Sunteți pe pagina 1din 4

Lucrarea nr. 4 Prelucrarea si analiza calitativă a fluidelor biologice complexe. Izolarea si identificarea compuşilor biochimici din lapte

Background Laptele este o suspensie apoasa coloidala formată din mai multe componente: glucide, lipide, proteine şi fosfaţi. Conţinutul in fiecare din aceste componente depinde de sursa laptelui (de vaca, de oaie, de capră, etc.) precum şi de modul de procesare la care a fost supus fiecare sortiment.

Cazeina este cea mai importanta proteina din lapte. Acesta funcţionează ca proteina de stocare, care îndeplineste cerinţele nutriţionale. Cazeina poate fi izolată din lapte prin acidifiere pentru a o aduce la punctul izoelectric. La punctul izoelectric, numărul de sarcini pozitive pe o proteina este egal cu numărul de sarcini negative. Proteinele sunt mai puţin solubile în apă la punctul izoelectric, deoarece tind să formeze agregate datorită interacţiunilor electrostatice. Capătul pozitiv al moleculei de proteină atrage capătul negativ al altei molecule de proteine, iar agregatele formate precipită din soluţie.

proteine, iar agregatele formate precipit ă din soluţie. Pe de altă parte, dacă o molecula de
proteine, iar agregatele formate precipit ă din soluţie. Pe de altă parte, dacă o molecula de

Pe de altă parte, dacă o molecula de proteina are o sarcină net pozitivă (la un pH scăzut - condiţii acide) sau o sarcina net negativă (la un pH ridicat -condiţii bazice), solubilitatea în apă crește. Lactoza este glucida care se gaseşte in lapte şi este, din punct de vedere structural, compusă dintr-o moleculă de α-D-glucoză şi una de β-D-galactoză, unite prin legătură 1,4-β-glicozidică.

galactoză, unite prin legătură 1,4 - β - glicozidică . În prima parte a acestui experiment,

În prima parte a acestui experiment, veti izola cazeina din lapte. Cazeina va fi separata ca un precipitat insolubil prin acidularea laptelui(care are un pH de aproximativ 6.6) la punctul izoelectric al cazeinei (pH 4.6). Lipidele care precipită împreună cu cazeina pot fi eliminate prin dizolvarea în alcool. Dupa separarea caseinei si îndepartarea grasimilor veti separa si celelalte proteine solubile (lactoalbumina si lactoglobulina) prin denaturare si precipitare, in final in solutie ramanand numai lactoza. În a doua parte a acestui experiment, veti realiza identificarea caseinei si lactozei prin efectuarea unor teste chimice cunoscute.

A. Izolarea cazeinei Intr-un pahar Erlenmeyer de 250-mL se introduc 50 ml lapte si se incalzeste pe baie de apa la 40 0 C sub agitare.

Cand laptele atinge temperatura dorita, se scoate din baie si se adauga sub agitare 1.5 ml acid acetic glacial sub agitare. Se observa formarea precipitatului. Se lasa incă 15 minute agitând ocazional, apoi se filtreaza printr-o panza de tifon. Se indeparteaza apa din precipitat presand cu ajutorul unei baghete. Precipitatul format se transfera intr-un pahar uscat, iar filtratul se utilizeaza mai departe pentru izolarea lactozei. Peste precipitat se adauga 15 ml etanol. Se agita bine 10 minute, maruntind precipitatul cat mai bine, apoi se lasa sa se decanteze si se filtreaza. Precipitatul se scoate pe o hartie de filtru amplasata intr-o placuta Petri si se lasa la uscat circa 15 minute, maruntind din cand in cand cu ajutorul unei spatule. Se cantareste produsul obtinut si se calculeaza procentul de cazeina din lapte cu formula:

cazeina

B. Izolarea lactozei Filtratul obtinut in prima faza se amesteca cu 2.5g Na 2 CO 3 si se incalzeşte pe baie de apa la fierbere timp de 10 minute, cand are loc precipitarea celorlalte proteine (lactalbumine si lactoglobuline). Solutia se filtreaza fierbinte pe un filtru cutat, apoi se raceste si se utilizeaza pentru identificarea lactozei.

C. Analiza chimica a cazeinei Se prepara o solutie de cazeina prin introducerea a 0.2g din cazeina separata in 25 ml apa se agita pana la dizolvare completa.

1. Testul biuretului

Este unul din cele mai importante teste pentru proteine. Cand o proteina reactioneaza cu sulfatul de cupru(II) testul pozitiv este dat de formarea unui complex de cupru care are culoarea violet.

de formarea unui complex de cupru care are culoarea violet. Testul este pozitiv pentru orice proteina

Testul este pozitiv pentru orice proteina ce contine doua sau mai multe din urmatoarele grupe:

ce contine doua sau mai multe din urmatoarele grupe: Mod de lucru Intr-o eprubeta se introduc

Mod de lucru

Intr-o eprubeta se introduc 2 ml solutie de caseina, se adauga 5 picaturi de solutie NaOH 10% si 2 picaturi de solutie 5% CuSO 4 . Se agita bine si se noteaza rezultatul.

2. Testul cu ninhidrina

Aminoacizii si proteinele care au o grupa amino libera reactioneaza cu ninhidrina dand un complex albastru-

violet:

Mod de lucru Intr-o eprubeta se introduc 2 ml suspensie de caseina, se adauga 5
Mod de lucru Intr-o eprubeta se introduc 2 ml suspensie de caseina, se adauga 5

Mod de lucru Intr-o eprubeta se introduc 2 ml suspensie de caseina, se adauga 5 picaturi de solutie de ninhidrina si se incalzeste la fierbere cu atentie timp de 5 min. Se agita bine si se noteaza rezultatul.

Obs.

2. Ninhidrina reactioneaza si cu proteinele din piele, dand compusi colorati, indeparteaza greu. Feriti contactul pielii cu solutia de ninhidrina.

1. Solutia de ninhidrina contine etanol. Atentie la incalzire.

care se

3. Testul xantoproteic Este o reactie caracteristica proteinelor care contin aminoacizi cu inel benzenic. Acidul azotic concentrat reactioneaza cu inelul benzenic conducand la nitroderivati de culoare galbena.

benzenic conducand la nitroderivati de culoare galbena. Intr-o eprubeta se introduc 2 ml suspensie de caseina,

Intr-o eprubeta se introduc 2 ml suspensie de caseina, se adauga 10 picaturi de acid azotic concentrat si se incalzeste pe baie de apa cu atentie timp de 5 min. Se agita bine si se noteaza rezultatul.

D. Analiza chimica a lactozei

1 Testul cu reactiv Benedict Glucidele reducătoare sunt detectate cu ajutorul reactivului Benedict care conţine ioni de Cu 2+ (albastru) si care in urma unui proces redox datorat grupei aldehidice trec in ioni de Cu + care precipita sub forma de Cu 2 O (rosu). Lactoza, fiind formata dintr-o molecula de glucoza si una de galactoza unite prin legătură 1,4-β-glicozidică are hidroxilul anomeric liber si poate da test pozitiv cu reactivul Benedict. Mod de lucru Intr-o eprubeta se introduc 3 ml solutie de lactoza separata anterior. Se adauga apoi 3 picaturi de reactiv Benedict, se agita bine si se introduce intr-o baie de apa la fierbere unde se mentine 2 minute. Se scoate si se noteaza culoarea observata.

2.2. Testul cu reactiv Barfoed Reactivul Barfoed (solutie de acetat de Cu in acid acetic) contine ioni de Cu 2+ in mediu acid. Conditiile de oxidare sunt mai blande si numai monozaharidele reducatoare dau test pozitiv in timp ce dizaharidele reducatoare nu dau acest test.

Mod de lucru Intr-o eprubeta se introduc 3 ml solutie de lactoza separata anterior. Se adauga apoi cate 5picaturi de reactiv Barfoed, se agita bine si se introduce intr-o baie de apa adusa la fierbere unde se mentine 2 minute (masurate din momentul in care apa incepe din nou sa fiarba). Se scoate si se noteaza culoarea observata.

Se completeaza tabelul:

Volum lapte (ml)

   

Masa cazeina separata (g)

   

Procent cazeina in lapte(%)

   

Cantitate de cazeina intr-un litru de lapte (g/l)

   

Teste chimice de identificare

Culoare observata

Observatii

Cazeina

Testul biuretului

   

Testul cu ninhidrina

   

Test xantoproteic

   

Lactoza

Reactia cu reactiv Benedict

   

Reactia cu reactiv Barfoed

   

Intrebari

1. Cazeina are un punctul izoelectric la pH 4.6. Ce tip de sarcini (pozitive sau negative) vor fi majoritare in

structura cazeinei in lapte?

2. Daca se adauga o cantitate mai mare de acid acetic se va obtine o cantitate mai mare de cazeina sau

nu? Explicati raspunsul dat.

3. In locul acidului acetic poate fi utilizat si alt acid? Dati exemple de produse comune care pot fi utilizate

pentru precipitarea cazeinei.

4. Un procent destul de mare din populatia globului (aprox. 5%) prezinta intoleranta la lactoza. Care este

cauza intolerantei la lactoza?