lizina) – cu sterilizare
separată
 pH-ul: 6-8

Temperatura: variază între 25-370 C;

optimul se determină experimental pentru
fiecare proces.
Exemple: lizina şi acidul glutamic - 280 C

Aerarea: factor extrem de important,

deoarece biosinteza AA decurge cu randamente
ridicate în prezenţa O2 şi în condiţii de agitare.
 Biotehnologia producerii
acidului glutamic
Deşi nu este un AA esenţial, acidul glutamic este
larg utilizat în industria alimentară sub forma
glutamatului monosodic (condiment şi corector de
gust).
 Microorganisme
producătoare:

- Corynebacterium
glutamicum

- Brevibacterium
flavum

- Brevibacterium
lactofermentum
 Biosinteza acidului glutamic

Corynebacterium glutamicum + glucoză şi ioni

de amoniu → reacţii oxidative → citrat → alfa
cetoglutarat (prin ciclul Krebs) → acid glutamic
În timpul oxidării citratului până la alfa
cetoglutarat intervin două NAD
dehidrogenaze specifice acestui
microorganism: izocitrat dehidrogenaza şi
glutamat dehidrogenaza.

În condiţii de anaerobioză intervine calea

EMP care duce la obţinerea de acid lactic →
aeraţia joacă un rol deosebit de important în
obţinerea acidului glutamic.

Un alt factor ce influenţează biosinteza

glutamatului → conţinutul de biotină (vit. B7).
Un conţinut mare de biotină în mediu →
creşterea biomasei microbiene → scăderea
cantităţii de glutamat sintetizată.

O cantitate mică de biotină (deficienţă) →

acumularea unor cantităţi mari de glutamat.

Conţinutul de biotină determină şi

acumularea glutamatului în mediul de cultură
→ vit. B7 influenţează direct permeabilitatea
membranei plasmatice, facilitând excreţia
produsului.
 Producerea industrială de glutamat

Mediul de cultură utilizat la nivel industrial

conţine:

- sursă de carbon: glucoză 5 - 20 g % (melasă sau

amestec de glucoză, fructoză şi zaharoză);
etanol → tulpini auxotrofe de Brevibacterium sp.

- sursă de azot: săruri de amoniu, uree, extract de

porumb, hidrolizat de soia.

- săruri de Ca, K, Mg, Zn, Cu, Fe, Mn, Co, biotină

(urme).
pH mediului: 6 - 8.

Temperatura: 27 - 300 C, cu o bună aerare.

Mediul se inoculează cu o cultură de

Corynebacterium glutamicum de 15 - 30 ore
în raport de 5 -10%.

Se adaugă în permanență NH4OH3 pentru

aminarea reductivă a acidului α-cetoglutaric.
În aceste condiţii producerea de glutamat
decurge în două faze:

1. creşterea culturii: 10-20 ore;

2. acumularea acidului glutamic: se termină

după 30-50 ore.

La o concentraţie de 100 g zahar/l mediu se

obţin 50-60 g acid glutamic/l mediu.
Producerea de glutamat cu etanol ca sursă de
carbon s-a realizat cu specii de Brevibacterium,
obţinându-se randamente de 60 g/l glutamat.

Tulpinile care folosesc etanolul necesită biotină ca

factor de creştere şi răspund la limitarea
concentraţiei de biotină în mod similar cu tulpinile
care folosesc glucidele ca sursă de carbon.

Producerea de glutamat pe bază de parafine s-a

realizat cu o tulpină auxotrofa de glicerol, C.
alkanolyticum, obţinându-se 40 g/l glutamat.
În România s-a pus la punct un procedeu de
biosinteză a glutamatului folosind
Brevibacterium lactofermentum.

Pe un mediu standardizat (glucoză 10-12 %,

extract de porumb 0,3 %; uree 2-3 %, fosfaţi
mono- şi bipotasic 0,1 respectiv 0,15%, sulfat
de magneziu 0,05 %) se produc 60-70 g/l
glutamat, în condiţii de aeraţie puternică, timp
de fermentaţie: 30-36 h.
Aplicaţii practice ale acidului glutamic

În medicină se utilizează pentru tratamentul unor

afecţiuni ale sistemului nervos → întreţine şi
ameliorează metabolismul neuronului.

Rezultate pozitive → tratamentul schizofreniei,

epilepsiei, encefalitei, poliomielitei → îndepărtează
amoniacul format în ţesuturi prin transformare în
glutamină → scade fenomenul de oboseală şi
intoxicaţie.

În industria alimentară: condiment, ameliorator de gust

(adăugarea de cantităţi de 0,1-0,5 % contribuie la
accentuarea gustului natural al produselor
alimentare).
Biotehnologia producerii lizinei

Aminoacid esenţial
utilizat în
alimentaţia omului
şi animalelor
pentru a suplini
carenţa de lizină
din alimentele
vegetale.
 Microorganisme utilizate
Lizina a fost obţinută iniţial în 1953 folosind
Escherichia coli.

În 1956 se descoperă în Japonia un microorganism

capabil să producă lizină într-un mediu cu glucoză
și ioni de amoniu – Corynebacterium glutamicum.

Pentru biosinteză lizinei se folosesc şi alte

organisme precum: Arthrobacter citrus, Trichospora
cutaneum, Mycobacterium tuberculosis,
Streptomyces coronoformis.
Tulpinile de tip sălbatic au fost izolate din natură
după capacitatea de a produce acid glutamic şi
apoi prin mutageneză s-au obţinut mutante
producătoare de diverşi aminoacizi, printre care şi
L-lizina.

Tulpina folosită pentru obţinerea de mutante

producătoare de L-lizină poate aparţine
următoarelor genuri: Micrococcus, Brevibacterium,
Microbacterium, Corynebacterium etc.
 Biosinteza lizinei

Poate fi obţinută prin trei metode:

1. extracţie din produse naturale,

2. sinteză chimică,

3. biosinteză.
 Extracţia din produse naturale

Se utilizează ca surse: caseina, gelatina,

glutenul de grâu sau soia.

Pe această cale se obţin produse optic-active

(L) însă, cantitatea mare de materii prime
necesare, producţia redusă şi preţul de cost
ridicat au impus elaborarea altor metode mai
economice.
 Sinteza chimică

Cea mai rentabilă este metoda care pleacă

de la caprolactamă.

Metoda are dezavantajul, pe lângă faptul că

este grea şi costisitoare, că se obţin
preparate racemice, care trebuie separate
apoi în cei doi antipozi optici.
 Biosinteză

Metoda microbiologică are avantajul folosirii

unor materii prime ieftine, dar producţia
necesită timp şi aminoacizii formaţi trebuie
separaţi de alţi aminoacizi din mediu şi de
diferite impurităţi, inclusiv celulele microbiene.

Se cunosc 2 căi de obţinere:

1. sinteza în două etape
2. sinteza directă
 Sinteza în două etape

Primul procedeu de obţinere a L-lizinei,

sinteza în două etape, a fost elaborat de firma
Pleizer în 1956.

Conform acestuia, L-lizina se obţine în două

etape: biosinteză acidului diaminopimelic
(DAP) şi decarboxilarea enzimatică a acidului
diaminopimelic cu formarea L-lizinei.
Folosind o mutantă de E. coli,
într-o primă etapă se obţine,
pornind de la glucoză, în
condiţii de aerare şi agitare,
acidul diaminopimelic.

În a doua etapă, sub acţiunea

bacteriei Enterobacter
aerogenes, acidul
diaminopimelic este
decarboxilat până la lizină.

În prezent a fost abandonată.

 Sinteza directă
Foloseşte un singur
microorganism
(Corynebacterium glutamicum),
fiind metoda cea mai
avantajoasă cale biotehnologică
de obţinere a lizinei.

În practica industrială se
utilizează tulpini auxotrofe de
homoserină şi biotină (homoser-,
bio-) care dau cele mai bune
rezultate sub raportul acumulării
de lizină.
 Producerea industrială a lizinei

Se utilizează un mediu de cultură glucozo-

mineral, în condiţii de aerare, la un pH neutru.

Sursă de carbon: înlocuirea glucozei cu zaharoza

măreşte producţia de lizină (melasa fiind o
excelentă sursă de carbon în acest scop); acetat.

Sursa de azot: extract de porumb, extract de

cartofi, sulfat de amoniu, hidrolizat acid de șrot de
soia, hidrolizat de drojdii sau gluten.
Sărurile minerale sunt vitale, asigurând
creșterea amsei celulare.

Aminoacizii – prezența biotinei și serinei este

esențială.

Fermentaţia se efectuează în condiţii

aerobe, între 24 şi 37° C, pH 5 - 8,5, timp de
4 - 5 zile şi asigură acumularea în mediu a
unei cantităţi de L-lizină de 20-25 g/l.
După terminarea procesului de fermentaţie, biomasa
se prelucrează pentru separarea lizinei pure.

Din mediul fermentat rezultat de la biosinteză se

separa L-lizină în stare pură prin adsorbţie pe
cationiţi puternici, eluţie cu baza slabă, concentrarea
eluatului şi cristalizarea produsului pur.

Pentru produsul destinat uzului veterinar, biomasa

rezultată de la fermentaţie se prelucrează prin
atomizare, obţinându-se în final un amestec de L-
lizină şi masă bacteriană, amestec ce conţine 10%
L-lizină şi constituie un valoros biostimulator.
 Producerea de lizină este influenţată de:

1. concentraţia de biotină din mediu – prezenţa

biotinei în mediul de cultură favorizează
biosinteza lizinei; la concentraţii suboptime se
obţine acidul glutamic.

2. concentraţia de AA din mediu – mutantele fiind

auxotrofe de homoserină → prezenţa acestui
AA în mediul de cultură este esenţială.

Homoserina poate fi înlocuită cu o cantitate

bine proporţionată de metionină şi treonină →
excesul de treonină declanşează un mecanism
represor care inhibă biosinteza lizinei.