CATALAZA

Peroxid de hidrogen:peroxid de hidrogen oxidoreductaza

(EC 1.11.1.6)

Sursa de obtinere: celule aerobe

Localizare : peroxizomi
Functie: protectia celulelor de efectele toxice ale peroxidului de hidrogen prin
catalizarea reactiei de descompunere a acestuia in oxigen molecular si apa, prevenind
formarea radicalilor liberi
Structura cuaternara: tetramer alcatuit din 4 holosubunitati
Masa moleculara: 220.000 – 350.000 kD
Grupare prostetica: 1 molecula hem / subunitate
Cofactor: suplimentar NADH/NADP in cazul unor specii

Reactie totala: 2 H2O 2 ------> 2 H2O +O2

H2O2 + Fe(III)-E --> H2O +O=Fe(IV)-E (1)

Mecanism propus:
H2O2 + O=Fe(IV)-E --> H2O + Fe(III)-E (2)
 CATALAZA (EC 1.11.1.6),

Escherichia coli Proteus mirabilis

Biosinteza catalaza de origine microbiana
Sursa de obtinere : celule de Micrococcus lysodeikticus
Bacterie Gram +
Sensibilitate la actiunea lizozimului (muramidaza-EC 3.2.1.17) asupra peptido-
glucanului din peretele celular ce actioneaza asupra legaturilor -1,4 dintre

acidul muramic si resturile glucozamidice

Parametrii biosintezei
volum de lucru
raport inoculare
temp de lucru
debit de aer in perioada de lag si in urmatoarele ore
agitare
pH mediu initial
antispumant
durata procesului
Procedee de conditionare a albusului de ou
Deshidratare
Liofilizare
in absenta de conservanti/stabilizatori
in prezenta de zaharoza 10%
in prezenta zaharoza 10% si gelatina 20%
Atomizare
 SCHEMA DE LUCRU
Mod de lucru

Mediu nutritiv agarizat

Colonii izolate din cultură
conservata prin liofilizare

Selectie naturala in
functie de capacitatea de
biosinteza a catalazei

Mediu minimal de geloza Mediu de cultura sterilizat

Preinocul pe tuburi Inocul: cultura agitata Biosinteza in cultura

cu geloza inclinata pe mediu la 300 C, 24 h submersa, la 300 C, 18-20h
24 h 370 C

Purificare parţială Celule Separare prin

centrifugare
 Celule Micrococcus lysodeikticus
Tampon fosfat de
Temp 370 C Conditionare albus de ou
sodiu 0,1M pH 7,0
in prezenta de
NaCl 0,5-2% Liza enzimatica Lizozim

Temp 250 C
Alcool etilic Precipitare fractionata cu alcool etilic 0-50% v/v
90% v/v

Centrifugare Proteine balast

Debriuri celulare
Supernatant
Temp 50 C
Alcool etilic Precipitare fractionata cu alcool etilic 50-80% v/v
90% v/v
Supernatant 80%
Centrifugare
alcool etilic

Precipitat Recuperare
alcool etilic
Apa distilata Solubilizare

Omogenizare prin agitare magnetica

Centrifugare Particule insolubile

Solutie de catalaza

Filtrare sterila

Glicerina Conditionare

Produs finit: CATALAZA

Aspect: lichid de culoare bruna, fara rezidii de decantare
Proprietati fizico-chimice: complex solubil in apa
Activitate catalazica: min 50.000 UI
Proprietati microbiologice : nu se admite prezenta germenilor
patogeni
 Metoda colorimetrica de dozarea activitatii catalazei
Principiul metodei: bicromatul de potasiu in mediu acid este redus de peroxidul de hidrogen la
acetat cromic, care poate fi colorimetrat la 570 nm.
Catalaza
2H2O2 ------> 2H2O +O2

+K2Cr2O7(mediu acid)----->acetat cromic

Determinarea activitatii enzimatice
Proba Martor Blanc
Preparat enzimatic (ml) 0,1 - -
Reactivi si solutii:
1.Reactiv bicromat-acid acetic Apa distilata - - 0,1
glacial Tampon (ml) 0,4 0,4 0,4
2. Tampon fosfat de potasiu
0,01 M pH 7 Solutie apa oxigenata 0,5 0,5 0,5
3. Solutie H2O2 0,08 M (solutie 0,16M (ml)
stoc pentru construirea curbei Timp de reactie 30 secunde
etalon)
Reactiv bicromat (ml) 2,0 2,0 2,0
Preparat enzimatic (ml) - 0,1 -
Incubare 10 min pe baia de apa la fierbere
Racire probe la temperatura camerei
Colorimetrare la 570 nm
Calculare rezultate pe baza curbei de etalonare si
exprimarea activitatii in moli H 2O2 consumat/ml preparat
enzimatic/min