Cromatografia pe hartie si in strat subtire

Definitie=este o procedura folosita pentru a separa substantele dintr-un amestec pe baza

mobilitatii diferite a componentelor
Componente:
•Faza stationara: hartia poroasa
•Faza mobila: solventul (apa, alcool, eter, acetona,etc)

Mecanismul de distribuţie este de tip lichid-lichid

 Procedee experimentale

Tratamentul pregătitor
Aplicarea probei
Developarea
tehnica descendentă;
tehnica ascendentă;
tehnica orizontală
Vizualizarea (revelarea)

distanta parcursã de solut (hZ 

Rf 
distanta parcursa de faza mobilã(h m )
 Testarea purităţii proteinei purificate

Electroforeză în gel de poliacrilamidă (PAGE – polyacrylamide gel

electrophoresis)

Determinarea masei moleculare a subunităţilor prin SDS-PAGE sau PAGE-

denaturat: metoda presupune denaturarea proteinei în prezenţa unui
•detergent, SDS (sodium dodecilsulfat)
•reducător tiol (2-mercaptoetanol) care scindează punţile disulfurice
(Cys-S-S-Cys )
 Avantajele enzimelor imobilizate :
Utilizarea enzimelor in mod repetat;
Stoparea reactiei enzimatice se realizeaza prin simpla indepartare
din mediul de reactie;
Enzimele imobilizate prezinta, in general, stabilitate crescuta;
Produsul obtinut prin reactia enzimatica nu este impurificat cu
enzima si are capacitate mica de a da reactii imunologice;
Se poate reduce inhibitia prin produs final ;
Autoliza enzimelor proteolitice imobilizate este mica;
Procesul poate fi realizat in sistem continuu si poate fi usor
controlat.
 Imobilizarea enzimelor implică costuri suplimentare şi poate fi
acceptată din punct de vedere economic numai dacă asigură un avantaj
comparativ cu enzimele solubile.

Cel mai important avantaj conferit de imobilizare constă în

separarea uşoară a enzimei de produsul reacţie catalizate. Acest lucru
previne contaminarea produsului, minimalizând costurile proceselor
down-stream, precum şi potenţialele probleme legate de manipularea
efluentului, cu referire la posibilitatea ca enzima să fie toxică sau să aibă
caracter antigenic.

Totodată, imobilizarea permite realizarea proceselor în mod

continuu, cu considerabile economii din punct de vedere al costului.

Imobilizarea afectează, în multe cazuri, şi stabilitatea şi

activitatea enzimei, dar există posibilitatea ca acestea să fie puţin
alterate sau chiar îmbunătăţite.

Productivitatea unei enzime imobilizate este mărită deoarece

poate fi folosită în prezenţa unor concentraţii mai mari de substrat şi
pentru perioade lungi de timp comparativ cu enzima în stare liberă
Succesul imobilizării enzimelor constă în menţinerea celei mai mari
părţi a activităţii catalitice şi după procesul de imobilizare, ceea ce
presupune reducerea cantităţii de enzima ce este imobilizată într-o
conformaţie inaptă din punct de vedere catalitic.
 Suporturi utilizate pentru imobilizare
Desi este recunoscut faptul ca nu exista un suport
universal valabil, totusi pot fi precizate o serie de
caracteristici pe care trebuie sa le posede orice material
folosit in vederea imobilizarii enzimelor si anume:

Suprafata specifica mare;

Permeabilitate;

Hidrofilie;

Insolubilitate;

Stabilitate termica, chimica si mecanica;

Rigiditate mare;

Rezistenta la atac microbian;

Regenerabilitate.
Metode de imobilizare a enzimelor
 1. Metode de imobilizare prin fixare de suport
Adsorbţia fizică
Cea mai veche metodă de imobilizare este cea a adsorbţiei fizice a
enzimei pe matricea unui polimer, fără a exista legături covalente.

Metoda este extrem de uşor de realizat, adsorbantul şi soluţia de

enzima fiind în contact un timp, după care se separă prin centrifugare sau
filtrare din soluţie preparatul enzimatic imobilizat.

Randamentul de imobilizare este, însă, scăzut.

Adsorbţia se realizează, în principal, prin forţe Van der Waals şi deci

legătura suport insolubil enzimă este relativ slabă.

Din această cauză, se produce desorbţia la modificarea pH-ului

mediului de reacţie, a tăriei ionice sau la simpla ridicare a temperaturii.

 Acest fapt constituie un dezavantaj major, preparatul enzimatic având

o stabilitate redusă, iar produsele reacţiei fiind impurificate cu enzimă.

•Desorbţia permite, încă, regenerarea într-o nouă formă activă.

 Legarea ionică

•Metoda legării ionice este, la fel cu cea a adsorbţiei fizice, printre cele
mai simple şi mai vechi metode de imobilizare a enzimelor

•se bazează pe caracterul polielectrolitic şi amfoter al proteinelor, deci

pe legarea ionică a enzimelor pe suporturi conţinând grupări ionice.

•in practică, apar, însă, atât legături ionice, cât şi legături de tip Van der
Waals, deci adsorbţie fizică.

• Principala diferenţă între cele două metode constă în tăria legăturii

dintre enzimă şi suport: forţa legăturii ce rezultă din interacţia ion-ion este mai
mare decât în cazul adsorbţiei fizice.

•Avantajele metodei constau în faptul că se realizează uşor, în condiţii

blânde, ceea ce nu determină modificări de conformaţie ale centrului catalitic
activ.

• Dezavantajul major constă, în schimb, în faptul că enzima se

desprinde uşor de pe suport în cazul variaţiilor de pH sau la valori mari ale
tăriei ionice ale mediului.
 Legarea covalentă
•Metoda imobilizării prin legături covalente se bazează pe
reacţia chimică dintre grupările reactive ale suportului cu cele ale
enzimei, ducând la legarea ireversibilă a enzimei.
• În cazul acestei metode, matricea insolubilă trebuie să
îndeplinească, în plus, condiţia de a avea o capacitate de adsorbţie
slabă.
•Grupările reactive ale suportului sunt de tipul azidă, diazo,
izotiocianat, triazinil.
•Grupările enzimelor ce iau parte la formarea legăturii chimice
sunt grupările:
Amino (a sau e);
Carboxil (a, b sau g);
Sulfhidril ( din cisteină);
Hidroxil (din serină, treonină);
Imidazol (din histidină);
Fenolice (din fenilalanină, tirozină);
Imino (din triptofan);
Amido (din asparagină, glutamină);
Metiltiol (din metionină);
Guanidil (din arginină).
 2. Metoda reticulării intermoleculare
Imobilizarea enzimelor prin reticularea intermoleculară se
realizează prin intermediul legăturilor chimice, ca şi în cazul metodei de
legare covalente, dar acestea nu se stabilesc între enzimă şi suport, ci
între mai multe molecule de enzimă, cu ajutorul reactivilor bi- şi
multifuncţionali.

Datorită legăturilor încrucişate intermoleculare se realizează

agregate enzimatice reticulate tridimensionale, care sunt complet insolubile
în apă.

Dintre reactivii utilizaţi pentru reticulare pot fi menţionaţi

glutaraldehida, derivaţii izocianat, bis diazobenzidina, N,N – etilen-
bismaleinimida.

Cel mai folosit reactiv multifuncţional este glutaraldehida. Obţinerea

unei matrice insolubilă de enzimă şi glutaraldehidă se realizează fie prin
polimerizarea glutaraldehidei, fie prin precipitarea enzimei.

Efectul net este de mărire a puterii legăturii dintre molecule sau de

scădere a distanţelor dintre moleculele de enzimă. Astfel, s-au obţinut
preparate imobilizate de carboxipeptidază A, subtilizină, papaină şi tripsină.
 3. Metoda entraparii

•se bazează pe includerea enzimei în matricea unui polimer sau într-o

membrană semipermeabilă, care:
- nu permit eliberarea enzimei,
- dar permit difuzia substratului şi a produşilor de reacţie

•enzima nu este legată de suport, ceea ce exclude problemele sterice ce

se întâlnesc în cazul legării legării covalente sau ionice a enzimei de un
polimer (ex blocarea centrului activ al enzimei de o porţiune a matricei
polimerului)
Posibile probleme:
- eliberarea necontrolata a enzimei din matrice ( se poate evita prin
folosirea membranelor cu diferite valori de cutoff pentru masa
moleculara);
- limitari difuzionale ( se evita prin reducerea dimensiunilor
matricei/particulei);
- reducerea activitatii/stabilitatii enzimei prin pierderea controlului
asupra micromediului;
- difuzia este o problema majora mai ales in cazul particulelor de
gel decat in cazul microcapsulelor.
 Gel-entraparea

• presupune includerea enzimei în spaţiile interstiţiale formate de

legăturile covalente ale unui polimer reticulat, insolubil în apă.
•procedeul este utilizabil numai dacă masa moleculară a enzimei este
mult mai mare decât cea a substratului;

Caracteristici:
gradul de reticulare mic : ochiurile reţelei sunt mari, iar enzima poate evada
din gel, fiind antrenată de soluţia de substrat.
gradul de reticulare mare: eliberarea enzimei din matrice este împiedicată,
dar accesul moleculelor de substrat la centrii activi este îngreunat

raportul între agentul de reticulare şi monomer trebuie ales astfel încât să nu

permită evadarea enzimei în mediul de reacţie, dar nici să nu se limiteze
accesibilitatea la centrii activi ai enzimei.
 Entrapare în fibre
(entrapare în microcavităţile fibrelor sintetice )

•se obţine prin dizolvarea unui polimer ce formează fibre (ex. triacetatul
de celuloză) într-un solvent organic nemiscibil cu apa (cloroform, clorură
de metilen, tetraclorură de carbon)
• emulsionarea acestei soluţii cu soluţia apoasă ce conţine enzima.
• emulsia se extrude într-un lichid coagulant (toluen, sau eter de petrol)
unde precipită polimerul

•Avantaj : fibrele astfel obţinute sunt rezistente la acizi şi baze slabe, la

valori mari ale tăriei ionice şi la acţiunea unor solvenţi.

•Limitare : folosirea de substrate cu masă moleculară mică,

solvenţii şi agenţii de precipitare necesari obţinerii fibrelor, pot
determina inactivarea enzimei
Separarea de faze (tehnica coacervării)

-soluţia de enzimă este emulsionată într-o soluţie de polimer în solvent

organic nemiscibil cu apa.
-polimerul este precipitat prin adăugarea unui alt solvent, care este
miscibil cu primul, dar care nu dizolvă polimerul.
-se realizează concentrarea polimerului, concomitent cu formarea
membranei de polimer în jurul picăturii de soluţie de enzimă datorită
solubilităţii mai mici a polimerului la suprafaţa picăturii.

Avantaj : condiţii blânde de reacţie,

Dezavantaj: dificilă îndepărtarea solventului, în multe cazuri acesta
rămânând pe suprafaţa polimerului.

Dintre polimerii utilizaţi pentru coacervare pot fi menţionaţi: nitratul de

celuloză, polistirenul, etil-celuloza, butiro-acetil-celuloza
Polimerizarea interfacială (sinteza unui copolimer insolubil în apă la interfaţa
picăturilor )

-copolimerul se obţine din doi monomeri: un monomer hidrofilic (parţial solubil

în mediu apos şi în cel organic) şi un monomer hidrofobic (solubil în solvenţi
apolari şi insolubil în faza apoasă).
-Soluţia de enzimă se adaugă soluţiei monomerului hidrofilic, care este parţial
solubil în faza apoasă şi în cea organică
-se adaugă monomerul hidrofobic, solubil numai în faza organică
-cei doi monomeri polimerizează la interfaţă, obţinându-se o membrană semi-
permeabilă

Metoda îndepărtării solventului (liquid-drying)

-dispersia soluţiei enzimatice în solventul organic nemiscibil cu apa ce conţine
polimerul ;
-dispersia se realizează cu ajutorul unui surfactant;
-emulsia astfel obţinută este dispersată în mediu apos, care conţine substanţe
coloidale de protecţie (gelatină, polivinilclorură, surfactanţi), formându-se cea
de-a doua emulsie.
-microcapsulele se obţin prin îndepărtarea solventului organic ( ”uscare”).
Caracteristicã a micelelor inverse:
posibilitatea de a corela structura micelelor inverse cu structura membranelor
biologice si în mod special cu cea a particulelor lipidice intramembranare
monomeri micela normala (directa) micela cilindrica

faza hexagonala inversa micela inversa strat bilamelar

FIG.1. Structura diferitelor tipuri de agregate micelare in mediu apa-solvent

 Definirea micelelor inverse

Moleculele amfifile ale surfactantilor (agenti tensioactivi) formeazã în mediu de apã - solvent
organic apolar agregate de formã sfericã sau elipsoidalã, ale cãror dimensiuni sunt comparabile
cu cele ale proteinelor.

Apa poate fi solubilizatã în cavitatea polarã a micelelor inverse formate de surfactanti în mediu
organic apolar, obtinându-se nucleul sau cavitatea apoasã (“water-pool”).

Structura fazei microapoase

•cantitatea de apã puternic legatã reprezintã
4 -10 molecule / moleculã surfactant

•legãturi de hidrogen cu moleculele de apã

deja existente, în faza finalã a solvatãrii
alcãtuindu-se o microfazã independentã
(“apã - liberã”)

•Structura nucleului apos al micelei

poate fi consideratã, de aceea, a fi
neomogenã datoritã existentei unor
structuri de apã cu grade diferite de
legare.