UNIVERSITATEA DE TIINE AGRONOMICE I MEDICIN VETERINAR

Facultatea de Biotehnologii
Specializarea Biotehnologii Industriale

Muramidaza

Coordonator,

Student:

Asist. univ. dr.VASILICA SIMION

Grupa

BUCURETI
-2015-

CUPRINS
Introducere pag 3
Capitolul I Prezentarea enzimei .......... pag 5
1.1 Codul si reactia catalizata .....pag 5
1.2 Caracteristici generale.............................................................................................. pag 5
1.3 Structura .......................................................... pag 7
1.4.Substratul..................................................................................................................pag11
Capitolul II Metode de determinare a activitatii muramidazei ......................pag 15
Capitolul III Utilizari .... pag 19
Concluzii....................................................................................................................... .pag 20
Bibliografie.............pag 21

Introducere

Enzimele sunt utilizate in practica de mii de ani, inainte ca natura si rolul lor in reactii sa fie
intelese. Un exemplu in acest sens este obtinerea branzeturilor cu ajutorul cheagului. Utilizarea acestui
procedeu este atat de veche incat data descoperirii lui a fost uitata. In Orient preparatele enzimatice
brute, obtinute din fungi ce se formau pe suprafata orezului alimentar, erau folosite de multe sute de ani
in conservarea, condimentarea si modificarea de consistenta a diferitelor produse alimentare.
2

Enzimele au fost denumite prima data cu termenul de fermenti,in 1897, cand Buchner, prin
distrugerea peretilor celulelor de drojdie obtine un mojarat care catalizeaza fermentatia alcoolica si a
demonstrat pentru prima oara ca enzimele pot functiona independent de celule. In prezent se cunosc
aproximativ 3200 de enzime diferite care s-au obtinut in stare pura, sau sub forma de preparate cu
diferite grade de puritat eaproximativ 1000-1500.
Enzimele sunt prezente in toate organismele vii si se gasesc intoate tipurile de celule animale, in
fluidele corporale (sange, limfa, lichidcefalorahidian, lichid intestinal), in unele secretii specifice pentru
diferite organe (stomac, pancreas, rinichi), la plante si in toate virusurile si microorganismele care
populeaza diferite zone ale Pamantului. La plantele si la animalele superioare, enzimele se gasesc in
toate celulele vii ale acestora, insa distributia lor variaza dupa natura tesutului din care fac parte
celulele.
Exista mai multe tipuri de enzime cum ar fi: enzime de fermentatie, enzime amilolitice, enzime
celulozolitice, enzime proteolitice, enzime pectinolitice si enzime lipolitice.
Prin actiunea lor catalitica, enzimele fac posibila, in conditii compatibile cu viata,realizarea unei
intregi serii de reactii chimice, care in vitro nu se pot realiza decat in conditii foarte dure, improprii
vietii celulare. Astfel, hidroliza proteinelor pe cale chimica se realizeaza la 37 C numai in mediu
puternic acid si intr-un interval de timp foarte lung( 3luni); in organism in schimb, aceasta degradare
are loc foarte rapid si in mediu slab acid. Pentru a realiza in vitro tot asa de repede aceasta
hidroliza, este necesara o temperatura de 120-140 C si o mare aciditate, deci conditii de
incompatibilitate cu viataorganismelor. In mod similar, arderea glucozei in organismele vii, cu
producerea apei,bioxidului de carbon si a energiei, se realizeaza prin intermediul enzimelor, in conditii
specifice vietii celulare. In absenta enzimelor, aceste transformari necesita temperaruri de180-200 C.
Ca

urmare,

rolul

enzimelor

este

fundamental

in

procesele

vietii.In lipsa enzimelor,

majoritatea covarsitoare a reactiilor chimice din organism nus-ar produce, si deci nu ar putea exista
procese metabolice si nici fenomene de viata.Din punct de vedere chimic, enzimele sunt proteine sau
proteide

cu

rol

functionalfoarte important, de natura coloidala, din care cauza ele au insusirile substantelor proteice,
fiind astfel influentate de conditiile de mediu. Ele sunt produse numai de organismele vii si isi pot
manifesta activitatea enzimatica atat in interiorul, cat si in afara organismului. Substanta asupra careia
actioneaza enzima se numeste substrat.
3

Bogate in enzime sunt semintele in stare de germinatie, plantute, frunze, fructe etc. in
general,plantele tinere au un continut mai ridicat de enzime decat plantele batrane. Puterea catalitica a
enzimelor din organismele in crestere este mai mare decat a celor batrane.
Ca biocatalizatori, enzimele se caracterizeaza prin urmatoarele proprietati generale: actioneaza in
cantitati extrem de mici, dar manifesta o activitate extrem de intensa; nu se consuma si nu se
transforma in reactiile catalizate; orienteaza si maresc viteza reatiilor biochimice, determinand scaderea
energiei

de

activitate

moleculelor

desubstrat asupra carora

actioneaza; determina

reactii

extrem de rapide; se disting printr-o specificitate de actiune; asigura coordonarea, reglarea si controlul
proceselor biochimice la care participa.

CAPITOLUL I
1.1. Codul enzimei : lizozim EC 3.2.1.17
Reactie: Hidroliza legaturilor 1-4 dintre acidul N-acetilmuramic si N-acetil-D-glucozamina,
componente ale peptidoglicanului si intre N-acetil-D-glucozamina , componenta a chitodextrinelor
Alte denumiri: muramidaza, globulina G, mucopeptid glucohidrolaza, globulina G1, N,Odiacetilmuramidaza,lizozim

g,

L-7001,

1,4-N-acetilmuramidaza,

mucopeptid

N-

acetilmuramilhidrolaza, PR1-lizozim

Denumirea sistematica: peptidoglican N- acetilmuramilhidrolaza1

1.2. Caracteristici generale

Hidrolazele sunt enzime care catalizeaz reacia de scindare a moleculelor cu fixarea componentelor
apei la produsele rezultate, dupa reacia general:
R-R' + HOH R-H + R' OH
Din aceast clas fac parte enzimele care hidrolizeaz proteinele pan la aminoacizi, polizaharidele
pan la monzaharide i lipidele pan la acizi grai i glicerol. Reaciile catalizate de hidrolaze se produc
cu modificri energetice mici, cu degajare de energie liber mic, deci ele nu constituie o surs
energetic important pentru organism. Hidrolazele au totui un rol deosebit in metabolismul
substanelor aduse cu alimentaia deoarece ele descompun moleculele mari care intr in compoziia
alimentelor, in molecule uor de asimilat. In general reaciile de hidroliz enzimatic sunt reversibile,
iar principalele legturi chimice care pot fi scindate sunt : legatura ester, legatura glicozidic, legatura
peptidic.
Clasa hidrolaze (E.C. 3.x.x.x) conine un numr mare de diferite enzime: acetilcolinesteraze (E.C.
3.1.1.7), amidaze (E.C. 3.5.1.x), amilaze (E.C. 3.2.x.y), carboxilesteraze (E.C. 3.1.1.1), celulaze (E.C.
3.2.1.4), esteraze (E.C. 3.1.x.x), lipaze (E.C. 3.1.1.3), serin-proteaze (E.C. 3.4.16 + 3.4.21) etc2.
Lizozimul a fost descoperit de Alexander Fleming, n 1921, n timp ce savantul ncerca s demonstreze
c propriul mucus nazal are capacitatea de a inhiba creterea unei bacterii n cultur. El a realizat c
acest fapt se datora unei proteine prezente n mucus, care determina liza celulei bacteriene. i astfel a
numit proteina, lizozim. ntr-un studiu ulterior, mpreun cu colaboratorul su, V.D. Allison, au detectat
lizozim n serul sangvin uman, saliv, lapte i alte lichide biologice.
n ciuda activitii sale antimicrobiene, lizozimul s-a dovedit a fi ineficient mpotriva bolilor cauzate de
bacterii. Ineficiena lizozimului asupra bacteriilor patogene a fost interpretat de Fleming ca fiind de
1

http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/17.html

2 Reagent Chemicals ACS Specications, American Chemical Society,Washington DC, 8th Edn,
1993,Pag 95

fapt eficiena mpotriva unor anumite bacterii care, n absena lizozimului ar fi patogene, ns prezen a
lui le contracareaz aciunea, ele fiind astfel considerate nepatogene. Acest lucru a stimulat interesul lui
Fleming asupra agenilor antimicrobieni, ceea ce l-a condus la descoperirea penicilinei n 1928, pentru
care a primit Premiul Nobel n 1945. n 1966, David Chilton Phillips, utiliznd cromatografia cu raze
X, a determinat structura lizozimului, prima descifrare a unei enzime. n urma muncii sale, Phillips a
reuit s explice mecanismul activitii catalitice a lizozimului.3
Caracteristici fizico-chimice

Greutate molecular: 14,388 kDa (Jolls, 1969)

Compoziie: 129 aminoacizi aranjai ntr-o secvena liniar pentru a forma un singur lan
polipeptidic

pH-ul optim: 9,2 (Davies i col., 1969)

Coeficientul de extincie: E281,5 = 26,4 (Aune i Tanford,1969)

Punctul izoelectric: pI = 11,0 (Alderton i col., 1945) 4

Inhibitori: enzima este inhibat de suprafaa activ a reactivilor cum ar fi dodecil-sulfatul,

alcooli i acizii grai (Smith i Stoker, 1949). Derivaii imidazolului i ai indolului sunt
inhibitori ai formrii complexelor schimb-transfer (Shinitzky i col. 1966; Swan 1972).

Activatori : EDTA (White and White 1997) 5

1.3. STRUCTURA MURAMIDAZEI

3 Flanagan M., Role of Electrostatic Interactions in the Structure and Function of Myoglobin,
Lysozyme and Hemoglobin, Indiana University,1983

4 http://ro.wikipedia.org/wiki/Lizozim

5 http://www.worthington-biochem.com/ly/default.html
6

Lizozimul din albusul oului de gaina este un monomer cu 129 de aminoacizi.Aceasta a fost prima
enzima a carei structura tridimensionala a fost determinata , de catre David Philips si colegii in 1965.In
structura lui exista patru legaturi bisulfidice stabilizatoare si o fanta in care se gaseste situsul activ.6

Timp de mai mult de cincii decenii de studiere a lizozimului au dezvaluit structura detaliata si
activitatea enzimei si o poveste interesanta despre cum a progresat biochimia Substratul lizozimului
este peptidoglicanul, un carbohidrat ce se gaseste in majoritatea peretilor celulari.

6 Takehiko Y., Hatta.H., Mujo.K., Hen Eggs, their basic and applied science, CRC Press LLC,1997

Structura primar a lizozimului este un polipeptid care conine 129 aminoacizi aranjai ntr-o secven
liniar. Cele opt resturi de cistein particip la formarea a patru legturi disulfurice dispuse la diferite
distane ale lanului. Acei aminoacizi care fac parte din situsul aparent de legare al substratului sunt
mascai.

Structura secundar a lizozimului

Structura secundar

Lizozimul are 5 regiuni helicale (3 sunt helix standard, n timp ce dou sunt intermediari ntre 3-10
helix i helix), 5 regiuni de foi pliate, la ntmplare i turns.
Structura teriar
8

n condiii fiziologice, lizozimul se mpacheteaz ntr-o structur compact, globular, dup principiul:
partea hidrofob n interior iar partea hidrofil la exterior, cu o despictur lung pe suprafa a proteinei.
Aceast crptur este situsul activ implicat n legarea de carbohidratul bacterian (NAM/NAG) i n
cele din urm n scindarea acestuia.
Lizozimul cliveaza legatura glicozidica C-O ( 14) dintre cele doua resturi glucidice din molecula,
acidul N-acetilmuramic ( Mur2Ac) si N-acetilglucozamina (GlcNAc), numite de obicei NAM si NAG,
in literatura de specialitate-enziologie ( fig 6-24b).Sase resturi alternante de Mur2Ac si GlcNAc in
legatura peptidoglicanului se unesc in situsul activ, in locursurile notate de la A la F.Modelul de legare
a aratat ca lantul lateral lactil al Mur2Ac nu poate fi primit in locusurile C si E restrictionand legarea
Mur2Ac in situsurile B, D si F.Doar una dintre legaturile glicozidice este clivata, cea dintre un rest de
Mur2Ac din situsul D si un rest din GlcNAc in locusul E.Aminoacizii catalitici cheie din situsul activ
sunt Glu 35 si Asp 52 ( fig 6-25a).Reactia este una de substitutie nucleofilica cu o grupare -OH din
mollecula de apa ce inlocuieste GlcNAc la C-1 al Mur2Ac.
Avand structurile situsurilor active identificate si detaliate ale enzimei, calea spre a intelege
mecanismul reactiei parea sa fie deschisa in anii 1960.Totusi, dovezile evidente pentru elucidarea
mecanismului au aparut de abia dupa 4 decenii.Exista doua mecanisme chimice plauzibile ce ar putea
genera produsul clivarii legaturii glicozidice.Philips si colegii au propus un mecanism disociativ ( de
tip SN1) ( fig 6-25a) in care GlcNAc disociaza initial in pasul nr. 1 pentru a pierde un cation glicozil
( carbocation) ca intermediar.In acest mecanism GlcNAc este protonat prin cataliz acida de catre
Glu 35 , localizata intr-un buzunar hidrofilic ce ii ofera gruparii carboxil o pKa neobisnuit de
ridicata.arboxicationul este stabilizat prin rezonanta implicand inelul de oxigen adiacent, cat si prin
interactiunea electrostatica cu incarcatura negativa a Asp alaturat.In pasul nr. 2 apa ataca la C-1 al
Mur2Ac pentru a rezulta produsul final.Mecanismul alternativ (fig 6-25a, drepta) implica doua
dislocuiri directe succesive.1.Asp 52 ataca C-1 al Mur2Ac pentru a disloca GlcNAc.Ca si in
mecanismul anterior, Glu 35 acioneaza ca un acid general si protoneaza GlcNAc.In pasul 2 apa
rectioneaza cu C-1 al Mur2Ac pentru a scoate Asp 52 si a obtine produsul final.7

7 Y. Taniguchi,H.E. Stanley,H. Ludwig, Biological Systems under Extreme Conditions: Structure and
Function, Springer-Verlag New York Inc.,1979

Mecanismul descris de Philips SN1 bazat pe considerente structurale si completat cu o serie de studii
depre legarea cu sbstraturi artificiale, a fost general acceptat pentru mai mult de trei decenii.Totusi,
unele controverse au persistat si testele au continuat.Metoda stiintifica uneori promoveaza incet o idee
si uneori un experiment relevant este greu de conceput.Unele dintre argumentele timpurii ale teoriei lui
Philips au fost sugestive dar nu suficeint de convingatoare.De exemplu, timpul de injumatatire al
cationului glicozil era destul de lung, estimat la aproximativ 10

-12

secunde, mai lung decat vibratia

moleculara dar nu suficeint de lung pentru difuziunea necesara moleculelor.Mai mult, lizozimul face
parte din familia de enzime numita glicozidaze de retinere/fixare , care catalizeaza reactii in care
produsul are aceeasi configuratie anomerica ca si substratul si despre care se cunoaste ca au
internediari rectivi covalenti asa cum este prezentat in calea alternativa ( S N2) .Prin urmare,
mecanismul Philips era in contradictie cu descoperirile experimentale legate de enzime asemanatoare.
Un experiment convingator a scimbat in mod decisiv parerea despre calea S N2, efectuat de Stephen
Withers si colaboratorii in 2001.Folosind o enzima mutanta ( inlocuid restul din pozita 35 de Glu cu
Gln) si substraturi artificiale, care combinate au incetinit viteza de reactie a etapelor chieie, au reusit sa
stabilizeze intermedairul covalent derutant.Aceasta le-a permis sa observe intermediarul direct, folosind
spectrometria both mass si cristalografia cu raze x
Este acum mecanismul de actiune al lizozimului ? Nu. O caracteristica esentiala a cercetarii stiintifice a
fost enuntata de Albert Einstein Nu exista suficiente experimente care sa dovedeasca ca am dreptate ;
dar un singur experiment poate sa dovedeasca ca m-am inselat .In cazul mecanismului lizozimului un
argument puternic ( si unii il sustin) este acela ca substraturile artificiale, cu substitutia flurinei la C-1 si
C-2 ce au fost folosite pentru a stabiliza intermediarul covalent ar fi putut altera reactia prin
mecanismul alternativ. Fluorina extrem de electronegativa ar fi putut destabiliza un ion oxicarbon deja
electron-deficient din cationul glicozil ceea ce s-ar putea intampla in calea S N1.Totusi calea SN2 este
acum in concordanta cu marea majoritate a datelor.8

8 http://www.rasfoiesc.com/sanatate/medicina/Lizozimul31.php

10

1.4.PEPTIDOGLICANUL CA SUBSTRAT AL LIZOZIMULUI

Componenta celulara obligatorie care inconjoara membrana citoplasmatica, peretele celular este o
structura rigida, specifica bacteriilor. El este format dintr-un strat bazal sau peptidoglican, asemanator
la toate bacteriile si un strat al structurilor superficiale, foarte diferentiat, in functie de care bacteriile

11

manifesta caractere tinctoriale diferite: bacterii gram - pozitive, gram - negative si acidoalcoolorezistente.
Peptidoglicanul sau mureina este structura chimica responsabila de rigiditatea peretelui celular si care
asigura forma si rezistenta mecanica a bacteriei. Prezent la toate bacteriile, el consta dintr-un schelet,
format din molecule lungi paralele polizaharidice de N-acetil-glucozamina si acid N-acetil-muramic.
Moleculele de acid N-acetil-muramic din lanturile vecine sunt legate intre ele prin punti polipeptidice,
transversale.9

Figura 4 - Structura peptidoglicanului

La bacteriile gram - pozitive, peptidoglicanul are o grosime de 15-30 nm si contine pana la 200 de
lanturi paralele de mureina.
Stratul structurilor speciale este redus si alcatuit din polimeri hidrosolubili care sunt acizii theicoici. Ei
reprezinta antigenele de suprafata ale bacteriilor gram-pozitive.

9 Mine Y., Egg Bioscience and Biotechnology, John Wiley&Sons,2008

12

Peretele celular al bacteriilor gram-pozitive este sensibil la actiunea lizozimului care rupe legaturile
dintre acidul N-acetil muramic si N-acetilglucozamina.
La bacteriile gram-negative, peptidoglicanul are o grosime de 4-5nm. Stratul superficial este insa
mult mai complex decat la bacteriile gram - pozitive fiind alcatuit dintr-o membrana externa,
lipoproteine si lipopolizaharidul de perete.
Membrana externa este formata dintr-un strat dublu fosfolipoproteic ce cuprinde o cantitate foarte mare
de molecule proteice. Membrana externa se leaga de protoplast prin intermediul unei lipoproteine din
membrana externa.
Deasupra membranei externe a bacililor gram-negativi se afla lipopolizaharidul de perete (LPZ)
sau endotoxina bacililor gram-negativi. Aceasta este alcatuita din:
lipidul A care are o structura particulara, fiind format din unitati dizaharidice de glucozamina,
legate de beta-hidroxiacizi grasi cu 10-16 atomi de carbon fixati direct de membrana externa,
miezul sau "core", numit si antigen R, comun tuturor bacteriilor gram - negative,
unitati monozaharidice repetitive (15-40) care sunt specifice de specie si tip si
constituie antigenul O al bacteriilor gram-negative.
LPZ este o toxina termolabila, care se elibereaza in mediul inconjurator de catre bacteriile gramnegative numai dupa liza lor si foarte reactiva in organismul gazda. Astfel, lipidul A produce febra,
activeaza mecanismele apararii antiinfectioase si in exces produce socul endotoxic cu evolutie grava,
chiar fatala.
Spatiul periplasmic. Sistemul structural dublu al peretelui celular la bacteriile gram-negative creeaza un
compartiment ce se intinde de la membrana celulara pana la membrana externa, numit spatiu
periplasmic. El contine peptidoglicanul si un gel care favorizeaza nutritia bacteriei prin continutul in
enzime degradative ca, de pilda, fosfataze, nucleaze, proteaze etc. Tot aici sunt prezente enzimele de
inactivare ale unor antibiotice cum sunt beta-lactamazele si cefalosporinazele.
Bacteriile acido-alcoolorezistente de interes medical sunt bacilul tuberculos si bacilul leprei. Peretele
celular se aseamana cu cel al bacteriilor gram-pozitive, dar structurile speciale contin acid micolic si o
ceara, ce confera acestor bacterii caractere tinctoriale deosebite si rezistenta crescuta la factorii de
mediu. Ele se coloreaza la cald prin tehnica Ziehl-Neelsen.
Functiile peretelui celular:
13

asigura forma, rezistenta mecanica si osmotica a bacteriei;

regleaza traficul molecular de perete in ambele sensuri
este sediul antigenelor de suprafata
este sediul unor factori de patogenitate;
are rol in diviziunea bacteriana si in procesul de sporulare.10

Capitolul II
2. Metode de determinare a activitatii muramidazei
Sensibilitatea deosebita a bacteriilor Micrococcus si Micrococcus luteus (MOORE P.F.
-1986) fata de actiunea lizozimului a stat la baza utilizarii acestora pentru aprecierea capacitatii litice a
enzimei prin metode difuzimetrica sau turbidimetrice (spectrofotometrice).
2.1. Metoda difuzimetrica

10 http://www.scritub.com/biologie/STRUCTURA-CELULEI-BACTERIENE71549.php

14

Aceasta metoda utilizata pentru dozarea activitatii litice a probei (ser, saliva, lactoser, etc)
difuzia simpla in mediul solid agar sau agaroza in care se inglobeaza tulpina Test de micrococ. Placile
cu probele biologice studiate se pot mentine la temperatura camerei 20 de ore sau se incubeaza la
termostat, la 37C, acelasi interval de timp. Lizozimul continut in proba, determinand aparitia unei zone
circulare de liza al carei diametru este direct proportional cu concentratia. n cazul fiecarei serii de
testari, se lucreaza in paralel o proba cu concentratia de lizozim, de obicei albusul de ou cu 100 ug/ml
sau 10000 unitati/mg proteina.
Valorile obtinute in mm pot fi convertite in unitati litice prin calcul sau in ug/ml folosind
curba de integrare alcatuita, (utilizand albusul de ou in dilutii succesive, fiind decelabile chiar 2*10
ug/ml ) (NITTA K. The calcium).11
2.2. Metoda spectrofotometrica
Aplicata de numerosi cercetatori, metoda se bazeaza pe reducerea densitatii optice a
suspensiei de micrococ sub actiunea enzimei litice din proba de examinat.
Pornind de la o suspensie bacteriana cu densitatea optica (DO) stabilita spectrofotometric si o
solutie de lizozim cu concentratia cunoscuta, se bazeaza ca si in cazul tehnicii descrise anterior pe un
grafic etalon pentru interpolarea valorilor (DO) obtinute experimental si exprimarea lizozimului in
ug/ml. Timpul de expunere al suspensiei la actiunea probei poate fi variabil. Pentru pasari s-a stabilit
DO initiala optim de 0,200. iar ritmul de contact 30 minute la temperatura camerei de 20-30C
(ZARNEA G. -1983 Tratat de Mic.). Sensibilitatea metodei este mare, deceland cantitati de 0,02
ug/ml. (BORST GHA -1986, PONDA N.E. -1987).Cu toate ca dupa unii autori (NITTA K. The
calcium) dozarea difuzimetrica este superioara celei spectrofotometrice, erorile volumetrice fiind
eliminate, rezultatele obtinute prin cele doua tehnici se coreleaza. Acest fapt indica variatia individuala
a activitatii specifice, a diferitelor tipuri enzimatice (NITTA K. The calcium).
Rezultatele pot fi influentate in cazul ambelor metode chiar daca se foloseste aceeasi solutie
standard de lizozim, de prezenta in lichidele biologice testate a unor amine sau poliamine (lizina,
arginina, putresceina, cadaverina, spermina, spermadina). Aceasta determina obtinerea unor valori
11 Analele stiintice. Serie noua. Sectiunea I C: Chimie, Volumele 15-16, 1969

15

crescute in urma difuziei in placa, in timp ce prin spectrofotometrie se inregistreaza o inhibare

accentuata a lizei, motiv pentru care interventia posibila a acestor factori nu trebuie omisa.12
PRINCIPIUL METODEI
Micrococcus lysodeikticus (celule intacte)

Lizozim Micrococcus lysodeikticus (lizat celular)

O unitate internationala de activitate muramidazica este definita ca fiind cantitatea de enzima care
catalizeaza formarea unui mol /minut in conditii standard de analiza (temperatura 250C, pH=6.24)
folosind ca substrat o suspensie de Micrococcus lysodeikticus in 2.6 ml amestec de reactie.
CONDIII : T = 25 C , pH = 6.24
REACTIVI :
Fosfat de potasiu, monobazic
Solutie 1M hidroxid de potasiu, KOH
Micrococcus lysodeikticus, ATCC No. 4698, liofilizat

Instructiuni de preparare
Folositi apa distilata (18 Mxcm rezistivitate la 25 C) pentru prepararea reactivilor.
Tamponul ( tampon fosfat de potasiu 66mM, temperatura 250C, pH=6.24 )- pregatiti o solutie de 8.98
mg/ml apa distilata cu fosfat de potasiu, monobazic.Ajustati pH-ul la 6.2 la 25 0C folosind solutie 1M
hidroxid de potasiu, KOH.
Suspensia substratului ( suspensie de celule Micrococcus lysodeikticus)- pregatiti 0.01% (w/v) solutie
in tampon folosind Micrococcus lysodeikticus. Absorbanta la 450 nm trebuie sa fie cuprinsa intre 0,60,7 fata de martor.
Solutia de enzima(lizozimul) - Chiar inainte de utilizare pregatiti o solutie de lizozim 200-400
unitati/ml in tampon la temperatura scazuta (28 C).
12 http://www.creeaza.com/familie/medicina/LIZOZIMUL-ENZIMA-ACTIVA-IcircN164.php
16

PROCEDURA
1.Pipetati reactivii in eprubete:
Reactiv
Suspensie

substrat

Martor (ml)

Test (ml)

2.50

2.50

2. Echilibrati cuvele la 25C.Monitorizati A450 pana devine constant, folosind un spectofotometru

termostatat.Apoi adaugati:

Martor

Test

(ml)

(ml)

Tampon

0.10

Enzima

0.10

Reactiv

3.Obtineti curba etalon.

Rezultate
Calcule
(A450/min Test A450/min Martor) (df)

Unitati/ml
enzima

(0.001) (0.1)

17

unde:
df = factorul de dilutie
0.001 = A450/ unitatea definita
0.1 = Volumul (in mililitri) al enzimei13

CAPITOLUL III
UTILIZARI
Inca din anii `70 , lizozimul este renumit pentru activitatea sa bactericida si pentru ca nu este
deloc toxic, singur sau in combinatie cu alte componenete sinergice, si este utilizat ca un excelent
conservant impotiva alterarii provocate de microorganisme asupra hranei.
Lizozimul a fost adaugat in formula pentru copii (ajuta digestia) si in tratamentele
gastrointestinale pentru varstnici.Este utilizat atat in ingrijirea pielii, pentru a vindeca si preveni acnea,
cat si in oftalmologie si stomatologie. In Japonia, lizozimul este foarte apreciat in retetele medicale si
in medicamentele OTC, pentru tratarea durerilor de cap, racelilor si infectiilor in gat.Astazi, ramane
unul dintre cei mai de incredere conservanti pentru fructe si legume,tofu,fructe de mare si carne, vinuri
13 http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/enzymatic-assayof-lysozyme.html
18

si sake, pentru a inhiba natural cresterea celor mai multe organisme daunatoare, mareste termenul de
valabilitate si creste siguranta produselor.Poate inlocui chimicalele intrutotul.Este folosit in vinuri
pentru reducerea continutului de sulfiti, si mai nou, in berea nepasteurizata.14
Forma dimerica a lizozimului a fost folosita in bolile bacteriene si virale ale animalelor,avand rol
terapeutic si antiinflamator.
Alte aplicatii sunt:

Pregatirea acizilor nucleici (Taylor and Utter 1974)

Purificarea proteinelor din corpii de incluziune (Reischl 2004)

Pregatirea plasmidelor (pentru a sparge peretele celular si membranele) (Zhu 2006)

Hidroliza chitinei (Hayashi et al. 1969)

Hidroliza peretului celular bacterian (Shockman et al. 1996)15

CONCLUZII
Lizozimul este un factor fundamental al imunitatii naturale, facand parte dintre factorii umorali.
Lizozimul a fost descoperit de Alexander Fleming, n 1921, iar in 1966, David Chilton Phillips,
utiliznd cromatografia cu raze X, determina structura lizozimului, prima descifrare a unei
enzime. n urma muncii sale, Phillips a reuit s explice mecanismul activit ii catalitice a
lizozimului.

14 http://www.bioseutica.com/products/lysozyme

15 http://ro.wikipedia.org/wiki/Lizozim

19

 Lizozimul este larg raspandit, gasindu-se in organismul animalelor, plantelor si in bacterii. Se

gaseste in sange, lacrimi, saliva, mucus, chisti ovarieni secretati din aparatul respirator, digestiv si
urogenital
Lizozimul (muramidaza) are structura primara a unui lant polipeptidic, cationic, prezenta
legaturilor disulfidice determinand organizarea secundara si tertiara, clarificate in amanuntime
doar in unele cazuri (lizozimul din albusul de ou, lizozimul uman) .
Actioneaza asupra legaturilor 1-4 dintre acidul N-acetilmuramic si N-acetil-D-glucozamina,
componente

ale

peptidoglicanului

si

intre

N-acetil-D-glucozamina

componenta

chitodextrinelor.
Activitatea enzimatica a muramidazei se poate deter mina prin metode difuzimetrice sau
turbidimetrice (spectrofotometrice).
Cele mai importante aplicatii sunt: tratament pentru tratarea durerilor de cap, racelilor si infectiilor
in gat, tratarea acneei,conservant, rol in reducerea cantitatii de sulfiti din vinuri si in spargerea
peretilor celulari.

Bibliografie
1. Reagent Chemicals ACS Specications, American Chemical Society,Washington DC, 8th Edn,
1993
2. Analele stiintifice. Serie noua. Sectiunea I C: Chimie, Volumele 15-16, 1969
3. Takehiko Y., Hatta.H., Mujo.K., Hen Eggs, their basic and applied science, CRC Press
LLC,1997
4. Flanagan M., Role of Electrostatic Interactions in the Structure and Function of Myoglobin,
Lysozyme and Hemoglobin, Indiana University,1983
20

5. Mine Y., Egg Bioscience and Biotechnology, John Wiley&Sons,2008

6. Y. Taniguchi,H.E. Stanley,H. Ludwig, Biological Systems under Extreme Conditions: Structure
and Function, Springer-Verlag New York Inc.,1979
7. http://ro.wikipedia.org/wiki/Lizozim
8. http://www.worthington-biochem.com/ly/default.html
9. http://www.rasfoiesc.com/sanatate/medicina/Lizozimul31.php
10. http://www.scritub.com/biologie/STRUCTURA-CELULEI-BACTERIENE71549.php
11. http://www.creeaza.com/familie/medicina/LIZOZIMUL-ENZIMA-ACTIVA-IcircN164.php
12. http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/17.html
13. http://www.bioseutica.com/products/lysozyme

21