CURS 8

Enzime cu importan n industria alimentar

Oxidoreductazele
Numeroase oxidoreductaze intervin n procesele metabolice, att anaerobe ct i aerobe: glicoliza, fermentaii, ciclul acizilor tricarboxilici, catena de respiraie celular etc., care se desfoar n diversele materii prime alimentare i n procesele fermentative de obinere a unor produse alimentare.

Oxidoreductazele catalizeaz reaciile de oxidoreducere prin diferite mecanisme:

Transfer de hidrogen (transhidrogenaze, dehidrogenaze); Transfer de electroni (transelectronaze); Combinarea direct a unui substrat cu oxigenul molecular (oxidaze).

Activitatea catalitic a acestor enzime este exercitat prin

intermediul unor coenzime, care se comport ca acceptori intermediari ntre substratul donor i cel acceptor, care pot fi:
Nicotin-adenindinucleotidice NAD, NADP+; Nucleotide flavinice :
flavinmononucleotidul FMN sau flavinadenindinucleotidul FAD.

Oxidoreductaze FAD- dependente (flavinenzime sau dehidogenaze aerobe)

Au drept coenzime FAD sau FMN, derivai ai riboflavinei, vitamina B2. Unele flavinenzime conin n molecula lor i ioni metalici (ca, de exemplu, Fe), care le confer uneori i funcia de transportori electroni.

Denumite i flavinenzime sau dehidrogenaze aerobe, au ca reprezentant glucozoxidaza obinut din Aspergillus niger i Penicillium vitale. Aplicaii. Glucozoxidaza se utilizeaz n reacia de oxidare a glucozei la acid gluconic, n tehnologia de obinere a albuului de ou (praf). In acest produs nu trebuie s existe glucoza liber, care ar participa, cu aminoacizii liberi la procesul de mbrunare Maillard.

Oxidoreductaze NAD - dependente (dehidogenaze anaerobe)

Catalizeaz procesele reversibile de oxidoreducere caracterizate prin transfer de hidrogen de pe un substrat donor pe altul acceptor i au un caracter anaerob, deoarece acceptorul de hidrogen este altul dect oxigenul: dehidrogenaze, transhidrogenaze i dehidraze. Intervin n numeroase procese catabolice oxidative ale alcoolilor, aldehidelor, aminoacizilor. Catalizeaz mai ales procese anabolice reductive. Ele sunt in diverse organe i esuturi animale i vegetale, precum i n diferite microorganisme.

Oxidoreductaze NAD+ sau NADP+ dependente

Cei mai importani reprezentani i aplicaiile acestora sunt prezentai n cele ce urmeaz:
Alcooldehidrogenaza catalizeaz transformarea alcoolului etilic n acetaldehid (care apoi este transformat cu ajutorul acetaldehiddehidrogenazei n acid acetic). Reacie important n fenomenul de fermentaie acetic, realizat de bacteriile acetice n biotehnologia obinerii oetului de vin (Acetaldehiddehidrogenaza catalizeaz oxidarea aldehidei acetice n acid acetic, n procesul de oetire). Lactatdehidrogenaza catalizeaz (n condiii anaerobe) reducerea acidului piruvic cu formare de acid lactic. Acidul lactic reprezint etapa final a fermentaiei lactice.

Oxidoreductaze: Oxidaze
Oxidazele catalizeaz reaciile diferitelor substraturi cu oxigenul molecular sau cu peroxizii, fiind caracterizate prin transfer de hidrogen de pe un donator pe un acceptor care este oxigenul molecular. Ca produs de reacie se formeaz H2O2 sau H2O. Oxidazele, n funcie de mecanismul de aciune, se clasific: -oxigenaze (monooxigenaze i dioxigenaze), -oxidaze transportoare de electroni (citocromoxidaza, cupruoxidazele etc), -hidroxiperoxidaze (catalaze i peroxidaze). Lipoxigenaza (carotenoxidaz), catalizeaz oxidarea acizilor grai polinesaturai cu ajutorul O2. Sunt oxidate i gliceridele i metilesterii acizilor grai menionai formndu-se peroxizii respectivi. Se gsete n soia, mazre, fasole, arahide, cartofi, ridichi. Temperaturile sczute nu inhib activitatea enzimei, care este responsabil de producerea mirosurilor nedorite din produsele vegetale. Lipoxigenaza din soia se utilizeaz la albirea fainii de gru, prin distrugerea carotenilor.

Oxidoreductaze: Oxidaze
Peroxidazele

catalizeaz reaciile de oxidoreducere n prezena peroxizilor (de hidrogen sau alt peroxid organic).

Peroxidazele sunt larg distribuite n microorganisme (bacterii, drojdii), n plante (napi, gulii, cartofi, smochine) i diferite alte legume i fructe, n esuturi i lichide biologice animale ca, de exemplu, ficat, lapte, saliv, n leucocite etc. Dintre peroxidaze, cea mai bine studiat i caracterizat este peroxidaza din hrean. Proprieti asemntoare s-au gsit i n cazul altor peroxidaze ca, de exemplu, peroxidaza din ficat, lactoperoxidaza din lapte etc. Datorit termostabilitii lor, determinarea activitii peroxidazice din diferite legume i fructe este folosit ca un indice al eficienei tratamentelor termice aplicate n procesele de sterilizare.
Determinarea activitii lactoperoxidazei este folosit la urmrirea eficienei

pasteurizrii n industria laptelui.

Diferitele peroxidaze intervin n degradarea fructelor i legumelor, fiind

implicate n modificarea mirosului i gustului (mai ales la mazre, fasole etc.) n procesele de mbrunare enzimatic.

Oxidoreductaze: Oxidaze
Catalaz reprezint o peroxidaza special care oxideaz

o molecul de H2O2 la oxigen, cu reducerea simultan a celei de a doua molecule la H2O.

catalaza

2H2O2

2H20+l/202

Surse comerciale de catalaz sunt ficatul de bovine, Aspergillus niger, Micrococcus lysodeikticus (enzima este eliberat prin liza peretelui bacterian). Aplicaii: catalaz este utilizat la descompunerea apei oxigenate reziduale, cnd este folosit pentru sterilizarea la rece a laptelui la ferm sau dac laptele este utilizat la fabricarea brnzeturilor.

Evidenierea enzimelor bacteriene

Testul catalazei - evidenierea catalazei
catalaza descompune apa oxigenat n ap i oxigen oxigenul eliberat se evideniaz prin formarea bulelor de gaz metoda: cultura de cercetat se suspend pe o lam ntr-o pic. de H2O2
Pe o lama de microscop se depune 1-2 picaturi de H2O2 , peste picatura de reactiv se adauga coloniile testate.

Se urmrete: producerea de catalaz de ctre bacterii (staphylococi, streptococi). Interpretare: test pozitiv - eliberare de oxigen (efervescen) n prezena apei oxigenate test negativ - lipsa efervescenei

stnga - bacterii catalazo-negative dreapta - bacterii catalazo-pozitive

bacterii catalazo-pozitive

HIDROLAZELE
Aceste enzime scindeaz hidrolitic substraturile, acionnd asupra legturilor C-O, C-N, C-S, C-C etc. Principalele hidrolaze de interes pentru biotehnologiile alimentare sunt:
Lipazele, esterazele i fosfolipazele;

Amilazele;
Celulazele i hemicelulazele Enzimele pectolitice

Peptidhidrolazele

HIDROLAZELE - Lipazele, esterazele i fosfolipazele

Lipazele, esterazele i fosfolipazele (Enzimele lipolitice) sunt importante n metabolismul i degradarea lipidelor.
Lipazele sunt utilizate n industria alimentar, n diferite etape tehnologice, cum ar fi:
Hidroliza controlat a lipidelor din unele alimente (brnzeturi, salamuri

crude), n faza de finisare (maturare), cnd acizii grai rezultai pot participa la aroma produsului; Unele preparate enzimatice se utilizeaz la maturarea brnzeturilor: Lipaza gastric; Lipaza pancreatic; Esteraze pregastrice; Esteraze obinute din unele mucegaiuri: Penicillium caseicolum, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Mucor miehei; Esteraze bacteriene produse de Pseudomonas fluorescens i Pseudomonas fragilis.

Hidrolaze - Lipazele, esterazele i fosfolipazele

Mecanisme de aciune: Lipazele acioneaz asupra trigliceridelor, avnd afinitate pentru acizii grai cu caten lung; Esterazele acioneaz fa de gliceridele ce conin acizi grai cu caten scurt; Fosfolipazele (lecitinazele) sunt de mai multe tipuri, n funcie de legtura asupra creia acioneaz din cadrul moleculei de fosfolipide. Fosfolipazele
sunt activate de Ca2+ i de srurile care menin lipidele n stare de emulsie.

Degradarea necontrolat a lipidelor din unele alimente cu coninut ridicat n grsimi, conduce la acumularea de acizi grai liberi, ceea ce determin creterea aciditii produsului i apariia gustului de rnced. Pentru a diminua lipoliza necontrolat, se recomand:
reducerea coninutului de ap liber a materiei prime, reducerea timpului de conservare, asigurarea unei temperaturi sczute pe parcursul depozitrii materiei prime i a

produselor.

Hidrolaze: enzime oligozidazice

Importante pentru industria alimentar sunt glucozidaza, -D-galactozidaza, -D-galactozidaza i -Dfructofuranozidaza. -Glucozidaza denumit i emulsin - scindeaz legtura -glucozidic din -glucozii rspndii n plante cum ar fi amigdalina, prunazina, naringina, dar i din celobioz i geniobioz. Aceast enzim este produs i de unele microorganisme: Alcaligenes faecalis, Botryodiplodia theobromae, Aspergillus niger, Saccharomyces lactis etc. Aplicaii: este utilizat pentru ndeprtarea gustului amar al sucului de grapefruit.

Hidrolaze: enzime oligozidazice

-Galactozidaza este elaborat de Bacillus stearothermophilus, Penicillium

duponti, Absidia griseola, Mortierella vinaceae, Aspergillus awamori. mecanism de aciune: Substratul natural al acestei enzime este rafinoza (descompune rafinoza n galactoz i zaharoz). Aplicaii: este utilizat n industria zahrului i anume pentru extragerea zahrului din melas, respectiv pentru hidroliza rafinozei din melas, n zaharoz i galactoz. -Galactozidaza cunoscut i sub numele de lactaz hidrolizeaz lactoza in glucoz i galactoz. Este gsit n unele plante, microorganisme i n mucoasa intestinal a mamiferelor. Este obinut din tulpini de mucegaiuri (Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus foetidis), din drojdii (Kluyveromyces fragilis, Kluyveromices lactis, Candida pseudotropicalis, T orulopsis lactis) i bacterii (Lactobacillus bulgaricus, Streptcoccus thermophillis, Escherichia coli). Aplicaii: se utilizeaz ca preparate enzimatice n industria laptelui, n special la obinerea laptelui i a produselor lactate delactozate, destinate copiilor cu intoleran la lactoza; laptele tratat cu lactaz este mai dulce i pentru obinerea unor buturi lactate aromate nu mai necesit s se adauge zahr.

Hidrolaze: amilazele
Amilazele descompun amidonul, care este alctuit din amiloz i amilopectin. Dup tipul de legturi hidrolizate, amilazele se clasific astfel: Enzime care hidrolizeaz legturile glucozidice -1,4 ( - amilaza i amilaza); Enzime care hidrolizeaz legturile glucozidice -1,6 (pullulanaza i izoamilaza); -amilazele pot fi de origine animal (amilaza produs de glanda salivar i pancreas), de origine vegetal (cereale ncolite n special mal) cu importan n industria berii, spirtului i panificaiei i de origine microbian (bacterii, mucegaiuri i mai puin drojdii), cele de origine bacterian fiind mai stabile la cldur dect cele de origine fungic. Surse importante de -amilaz sunt orzul, grul, secara, cartofii dulci i soia. Recent s-a dovedit c este produs i de unele microorganisme (Bacillus, Streptomyces), avnd pH-ul optim la 5-6 i temperatura optim la 60 C.

Hidrolaze: celulaze
celulozei de provenien vegetal, pn la glucoz care, la rndul ei, este folosit ca surs de carbon pentru procese de biosintez (de exemplu, acizi organici); producia de alcool etilic prin fermentaie; producerea de biomas cu ajutorul microorganismelor. Aplicatii: se utilizeaz i n industria sucurilor de fructe mpreun cu hemicelulazele i enzimele pectolitice, precum i n industria berii, mpreun cu hemicelulazele, pentru ndeprtarea celulozei.

Celulazele sunt folosite pentru hidroliza

Hidrolaze: enzime pectolitice

Enzimele din aceast grup hidrolizeaz substanele pectice (acioneaz asupra substanelor pectice) din unele produse vegetale, n special din mere i citrice. Substanele pectice au caracter gelifiant i sunt reprezentate de polimeri ai acidului galacturonic. Aplicatii: Aceste enzime sunt utilizate n industria sucurilor de fructe i legume i la obinerea mustului de struguri (optimizarea gradului de extracie, limpezire etc) sunt utilizate pentru ameliorarea extraciei sucului celular din fructe i legume (prin degradarea pereilor celulari), pentru macerarea fructelor i legumelor n vederea obinerii de nectaruri (prin degradarea substanelor pectice ale lamelelor mijlocii care asigur legtura dintre celule, fr a se distruge pereii celulelor parenchimatoase) i pentru limpezirea (clarificarea) diferitelor categorii de sucuri.

Hidrolaze: peptidhidrolazele
Aceste hidrolaze (enzime proteolitice) scindeaz legturile peptidice din proteine, oligopeptide, avnd ca rezultat obinerea de peptide cu mas molecular mai mic i aminoacizi. Peptidhidrolazele pot fi de provenien: vegetal, animal, microbian.
Se subdivid n endo- i exo-peptidhidrolaze. - Endo-peptidhidrolazele, denumite i proteinaze hidrolizeaz legturile peptidice din interiorul catenelor polipeptidice ale proteidelor i proteinelor cu mas molecular mare, producnd catene polipeptidice de mas molecular mai mic, iar exo-peptidhidrolazele, peptidazele sau exopeptidazele catalizeaz desfacerea hidrolitic a legaturilor peptidice de la extremitile catenelor polipeptidice sau oligopeptidice, conducnd, n general, la eliberarea de aminoacizi.

Hidrolaze: peptidhidrolaze vegetale

Peptidhidrolazele de origine vegetal sunt proteinazele alcaline (tiolice), utilizate n special n industria crnii, la procesul de frgezire. Ex: bromelina (obinut din sucul de ananas), papaina (din latexul fructelor Caryca Papaia, cu puin nainte de coacerea acestora) i ficina (din latexul fructului de smochin). Peptidhidrolazele de origine animal sunt: chimozina i pepsina cu aciune coagulant, tripsina cu aciune proteolitic. Chimozina - cheagul sau labfermentul este obinut din stomacul glandular de rumegtoare (viel, miel, ied); Unele microorganisme sintetizeaz proteinaze asemntoare chimozinei: Mucor pusillus, Endothia parasitica, Aspergillus oryzae, Irpex lactis. In legtur cu chimozina menionm urmtoarele:

Hidrolaze: de origine animala

chimozina, pepsina i tripsina, crora li se adaug chimotripsina,

elastaza i carboxipeptidazele, aminopeptidazele i dipeptidazele, produse de diferite glande digestive. Cu excepia ultimelor dou tipuri de exo-peptidaze, celelalte peptidhidrolaze sunt produse de glandele digestive sub form de proenzime (preenzime sau zimogene) inactive, care devin active numai n urma scindrii hidrolitice a unor poriuni din structura lor, ce blocheaz activitatea lor enzimatic. Conversia proenzimelor n enzime active se realizeaz pe cale autocatalitic, care conduc la enzima activ i fragmente polipeptidice inactive enzimatic.

Hidrolaze: de origine animala

Chimozina - este elaborat sub form de prochimozin (forma inactiv), care se transform n chimozina la pH 2,0 i pe cale autocatalitic la pH 5,0. - are pH-ul optim de aciune de aproximativ 5 i este inactivat n 15 minute, la 50C; - are aciune coagulant asupra laptelui i proteolitic asemntoare pepsinei i este utilizat la prepararea brnzeturilor; - diferite laboratoare au clonat gena care codific sinteza prochimozinei bovine, la E. coli. Enzim sintetizat de bacterie are proprieti identice cu cea natural. La investigaii prin imunodifuzie n gel de agar cele dou enzime au fost identice, ns testul ELISA a evideniat unele mici deosebiri. Ulterior gena a fost clonat i la Saccharomyces cerevisiae (Stroh W.H., 1998).

Hidrolaze: de origine animala

Pepsina este o endo-peptidaz produs sub form de

pepsinogen de glandele stomacale ale mamiferelor inclusiv ale omului i care se gsete i n sucul gastric al psrilor, reptilelor i petilor. Se transform n pepsin activ la pH<5, n prezena ionilor de H+ sau autocatalitic (n prezena pepsinei formate anterior). Pepsina se caracterizeaz prin urmtoarele: - are aciune proteolitic, prin scindarea hidrolitic a legturilor peptidice, acionnd de preferin la nivelul legturilor peptidice mai ales la nivelul aminoacizilor aromatici (triptofan, tirozin, fenilalanin) i dicarboxilici (acizii aspartic i glutamic); - are pH-ul optim de actiune 1,5 2,5. Pepsina este folosit la precipitarea cazeinei, obinerea de peptone, n unele ri pentru limpezirea berii la rece, ca adjuvant digestiv i este inclus n reeta de preparare a unor buturi tonice.

Hidrolaze: de origine animala

Tripsina este tot o endopeptidaz, care desface hidrolitic legturile peptidice n interiorul catenelor polipeptidice, de preferin cele constituite ntre gruparea carboxil a unui aminoacid diaminic (arginina, lizina) i gruparea aminic a altui rest de aminoacid. Este produs de pancreas sub form de tripsinogen, forma inactiv, care se transform n tripsin activ n intestinul subire sub aciunea enterochinazei (o enzim intestinal) sau pe cale autocatalitic (n prezena tripsinei formate anterior).

Hidrolaze: de origine animala

Catepsinele sunt peptidhidrolaze localizate intracelular,

la nivelul lizozomilor, n esutul muscular, ficat, splin, rinichi, pulmoni etc. Sunt mai multe tipuri de catepsine (A, B, C, D, E) i acioneaz hidrolitic asupra proteinelor tisulare n procesele autolitice.

Hidrolaze: de origine microbiana

Peptidhidrolazele de origine microbian sunt sintetizate de mai multe microorganisme, ns sunt utilizate in Industria alimentar numai tulpinile nepatogene i netoxigene, aparinnd speciilor: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Streptomyces sp., Rhizopus sp., Mucor miehei, Mucor pusillus etc. Proteinazele microbiene sunt asemntoare celor vegetale sau animale. Dintre aceste amintim: subtilizina, metaloproteinazele microbiene, proteinazele acide microbiene etc.

Izomeraze
Reprezint enzime care catalizeaz rearanjrile intramoleculare, n structurile asupra crora acioneaz. Exemplu: glucozizomeraza, care determin conversia D-glucozei n D-fructoz i este folosit n industria amidonului, pentru obinerea siropului de glucoza cu coninut ridicat de fructoz. Pentru producerea industrial de glucozizomeraza se utilizeaz diferite tulpini microbiene de Streptomyces olivaceus, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces rubiginosus, Bacillus coagulans etc.
In aceast clas de enzime mai sunt grupate racemazele i epimerazele, cis-trans izomerazele, oxidoreductazele intramoleculare, transferazele intramoleculare, liazele intramoleculare etc., care intervin n diferitele procese ale metabolismului glucidelor, lipidelor i proteidelor din organismele vegetale i animale.