Gel-cromatografia

(sitare moleculară )
Metoda se bazează pe diferenţele de mărime ale
proteinelor:
•perlele de răşină prezintă mici pori, în care pot difuza
moleculele de proteină ce sunt suficient de mici.
•cele cu dimensiuni mai mari vor rămâne în faza mobilă
şi vor fi eluate din coloană
Proteina mare Proteina mica

Traseu scurt Traseu lung

Structura Sephadex
 Cromatografia de schimb ionic

Enzimele posedă o anumită sarcină electrică în soluţie, în funcţie de :

structura lor
pH izoelectric.
valoarea de pH,
•În soluţii cu valori de pH:
• sub valoarea punctului izoelectric, enzimele vor avea încărcare pozitivă şi se vor
lega de schimbători cationici,
•în soluţii cu pH mai mare de punctul izoelectric vor fi încărcate negativ şi se vor
lega de schimbători anionici.

•Valoarea de pH trebuie să fie astfel aleasă încât să menţină încărcarea electrică

opusă a proteinei/enzimei şi a schimbătorului de ioni.

•Tăria ionică trebuie să fie suficientă pentru a asigura solubilitatea proteinei, fără ca
sarcinile să competiţioneze cu proteina pentru situsurile schimbătorului de ioni.
Sarcina neta de la suprafata proteinei
+
Legare la schimbatori anionici

4 5 6 7 8 9 pH

Legare la schimbatori
cationici
_
Domeniu de stabilitate de pH
 - + + -
+ + + +
+ +
+ + + -
+ + -+ + +
- -+
+
Matrice schimbatoare Proteina cu sarcina
de ioni cu negativa Proteina legata de matrice
sarcini pozitive (anionica) la valoare de pH selectata
Schimbătorii de ioni sunt, în general polimeri insolubili în apă, ce conţin grupări
cationice sau anionice.
- schimbătorii cationici conţin grupări anionice: SO3-, -OPO3-, COO-;
- schimbătorii anionici conţin grupări cationice: grupări terţiare şi
cuaternare de amoniu, cu formula generală –NHR2+ şi +NR3+.

Principalele tipuri de schimbători de ioni

Tip de schimbător Grupare funcţională Contra-ion Denumire

Schimbător cationic carboximetil Na+ CM

slab -O-CH2-COO- (celuloză, sephadex)

Schimbător cationic sulfopropil Na+ SP

puternic -O-CH2- CH2- CH2-SO3- (sephadex)

Schimbător anionic dietilaminoetil Cl- DEAE

slab (celuloză, sephadex)

Schimbător anionic amină cuaternară QAE

puternic (dietil-(2-hidroxipropil) (sephadex)
amino etil)
Pentru un amestec de proteină, care la pH 7,0 au următoarele sarcini electrice:
poteina 1 +4
proteina 2+2
proteina 3 0
proteina 4 -2
proteina 5 -4
Etapele procesului de schimb ionic sunt:
a) se alege faza staţionară (răşina) cu încărcare pozitivă, şi se utilizează un tampon de tărie ionică mică ce conţine grupări
negative
b) – când se adaugă amestecul de proteine, proteinele încărcate negativ (4 şi 5) vor înlocui ionii negativi ai tamponului şi se
vor lega de răşină
c) – proteine încărcate pozitiv şi neutre nu vor interacţiona cu faza staţionară şi vor trece în volumul de lichid V0 prin eluţie;
d) – după legarea proteinelor, se adaugă un tampon (faza mobilă) ce are tărie ionică mare (se foloseşte de obicei NaCl);
e) – ionii negativi din acest tampon mai concentrat vor competiţiona cu proteina pentru sarcinile electrice pozitive ale răşinii;
f) – când tăria ionică este suficient de mare pentru a dislocui proteina, aceasta va fi eliberată, putând fi eluată din coloană;
g) – cu cât sarcina electrică negativă a proteinei este mai mare, cu atât concentraţia ionică a tamponului de eluţie este mai
mare.

- -
++
++
-
-
 1M
Incarcarea coloanei-final Gradient saruri
Spalarea coloanei cu solutie
cu tarie ionica mica

0
Adsorbtia proteinelor

II
III
Gradient saruri Gradient saruri
Incarcarea coloanei Proteine -final
nelegate -initial
-initial
I
 Regenertare
Aplicarea Elutie
probei
Echilibrare
si spalare
Test rapid
Cromatografie de schimb ionic
Elutie prin gradient de tarie ionica (concentratie de saruri)
 Cromatografia de afinitate

Metode de purificare a enzimelor ce au în comun faptul că se stabilesc interacţii mai

mult sau mai puţin specifice între enzimă şi un ligand imobilizat.

Proba Tip de ligand

Enzima Substrat, inhibitor, cofactor
Antigen Anticorp, virus, celula
Lectina Polizaharide, glicoproteine, receptor
de celula
Acid nucleic Secventa complementara de baza,
histone, acizi nucleici, polimeraze,
proteine de legare
Hormoni Receptori, proteine de transport
 Matrice de cromatografie de afinitate
in prezenta proteinei-tinta

A-suport de imobilizare
B- spacer arm
C- ligandul
D-proteina-tinta

Matrice de cromatografie de afinitate cu metal imobilizat

Suport de imobilizare pe care este atasat un agent de

chelare ce leaga coordinativ un ion metalic