UNIVERSITATEA „VASILE ALECSANDRI”din BACĂU

Facultatea de Inginerie
Calea Mărăşeşti, Nr. 157, Bacău, 600115, Tel./Fax +40 234 580170
http://www.ub.ro/inginerie; e-mail: decaning@ub.ro

SPECIALIZAREA: ȘTIINȚA ŞI INGINERIA PRODUSELOR ALIMENTARE

ECOLOGICE

Metode verzi de valorificare a principiilor

active din surse vegetale
-proiect-
METODE DE SEPARARE A ANTOCIANINELOR DIN AFINE
(VACCINIUM CORYMBOSUM L.)

Coordonatori
Prof. Univ. Dr. Chim. Adriana Luminiţa Fînaru
Conf. Dr. Ing. Alisa Aruş

Masterand,
Prof. Şchiop Elena-Cristina

2020
 Cuprins

Introducere………………………………………………………………………………. 3
Capitolul I. Metode de izolare si analiză a antocianinelor………………………………. 4
Capitolul II. Acţiune antimicrobiană……………………………………………………. 8
Capitolul III. Acţiune antioxidantă………………………………………………………. 9
Concluzii…………………………………………………………………………………. 10
Bibliografie……………………………………………………………………………… 10

Introducere

2
Antocianii sunt coloranţi naturali, care au atras interesul nu doar datorită culorilor plăcute
regăsite ȋn fructele şi legume ci şi datorită faptului ca sunt molecule biologic active cu beneficii
pentru sănătate. Cele mai bogate surse de antociani sunt fructele de pădure, precum afinele, soc,
aronia, zmeură, legumele şi unele cereale. Antocianii prezintă o serie de proprietăţi benefice,
dintre care cea mai importantă constă în efectul lor antioxidant. Datorită acestei proprietăţi,
antocianii pot asigura organismului, în primul rând, protecţie împotriva reacţiilor nocive intense
şi a radicalilor liberi. Există multe studii ȋn literatură care au sugerat şi demonstrat că aceştia
oferă protecţie şi previn bolile degenerative. De asemenea, acestea pot fi utilizate în domeniul
tehnologic, ca și coloranți naturali. Antocianii au un rol foarte important în industria alimentară,
farmaceutică și cosmetică, ȋnsa sunt puţin folosiţi deoarece nu sunt foarte stabili şi se extrag din
materia primă ȋntr-un procent redus. În prezent, majoritatea studiilor pe antociani au ca obiectiv
rezolvarea acestor probleme, precum și cele legate de purificare a extractului, și de evaluare a
efectului lor antioxidant pe culturi celulare.[1]

Afinul (Vaccinium corymbosum) este un arbust cu fructe mici, important din punct de vedere
economic și membru a familiei Ericaceae. Trei tipuri majore de afine sunt recoltate comercial,
inclusiv lowbush (Vaccinium. angustifolium), highbush (V. corymbosum), și bluberry rabbiteye
(V. ashei sau V. virgatum). Deși cea mai mare parte provine din America de Nord, multe specii
de afine sunt cultivate pe scară largă în Asia, Europa, America de Sud, Africa, Australia și Noua
Zeelandă datorită capacității lor antioxidante. Cererea și consumul la nivel mondial de afine a
crescut foarte mult în ultimii ani pentru influența sa benefică asupra sănătății umane. Aceste
efecte pozitive se datorează, în general, nivelurilor ridicate de flavonoide, care conduc la
îmbunătățirea vederii nocturne, prevenirea degenerescenței maculare și scăderea afecţiunilor
cardiace[2]

Flavonoidele participă la procese de oxido-reducere cu rol de vitamina P. Pratt (1992) a constatat

că flavonoidele (flavonele, flavonolii, izoflavonele, şi flavanonele) sunt cele mai importante
substanţe antioxidante. Antocianidinele dau culoarea roşie sau violet fructelor şi unor legume
(varză roşie) reprezintă din punct de vedere chimic glicozide ale antocianidelor.[3]

3
 Pelargonidina R=H, Peonoidina R=OCH3,
R1=H R1=H
Cianidina R=OH, Malvidina R=R1=OCH3
R1=H
Delfinidina R=R1=OH Petunidina R=OH,
R1=OCH3
Figura.1. Antocianidina[3]

Capitolul I. Metode de izolare si analiză a antocianinelor

Deividas Burdulisi şi colaboratorii de la Kaunas University din Lituania au supus analizei probe
de Vaccinium corymbosum colectate la întâmplare în siturile de prelevare naturală de pe
teritoriul Lituaniei. Probele de fructe proaspete și coapte au fost înghețate și depozitate la
congelator la -19 ± 10C până la utilizare. Aproximativ 50 g de boabe înghețate au fost zdrobite
pentru a produce un piure gros. O probă de 5 g (greutate exactă) a fost introdusă într-un balon cu
fund plat de 100 ml și s-au adăugat 95 ml de metanol. Pentru procedura de extracție, s-a utilizat o
baie cu ultrasunete BioSonic UC 100 în care proba a fost menţinută timp de zece minute.[4]

Cantitatea totală de polifenoli din extractele de fructe de pădure a fost determinată cu reactivul
Folin-Ciocalteu conform metodei Slinkard și Singleton folosindu-se acid galic ca etalon. Au fost
introduse probe de 1,0 ml în cuvele de testare, apoi au fost adăugate 5,0 ml de reactiv Folin-
Ciocalteu și 4,0 ml Na2CO3 (7,5%). Absorbanța tuturor eșantioanelor a fost măsurată la 765 nm
folosind spectrofotometrul Genesys10 UV/Vis după incubare la 200C timp de 1,0 oră.[4]

Conținutul total de antocianină al extractelor de boabe a fost măsurat prin metoda

spectrofotometrică. Probele au fost determinate folosind un spectrofotometru model Unicam
Helios ALPHA. Extractul a fost filtrat prin filtru de hârtie într-un balon volumetric de 100,0 ml
și diluat cu extractor adecvat la 100,0 ml. S-a preparat o diluție de 50 de ori a acestei soluții cu
acid clorhidric în metanol 0,1%. Absorbanța soluției a fost măsurată la 528 nm lungime de undă,
folosind o soluție 0,1% de acid clorhidric în metanol ca etalon. Rezultatele sunt exprimate ca
procent de cianidină 3-glucozide echivalente.[4]

4
Hidroliza acidă și analiza cromatografică s-a realizat astfel: 25 ml de extract metanolic s-au
amestecat cu 8,5 ml acid clorhidric concentrat. Amestecul s-a încălzit sub condensator de reflux
timp de 2 ore. După hidroliza acidă, conținutul de antocianină a fost transformat în cinci
antocianidine majore. Probele hidrolizate au fost trecute prin filtre cu membrană cu dimensiunea
porilor 0,22µm înainte de introducerea în HPLC. Probele-martor de antocianidină au fost
dizolvate împreună în metanol pentru a forma un amestec standard de clorură de cianidină,
clorură de delfinidină, clorură de petunidină, clorură de peonidină și clorură de malvidină.
Amestecul standard a fost diluat în metanol pentru a genera o curbă de calibrare în cinci puncte
pentru cinci compuși antocianidină standard separat. Zonele de vârf ale antocianidinelor din
extractele de fructe s-au încadrat în limitele liniare ale curbelor de calibrare. Experimentele au
fost efectuate cu sistemul HPLC Waters 2690 Alliance, echipat cu Waters 2487 Dual
Absorbance Detector (UV/Vis) și Waters 996 Photodiode Array (PDA) Detector, cuplat la un
computer personal cu Sistemul de administrare cromatografică Waters Millennium 2000W
pentru stocarea și procesarea datelor. Separarea antocianidinelor s-a efectuat folosind o coloană
Supelco Hypersil ODS (C18) (100 x 3 mm id; mărimea particulelor 3 mm), protejată cu o ODS
Hypersil (10 x 4,6 mm id; dimensiunea particulelor 5 mm). Coloana a fost menținută la
temperatura ambiantă. Debitul a fost menținut constant la 1,0 ml / min pentru un timp de rulare
total de 45 min. Fazele mobile au fost: A-acetonitril și B-4% acid ortofosforic apos (v / v).
Sistemul a fost rulat cu un program de gradient: 0-37 min, 7-25% A, 37-40 min, 25-7% A și 40-
45 min 7% A. A existat un post de 5 min în condiții inițiale pentru echilibrarea coloanei.
Volumul de injecție pentru toate soluțiile standard și extractele de mure a fost de 10 µL.
Detectorul UV / Vis a fost setat la 520 nm, lungime de undă PDA 200-800 nm. Identificarea
antocianidinelor s-a obținut prin compararea timpilor de retenție și a spectrelor UV/Vis obținute
cu un detector PDA cu cele ale standardelor.[4]

După cum se observă în figura 2, cea mai mare cantitate de antocianine a fost observată în pieliţa
fructelor de afine specia Coville (1,77%), în timp ce cea mai mică cantitate a fost determinată în
pieliţa speciei „Herbertî”(0,67%)[4]

5
 Figura 2. Conținutul total de antocianine în culturile de mure și afine, în pieliţă și în fruct[4]

Cromatogramele reprezentative pentru HPLC de extracte de mure și afine sunt prezentate în

figura 3. Analiza cromatografică a arătat că compoziția calitativă a antocianidinelor din fructele
de mure și afine și ale acestora este omogenă.[4]

Figura 3. Cromatograme reprezentative ale antocianidinelor în a) mure, b) afine,

1 - delfinidină, 2 - cianidină, 3 - petunidină, 4 - peonidină, 5 – malvidină[4]

Rezultatele cantitative obținute pentru cantitatea de antocianidine individuale din fructe de mure
și afine sunt prezentate în tabelul 1 și cele din pieliţe de fructe din Tabelul 2.[4]

6
Tabelul 1: Cnţinutul de antocianidine din pulpa fructelor[4]

Tabelul 2: Cnţinutul de antocianidine din pieliţa fructelor[4]

7
 Capitolul II. Acţiune antimicrobiană

Deividas Burdulis şi colaboratorii au evaluat activitatea antimicrobiene a extractelor de

antocianidine pe următoarele culturi de teste bacteriene Gram-pozitive: Listeria monocytogenes
(ATCC 19117), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus subtilis (ATCC 6633) (spori și
celule vegetative), Enterococcus faecalis (ATCC 29212) și, de asemenea, pe culturile de teste
bacteriene Gram-negative Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC
27853), Citrobacter freundii (ATCC 8090) și Salmonella typhimurium (ATCC 14028). Au fost
utilizate și opt tulpini de drojdii: Debaryomyces hansenii, Trichosporon cutaneum,
Kluyveromyces marxianus var. lactis, Sacharomyces cerevisiae, Candida para psilosis
Torulaspora delbrueckii, Pichia kluyveri și Rhodotorula rubra. Proprietățile antimicrobiene au
fost evaluate prin metoda de difuzie a sondei de agar. Activitățile antioxidante ale extractelor au
fost determinate folosind metoda 2,2-difenil-1-picrililhidrazil (DPPH) pentru a determina
potențialul de eliminare a radicalilor liberi pentru fiecare probă. Activitatea antiradicală a fost
calculată ca procent din decolorarea DPPH versus control (soluție metanolică).[4]

Investigarea a arătat că printre culturile de test Gram-negative C. Freundii au fost cele mai
sensibile în zone medii de inhibare, 21,66 mm pentru pieliţe și 23,55 mm pentru extractele de
boabe. E. coli a prezentat cea mai mare rezistență la extractele de boabe; zona medie de inhibare
a fost de 13,6 mm pentru toate probele investigate. Extractele de etanol din pieliţe de și boabe au
arătat efecte inhibitoare asupra creșterii culturilor de test Gram-pozitive L. monocytogenes și B.
subtilis. Mai sensibilă a fost cultura L. monocytogenestest. După compararea influenței
antimicrobiene asupra sporilor și celulelor vegetative, s-a constatat că celulele vegetative B.
subtilis erau mai sensibile și făceau zone de inhibare mari (16,83 mm). Cele opt specii de drojdie
Debaryomyces hansenii, Trichosporon cutaneum, Kluyveromyces marxianus var. Laktis,
Sacharomyces cerevisiae, parapsiloza Candida, Torulaspora delbrueckii, Pichia kluyveri și
Rhodotorula rubra au prezentat o rezistență completă la extractele de afine.[4]

8
 Capitolul III. Acţiune antioxidantă

Activitatea antioxidantă a extractelor din afine bogate ȋn antociani a fost determinată de către
Zoriţa Maria Sconţa folosind trei metode, CUPRAC, ABTS și ORAC, iar rezultatele obţinute au
fost exprimate în echivalenți Trolox (μmol TE/ g FW) (Tabel 6). Rezultatele obţinute prin
metoda CUPRAC pentru varietăţile de afin au variat ȋntre 134.76 şi 185.78 μmol TE/ g FW, iar
activitatea antioxidantă cea mai ridicată s-a ȋnregistrat pentru varietatea Toro. Metoda ABTS
folosește K2S2O8 ca oxidant și măsoară capacitatea antioxidanților de a neutraliza radicalul
ABTS+ ˙ȋn comparație cu Trolox, un analog al vitaminei E. Rezultatele au variat ȋntre 6.05 şi
11.96 μmol TE/ g FW (Tabel 3). Metoda ORAC măsoară capacitatea neutralizare a
antioxidanților ȋmpotriva radicalilor peroxil. Valorile ORAC pentru probele analizate au fost
cuprinse ȋntre 21.2 și 34.5 μmol TE/ g FW. Fracția bogată ȋn antociani obținută din varietatea
Toro a demonstrat a avea cea mai mare capacitate antioxidantă.[1]

Tabelul 3. Rezultatele privind activitatea antioxidantă obţinută prin metodele complementare

ABTS, CUPRAC şi ORAC pentru diferite soiuri de afine[1]

Afine Activitatea antioxidantă (μM TE/ g fr.wt)

CUPRAC ABTS ORAC
Bluegold 134.76 ± 53.03 6.05 ± 1.34 21.21 ± 3.26
Nui 163.04 ± 23.45 7.91 ± 3.67 22.35 ± 6.77
Darrow 168.65 ± 30.33 8.43 ± 2.18 25.43 ± 2.19
Legacy 171.15 ± 46.49 8.73 ± 2.22 28.99 ± 5.31
Nelson 175.25 ± 69.06 9.12 ± 1.23 30.27 ± 4.74
Hanna’s Choice 153.89 ± 57.12 7.68 ± 1.09 20.36± 2.23
Toro 185.78 ± 92.06 11.96 ± 3.45 34.58± 3.25

Concluzii

9
Cea mai mare cantitate de antocianine totale a fost observată în pieliţele fructelor de afine.
Rezultatele cromatografice au indicat faptul că malvidina este o antocianidină dominantă în
probele de afine. S-a stabilit că în pieliţele de fructe de afine se acumulează cantități mai mari de
antocianidine decât în fructe întregi. Extractele de mure au relevat proprietăți antimicrobiene.
Citrobacter freundii (ATCC 8090) și Enterococcus faecalis (ATCC29212) au fost cele mai
sensibile dintre cele opt bacterii Gram-negative și Gram-pozitive testate: zonele inhibitoare au
fost 22,6 și, respectiv, 25,6 mm. Nu au fost stabilite diferențe semnificative între extractele de
boabe și piele. Cele opt specii de drojdie au prezentat rezistență la extractele de afine. Probele de
pieliţă de fructe de mure au și o activitate antiradicală puternică (82,69 ± 0,37%).[4]

Bibliografie:

1. *** http://www.usamvcluj.ro/files/teze/2012/sconta.pdf, accesat 29.02.2020, ora 15.08

2. ***https://bmcplantbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12870-016-0866-5, accesat
29.02.2020, ora 14.57

3. *** http://www.horticultura-bucuresti.ro/images/pdf/Biochimie.pdf, accesat 29.02.2020, ora

17.40

4. *** https://ptfarm.pl/pub/File/Acta_Poloniae/2009/4/399.pdf, 28.02.2020, ora 21.46

10