PURIFICAREA PROTEINELOR

SCOPUL studierii proteinelor

• Intelegerea rolului proteinelor/enzimelor in structura celulara;
• Intelegerea mecanismelor din interiorul celulei si intre celule : reconstituirea cailor
metabolice si de reglare;
• Proteinele in stare pura sunt necesare pentru a studia reactii, cinetica, activitate de reglare;
• Identificarea deviatiilor de la metabolismul normal sau de la procesele de reglare, datorate
proteinelor / enzimele anormale;
•Realizarea unui design al potentialelor medicamente , bazat pe structura 3D a proteinelor ;
• Multe proteine/enzime au ele insele o valoare in calitate de biocatalizatori (proteaze, lipaze,
glucozizomeraza), terapeutice (insulina, interleukina);
•Realizarea reactiilor chimice de interes industrial prin biocataliza .

CARACTERISTICILE PRODUSELOR PROTEICE

Prezenta in concentratii foarte mici in sursele biologice;
Co-prezenta unui numar foarte mare de impuritati, unele dintre ele fiind foarte putin diferite
de produsele in sine;
Sunt termolabile;
Sunt sensibile la conditiile de operare, cum ar fi pH si concentratia de saruri;
Sunt sensibile la actiunea substantelor chimice, cum ar fi surfactantii si solventii
DEFINIREA purificarii
Extractia/separarea unei singure proteine/enzime din structura celulara sau tisulara, ce
contine un amestec complex de proteine si care poate fi compus din mai mult de 1.000 de
proteine diferite si din multe alte biomolecule .

SCOPUL purificarii
Conservarea functiei biologice, care se realizeaza prin mentinerea intacta a structurii 3D a
proteinei, respectiv a retelei de legaturi fizice implicate in stabilitatea conformatiei proteinei, in
conditiile de pH, temperatura, tarie ionica, sensibilitate la O2, forte mecanice, pastrare etc.

OBIECTIVELE purificarii
Reducerea volumului de lucru;
Concentrarea si imbogatirea in proteina tinta;
Indepartarea impuritatilor specifice (ex.toxine in cazul produselor terapeutice);
Prevenirea reactiilor secundare in timpul utilizarii proteinei tinta;
Prevenirea inhibarii biocatalizatorului proteic (“otravirea”);
Marirea stabilitatii proteinei;
Reducerea degradarii proteinelor prin actiunea enzimelor proteolitice;
Respectarea specificatiilor recomandate pentru produsul final
 FACTORI IMPLICATI IN STRATEGII PRE-PURIFICARE
Proprietatile proteinei-tinta
Stabilitate la temperatura
Stabilitate la pH
Prezenta co-factorilor pentru asigurarea
stabilitatii sau exprimarea activitatii
biologice
Sensibilitate la prezenta ionilor metalici
Sensibilitate redox
Necesita prezenta detergentilor
Strategie pre-purificare
Folosirea temperaturilor scazute
Selectia tampoanelor de lucru
Selectia aditivilor, a sarurilor etc
Adaugare de EDTA la tamponul de lucru
Adaugare de agenti reducatori
Alegerea detergentilor
 LOCALIZAREA PROTEINEI TINTA LA NIVELUL CELULEI

CELULA

PERIPLASMATIC

EXTRACELULAR

INTRACELULAR microorganisme
microorganisme

microorganisme
organisme
superioare

DEZAGREGAREA CELULELOR
Principalii factori ce influenţează eliberarea conţinutului celular sunt:

a) tipul de microorganism/organism utilizat: compoziţia peretelui

celular şi grosimea acestuia;
b) localizarea produsului: citoplasmă/organite/periplasmă;
c) tipul de utilaj/ natura fortelor de dezagregare implicate
d) timpul de dezagregare;
e) concentraţia suspensiei celulare;
f) temperatura (în cazul în care nu se asigură răcirea sistemului,
temperatura lizatului poate să crească, provocând inactivarea produsului).

Parametrii

grad de recuperare al proteinei tinta (randament)

puritatea proteinei tinta (factor de purificare)

 DEZAGREGAREA CELULELOR
Principiile dezagregarii celulare se bazeaza pe :
 Proprietatile si structura celulelor si a tesuturilor (ex.PC, membrana celulara, organite celulare,
componente celulare);
 Efectele solutiilor izotonice, a antioxidantilor, inhibitorilor specifici, a detergentilor, a ionilor
specifici, a solventilor organici etc asupra stabilitatii proteinei .

Elemente si criterii de performanta

Element 1: Selectia procedurii/metodei de dezagregare
Criterii de performanta
 Procedura de dezagregare celulara este selectata in functie de tipul de celula sau de tesut,
pentru a permite mentinerea integritatii functionale a componentelor celulare de interes;
 Mediul de extractie/omogenizare este selectat astfel incat sa permita pastrarea integritatii
functionale;
 Procedura este justificata in termeni de structura si proprietati chimice ale componentei
celulare

Element 2: Realizarea procedurii/metodei de dezagregare

Criterii de performanta
 Randamentul de dezagregare se situeaza la nivelul tehnicii folosite;
 Procedura este monitorizata pentru a urmari mentinerea integritatii componentelor ce urmeaza
a fi izolate din omogenatul celular ( se realizeaza prin analize adecvate).
 CELULE de Saccharomyces cerevisiae

Inainte de dezagregare Dupa procedura de dezagregare a

95% din celule
 E.coli inainte de dezagregare E.coli dupa dezagregare

Celule nelizate Celule lizate 75%

Celule lizate 95%

Celule lizate 99%

S.cerevisiae
 Dezagregarea celulelor

1. Metode mecanice de dezagregare: relativ costisitoare

1.1. Moara cu bile :bile metalice sau de sticlă (al căror diametru variază între
0,2-1,0 mm) ; parametrii :viteza de agitare şi încărcarea cu bile a morii

1.2. Omogenizator (presa franceză):presupune folosirea unei pompe de

mare presiune(500 atm) care pompează suspensia celulară printr-un orificiu
.
ajustabil; este util în cazul microorganismelor , cu excepţia fungilor filamentoşi

1.3. Vibratoare ultrasonice –tratarea celulelor microbiene în suspensie

cu ultrasunete (>18 kHz, în domeniul neacustic) determină dezagregarea
celulelor, folosind mişcarea sinusoidală rapidă a probei din lichid ; este folosită
de obicei pentru bacterii şi nu pentru drojdii.

1.4.Mojarare cu materiale abrazive – se foloseste mai ales la nivel de

laborator
 Dezagregarea celulelor

2. Metode nemecanice: sunt metode des utilizate deoarece nu necesită

echipamente speciale
2.1. Şoc termic – metodă foarte ieftină, dar se pune problema stabilităţii
produsului în timpul tratamentului.
2.2. Şoc osmotic – modificarea bruscă a concentraţiei de săruri poate crea
condiţii optime pentru liza celulară (ex. proteine din periplasmă).
2.3. Cicluri de îngheţ-dezgheţ – cristalele de gheaţă care se formează rup
membranele celulare.
2.4. Liza chimică – adiţia de detergenţi şi/sau solvenţi (acetonă, octanol)
conduce la solubilizarea parţială a pereţilor celulari. Cel mai ades sunt utilizaţi
detergenţi neionici (ex. Triton X-100)
2.5. Autoliza – este un proces lent, predispus contaminării microbiene. Este
adecvat în cazul unor drojdii şi al speciilor de Bacillus. Invertaza din drojdie,
folosită industrial pentru obţinerea zahărului invert, este obţinută prin autoliză.
2.6. Dessicarea – poate fi folosită la scară mare pentru obţinerea enzimelor.
Viteza de uscare este factorul de bază în acest caz, metodele realizate cu viteză
mică fiind preferate celor cu viteză mare, cum ar fi liofilizarea.
2.7. Liza enzimatică – se realizează prin adăugare de enzime cu
capacitatea de a produce scindarea pereţilor celulari. Este o metodă foarte
răspândită la nivel de laborator, dar mult mai puţin utilizată la nivel industrial.
 Metode de extractie

Medii de extractie
pH: maxim de activitate, stabilitate maxima, raport intre cei 2 parametrii
solutii tampon : influenteaza capacitatea de solubilizare si activitatea catalitica
prin valoarea pH, taria ionica si prin compozitie
recomandari - taria ionica trebuie sa corespunda unei capacitati de tamponare
suficiente si sa determine extractia optima a enzimei
- domeniul pe care tamponul mentine pH-ul constant sa corespunda
cu cel de stabilitate al enzimei
- componentele tamponului nu trebuie sa manifeste efecte negative
asupra activitatilor enzimatice (ex.tampoanele polianionice de tipul citratului si
fosfatului sunt agenti de chelare ai unor ioni metalici care pot fi esentiali in activitatea
unor enzime)
- concentratia tamponului nu trebuie sa interfere in etapele ulterioare
extractiei (ex. in cazul cromatografiei pe schimbatori de ioni)
Detergenti:solubilizarea proteinelor de membrana prin diminuarea interactiilor
hidrofobe
precautii :concentratie sub concentratie critica micelara
Agenti reducatori : protejarea gruparilor SH din structura contra oxidarii pe
parcursul extractiei;se folosesc: 1,4-ditioeritritol(DTE) si 1,4-ditiotreitol(DTT)
Inhibitori proteolitici:se evita degradare proteolitica ce determina scaderea
randamentului de recuperare si pierderea activitatii enzimatice
 METODA DE EXTRACTIE PRINCIPIUL DE BAZA
Metode blande
Liza celulara Ruperea osmotica a membranei celulare (MC)
Digestia enzimatica Scindarea enzimatica a peretilor celulari (PC)
Omogenizator Potter-Elvehjem Dezintegrarea celulelr in spatiul dintre pistil si peretii
de sticla
Metode moderate
Omogenizator cu cutite (Waring Membranele sunt taiate cu ajutorul unor lame care
blendor) se rotesc
Mojarare in prezenta de nisip, alumina Membranele sunt indepartate prin actiunea abraziva
sau perle de sticla a particulelor
Metode severe
Presare (French press) Suspensia celulara trece printr-un orificii mici la
presiuni foarte mari (forte de rupere)
Decompresie exploziva Celulele sunt echilibrate cu un gaz inert la presiune
foarte mare
Macinare cu bile (bead mill) Vibratiile rapide produse de prezenta perlelor de
sticla
Ultrasonicare Tratarea suspensiiloe celulare cu frecvente sonice
Inghet-dezghet repetat Ruperea legaturilor de hidrogen si a celor hidrofobe
 Alegerea metodei de dezagregare
Criterii de alegere Parametrii
Volumul si/sau marimea probei Eficienta
Reproductibilitate
Numarul de probe ce se Contaminare reciproca a probelor
prelucreaza in acelasi timp Viteza de prelucrare
Modul de curatare al echipamentului
Susceptibilitatea celulelor la Eficienta
dezagregare Costuri echipamente

Eficienta necesara dezagregarii Timp procesare

Reproductibilitate
Stabilitatea moleculelor ce sunt Protectia moleculelor
izolate

Caracteristicile Eficienta purificarii

metodei/metodelor de purificare
ulterioare
 Proces de dezagregare – nivel laborator
Metode enzimatice
Avantaje:
 pot fi folosite in experimente la scara
foarte mica;
 sunt metode simple
 se realizeaza in conditii blande
Dezavantaje:
 nu sunt intotdeauna reproductibile
 potentiale probleme legate de
stabilitatea enzimelor
 sensibilitatea celulelor la actiunea
enzimelor este dependenta de stadiul
de dezvoltare al celulelor
 enzima trebuie indepartata/inactivata
la finalizarea procesului de
dezagregare
 nu este, de obicei, aplicabila la scara
mare fiind costisitoare
Mojararea cu sticla sau nisip
Avantaje:
 Se aplica celulelor usor de dezagregat
 Este ieftina
 Necesita volum mic de proba
 Pot fi procesate convenabil mai multe
probe
Dezavantaje:
 Probleme legate de spumarea si
incalzirea probei in cazul cantitatilor
mai mari de proba
 Capacitate limitata de ridicare la scara
 Variabilitatea randamentului si a
puritatii produsului
Sonicarea Decompresie rapida

Avantaje:
Avantaje:
 Metode blande
 Cost moderat al echipamentului;
 Nu se produce caldura
 Capacitatea de a procesa probe de
 Se minimalizeaza problemele
volum mic (incluzand probe sub 200
legate de potentiala oxidare a
l)
produsilor prin folosirea gazelor
 Pot fi dezagregate celule greu de lizat
inerte
(inclusiv spori)
 Cost moderat
 Eficienta in cazul probelor mici
Dezavantaje:
 Posibilitate de ridicare la scara
 Energia eliberata sub forma de
caldura
Dezavantaje:
 Nivelul ridicat de zgomot
 Accesibile dezagregarii numai
 Randament variabil
celule cu rezistenta redusa
 Generarea de radicali liberi
 Risc de pericol datorat presiunii
ridicate a gazului
 Eficienta limitata in cazul
procesarii la scara mare
 Factori nocivi pentru activitatea enzimatică întâlniţi pe parcursul
dezagregării celulelor.
3.1. Căldura – toate metodele mecanice necesită o mare cantitate de energie, generând
căldură.
3.2. Forfecarea – forţele de forfecare necesare pentru ruperea celulelor pot provoca şi
alterarea structurii enzimelor,.
3.3. Prezenţa proteazelor –poate fi minimalizată prin creşterea vitezei procesului, prin
adăugarea unui exces de substraturi alternative (ex. proteine ieftine), sau de inhibitori în
mediul de extracţie.
3.4 pH – este necesară folosirea tampoanelor.
3.5. Prezenţa unor substanţe chimice – enzimele pot suferi modificări conformaţionale în
prezenţa detergenţilor şi/sau solvenţilor.
3.6. Oxidarea – prezenţa unor agenţi reducători (ex. acid ascorbic, mercaptoetanol,
ditiotreitol) poate fi necesară.
3.7. Spumarea – interfaţa gaz-lichid sub formă de spumă poate determina modificări ale
conformaţiei enzimatice.
3.8. Toxicitatea metalelor grele – ionii metalelor grele (Fe, Cu Ni) pot fi eliberaţi din
echipamentele de omogenizare. Protecţia enzimelor faţă de inactivarea ireversibilă produsă
de aceştia se face prin utilizarea agenţilor de complexare, cum ar fi EDTA.
Lizozim-structura
Celulaza –structura si mecanism de actiune
Omogenizator
 MOARA CU BILE

perle in
cadere
perle in
rostogolire Celule supuse
dezagregarii

Mecanism
Dezagregarea are loc sub actiunea fortelor de forfecare ale
perlelor
in miscare si a impactului rezultat prin ciocnirea acestora.

In timpul dezagregarii se pot elibera cantitati foarte mari de

caldura, care impun folosirea unui agent de racire (ex.azotul
lichid sau glicolul sau manta de racire cu apa).

Aplicatii: drojdii, tesuturi animale si vegetale

Nivel laborator: cateva kg de celule/h

Nivel industrial : sute de kg/h

 MOARA COLOIDALA

Rotor
Celule
dezagregate
Viteza de rotatie : 10.000-50.000 rpm

Mecanismul dezagregarii celulelor : forfecare

puternica si turbulenta

Aplicatii : material tisular

Stator

Suspensie
Modalitate de operare : se aplica o trecere
celulara unica sau treceri multiple
ULTRASONICARE

Generator
ultrasunete

Sonda cu
ultrasunete
Aplicatii: celule bacteriene si fungi
Suspensie
celulara Mecanism: fenomenul de cavitatie
provocat de unde de soc

Frecventa utilizata ; 25 kHz

Timp de operare: 30-60 s pentru celulele

bacteriene si 2-10 min pentru drojdii

Se foloseste complementar metodelor

chimice de dezagregare
 PRESA FRANCEZA

Piston

Suspensie Cilindru
celulara

Jet
Orificiu
Suport de
impact

Aplicatii: nivel laborator pentru proteine intracelulare si ADN bacterian si de

origine vegetala

Mecanism primar: viteza mare de forfecare la trecerea fortata prin orificiu

Mecanism secundar: injectarea sub presiune

Presiunea de operare : 10.000-50.000 psig

 Proteine extracelulare Proteine intracelulare

Mediu+celule Mediu+celule

separare
separare

celule
supernatant celule supernatant
dezagregare
concentrare
Omogenizat brut
EXTRACT BRUT clarificare
Extract proteic total
EPT debriuri supernatant
concentrare

EXTRACT BRUT
Extract proteic total
EPT
 Separarea solid-lichid
necesară în cazul
•separării iniţiale a masei celulare,
•pentru îndepărtarea debriurilor celulare rezultate în urma dezagregării celulelor
şi
•pentru colectarea precipitatelor rezultate în urma purificărilor pe bază de
precipitare.

se realizează

•prin decantare (in cazul celulelor cu dimensiuni mari, ex. celule de drojdii)
•prin filtrare
•cu sisteme apoase bifazice pentru îndepărtarea debriurilor celulare
•prin centrifugare pentru colectarea unui material solid necesar (ex. precipitat).
 Metode de separare/clarificare
Centrifugare
-viteza mica de centrifugare pentru indepartarea debriurilor (resturi celulare,
pereti celulari, perle de sticla etc) 3.000-5.000 xg
-viteza mare de centrifugare pentru a clarifica extractele prin indepartarea
particulelor mai mici 10.000-12.000xg
-viteza foarte mare pentru a izola membrane pana la 60.000xg
Se recomanda folosirea g si nu rpm
Forta centrifugala relativa = 1,12 r (rpm/1.000)2

Filtrare
- indepartarea particulelor mari
- adecvata pentru probe cu volum mic
- se selecteaza marimea porilor filtrului pentru a limita colmatarea

Ultrafiltrare
- indepartarea sarurilor
- concentrarea probelor prin indepartarea apei
- se selecteaza cut off pentru membrane
- limita de separare a moleculelor cu Mr intre 1.000 si 300.000
- proces lent
- colmatarea membranelor
- posibila adsorbtie nespecifica pe suprafata membranei
 Centrifugarea

Separare pe baza dimensiunii particulelor si a diferentelor de densitate dintre faza lichida si

cea solida

Sedimentarea materialului in camp centrifugal poate fi descrisa de ecuatia :

unde

v –viteza de sedimentare, w –viteza angulara,

d –diametrul particulelor, r –raza de rotatie,

rs –denstatea particulelor, h –vascozitatea cinematica,

rl =densitatea solutiei, Fs –factor de corectie pentru interactia particulelor
q –factorul de forma (=1 for spherical particles)
 SEPARARE prin CENTRIFUGARE
TIP CELULE CARACTERISTICI CELULE CARACTERISTICI
CENTRIFUGARE
Celule de marime mica Necesita viteza mare de centrifugare
BACTERII Celule rezistente Provoaca putine daune celulelor
Celule de marime mare Necesita viteza mica de centrifugare
DROJDII Celule rezistente Provoaca putine daune celulelor
FUNGI Formatiuni miceliale Necesita viteza mica de centrifugare
FILAMENTOSI Celule rezistente Retentie mare de apa in miceliu

PROPRIETATILE CENTRIFUGILOR INDUSTRIALE

Forta centrifugala mare Capacitate limitata de prelucrare solide
Tip tubular Concentrare mare Spumare
Usor de curatat Recuperare dificila a materialului depus
Capacitate mare de prelucrare a Nu se descarca solide
suspensiilor cu cantitate mare de solide
Tip
camera Concentrare mare Curatare dificila

Posibilitati de racire Recuperare dificila a solidelor

 Sisteme apoase bifazice

Exemple :
•agar amestecat cu amidon sau gelatina solubila;
•dextran-polietilen glicol (e.g. 10% PEG 4000/2% dextran T500), unde dextranul
formeaza faza mai hidrofila, cu densitate mai mare (faza din partea inferioara) si PEG
reprezinta faza mai hidrofoba, mai putin densa (faza din partea superioara)
•10% PEG 4000/12.5% tampon fosfat de potasiu

Avantaje:
•Separare rapida a materialului biologic;
•Foarte mica probabilitate de denaturare a materialului biologic;
•Tensiunea interfazica este foarte mica (de aprox.400ori mai mica decat cea dintre apa
si un solvent nemiscibil cu apa) ;
•Suprafata interfaciala mare
•Amestecare eficienta in conditii blande de agitare a sistemului;
•Partitie rapida;
•Polimerii au influenta de stabilizare asupra proteinelor
 Filtrarea

separare pe baza dimensiunii particulelor

Eficienta este limitata de:
•forma si compresibilitatea particulelor
•vascozitatea fazei lichide
•presiunea maxima admisa

Capacitatea volumetrica a unui filtru este proportionala

cu presiunea (P) si suprafata filtrului(AF) si
invers proportionala cu grosimea stratului de depozit si
cu vascozitatea

a) filtrare dead-end (b) filtrare cross-flow

 Celule
Suspensie
celulara

Membrana Concentrat
Suspensie celular
celulara

Mediu de cultura fara celule

Filtrare cross-flow

Mediu de cultura
fara celule
Ultrafiltrare

Filtrare dead-end
Concentrare

Liofilizare
Filtrare prin membrane
Precipitare cu sulfat de amoniu