Metode de precipitare

Precipitarea cu sulfat de amoniu Precipitarea izoelectrică

Fenomenul de salting-out = mărirea tăriei ionice a
soluţiei determină o reducere a efectelor de respingere Se bazează pe faptul că proteinele precipită când prezintă
dintre moleculele identice ale unei proteine datorită sarcina electrice neta egala cu zero – ceea ce se întâmplă la
încărcării electrice similare. Totodată se reduc şi forţele pH izoelectric – deoarece reacţiile de respingere dintre
ce menţin stratul de hidratare din jurul moleculei sarcinile electrice de acelaşi fel sunt cele care menţin
proteice
proteinele în soluţie

Precipitarea cu solvenţi Precipitarea la căldură

Solvenţii acţionează prin reducerea constantei Se utilizează, în general, pentru îndepărtarea proteinelor
dielectrice a mediului, ceea ce se traduce prin contaminate şi se bazează pe stabilitatea diferită a
reducerea solubilităţii proteinelor datorită favorizării
proteinelor la temperaturi ridicate
interacţiilor proteină-proteină în locul interacţiilor
proteină-solvent
Proteine dizolvate in apa

Proteine in prezenta de sulfat de amoniu

 Protocol de lucru
 lizatul se supune operatiei de clarificare prin
centrifugare;
vas  supernatantul clarificat se transfera intr-un
lizat vas racit cu gheata si care este prevazut cu un
agitator magnetic;
gheata Se noteaza volumul exact de supernatant;
vas pentru gheata Se introduce vasul ce contine supernatantul
magnet intr-o baie de gheata;
Se cantareste cantitatea de sulfat de amoniu
ce urmeaza a fi adaugata, calculata conform %
de saturatie stabilit si volumului de supernatant;
agitator Se adauga sulfatul de amoniu in stare solida,
in portii mici, sub agitare continua;

Adaugarea unei portii noi din cantitatea cantarita de sulfat de amoniu se face dupa dizolvarea portiei
anterioare;
Dupa adaugarea intregii cantitati de sulfat de amoniu corespunzatoare % de saturatie, agitarea
suspensiei se continua inca o ora, la rece, pana la definitivarea precipitarii;
Se centrifugheaza la 10.000g, timp de 15 min, la 40C ;
Depozitul contine proteine precipitate ce pot fi dizolvate intr-un tampon adecvat in vederea analizei si ,
eventual, purificarii ulterioare;
Pentru a precipita,, si alte proteine din lizat, supernatantul este supus, in continuare, fractionarii,
urmandu-se aceleasi etape,
 Proteine extracelulare Proteine intracelulare

Mediu+celule Mediu+celule

separare
separare

celule
supernatant celule supernatant
dezagregare
concentrare
Omogenizat brut
EXTRACT BRUT clarificare
Extract proteic total
EPT debriuri supernatant
concentrare

EXTRACT BRUT
Extract proteic total
EPT
 Extract proteic brut
Adaugare (NH4)2SO4 solid
saturatie 0-X%

centrifugare

Supernatant saturatie 0-X%

Precipitat I
Adaugare (NH4)2SO4 solid
saturatie X-Y%
centrifugare

Supernatant saturatie X-Y%

Precipitat II
Adaugare (NH4)2SO4 solid
saturatie Y-90%
centrifugare

Precipitat III Supernatant saturatie Y-90%

Experiment 1
Fracţie % activ. enzim. % proteină Factor purificare
saturaţie precipitată precipitată per etapă de fracţionare
(NH4)2SO4
(%)

0-40 4 25 4/25 = 0,2

40-60 62 22 62/22 = 2,8
60-80 32 32 32/32 = 1,0
supernatant 2 21 2/21 = 0,1
80%

Fracţie % activ. enzim. % proteină Factor purificare

Experiment 2 0-45% 6 32 6/32 = 0,2

45-70% 90 38 90/38 = 2,4
supernatant 70% 4 30 4/30 = 0,1

Fracţie % activ. enzim. % proteină Factor purificare

Experiment 3 0-48% 10 35 10/35 = 0,3

48-65% 75 25 75/25 = 3,0
supernatant 65% 15 40 15/40 = 0,4
DIALIZA
 Sisteme apoase bifazice

Exemple :
•agar amestecat cu amidon sau gelatina solubila;
•dextran-polietilen glicol (e.g. 10% PEG 4000/2% dextran T500), unde dextranul formeaza
faza mai hidrofila, cu densitate mai mare (faza din partea inferioara) si PEG reprezinta faza
mai hidrofoba, mai putin densa (faza din partea superioara)
•10% PEG 4000/12.5% tampon fosfat de potasiu

Avantaje:
•Separare rapida a materialului biologic;
•Foarte mica probabilitate de denaturare a materialului biologic;
•Tensiunea interfazica este foarte mica (de aprox.400ori mai mica decat cea dintre apa si un
solvent nemiscibil cu apa) ;
•Suprafata interfaciala mare
•Amestecare eficienta in conditii blande de agitare a sistemului;
•Partitie rapida;
•Polimerii au influenta de stabilizare asupra proteinelor
 Cromatografia pe hartie si in strat subtire

Definitie=este o procedura folosita pentru a separa substantele dintr-un amestec pe baza

mobilitatii diferite a componentelor
Componente:
•Faza stationara: hartia poroasa
•Faza mobila: solventul (apa, alcool, eter, acetona,etc)

Mecanismul de distribuţie este de tip lichid-lichid

 Procedee experimentale

Tratamentul pregătitor
Aplicarea probei
Developarea
tehnica descendentă;
tehnica ascendentă;
tehnica orizontală
Vizualizarea (revelarea)

distanta parcursã de solut (hZ )

Rf =
distanta parcursa de faza mobilã(h m )
 Metode cromatografice
pe coloana

Cromatografie de Cromatografie de afinitate

schimb ionic

Cromatografie de excludere
din gel (gel-cromatografia)
 Cromatografia pe coloana= fractionare sau purificare
Principiul de baza consta in trecerea unui amestec de proteine printr-o coloana de sticla sau
de plastic ce contine o matrice (suport) solida, de obicei
Pregatirea coloanei
1. Se suspenda matricea (rasina, schimbatorul de ioni, suport) in tampon de echilibrare;
2. Se umple coloana de sticla cu tampon de echilibrare, avand robinetul coloanei inchis;
3. Se deschide robinetul, permitand curgerea cu viteza foarte mica a tamponului;
4. Cu ajutorul unei pipete se incarca coloana cu suspensia de rasina;
5. Se permite depunerea libera a rasinii pana la nivelul necesar;
6. Se spala coloana cu 2-3 volume de tampon de echilibrare, inainte de a aplica proba.
Realizarea cromatografiei pe coloana
• Diferitele proteine strabat matricea cu viteze diferite datorate caracteristicilor lor chimice
si felului in care aceste caracteristici determina interactia lor cu matricea
• Atat amestecul de proteine cat si matricea sunt imersate in solvent.
• Proba (amestecul de proteine in solvent) este aplicat la capatul superior al coloanei, iar
solventul permite strabaterea lenta a coloanei umplute cu suport.
• Odata ce proba a patruns in interiorul matricei, solventul continua sa fie adaugat (nu este
permis ca suportul sa fie in stare uscata).
• Solventul este colectat in eprubete separate (fractionare) pe la partea inferioara a coloanei.
• Diferitele componente ale amestecului de proteine parcurg coloana cu viteze diferite in
functie de proprietatile chimice si pot fi astfel fractionate in probe separate.