Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Adaugarea unei portii noi din cantitatea cantarita de sulfat de amoniu se face dupa dizolvarea portiei
anterioare;
Dupa adaugarea intregii cantitati de sulfat de amoniu corespunzatoare % de saturatie, agitarea
suspensiei se continua inca o ora, la rece, pana la definitivarea precipitarii;
Se centrifugheaza la 10.000g, timp de 15 min, la 4 0C ;
Depozitul contine proteine precipitate ce pot fi dizolvate intr-un tampon adecvat in vederea analizei si ,
eventual, purificarii ulterioare;
Pentru a precipita,, si alte proteine din lizat, supernatantul este supus, in continuare, fractionarii,
urmandu-se aceleasi etape,
Proteine extracelulare Proteine intracelulare
Mediu+celule Mediu+celule
separare
separare
celule
supernatant celule supernatant
dezagregare
concentrare
Omogenizat brut
EXTRACT BRUT clarificare
Extract proteic total
EPT debriuri supernatant
concentrare
EXTRACT BRUT
Extract proteic total
EPT
Extract proteic brut
Adaugare (NH4)2SO4 solid
saturatie 0-X%
centrifugare
Exemple :
•agar amestecat cu amidon sau gelatina solubila;
•dextran-polietilen glicol (e.g. 10% PEG 4000/2% dextran T500), unde dextranul formeaza
faza mai hidrofila, cu densitate mai mare (faza din partea inferioara) si PEG reprezinta faza
mai hidrofoba, mai putin densa (faza din partea superioara)
•10% PEG 4000/12.5% tampon fosfat de potasiu
Avantaje:
•Separare rapida a materialului biologic;
•Foarte mica probabilitate de denaturare a materialului biologic;
•Tensiunea interfazica este foarte mica (de aprox.400ori mai mica decat cea dintre apa si un
solvent nemiscibil cu apa) ;
•Suprafata interfaciala mare
•Amestecare eficienta in conditii blande de agitare a sistemului;
•Partitie rapida;
•Polimerii au influenta de stabilizare asupra proteinelor
Cromatografia pe hartie si in strat subtire
Tratamentul pregătitor
Aplicarea probei
Developarea
tehnica descendentă;
tehnica ascendentă;
tehnica orizontală
Vizualizarea (revelarea)
Cromatografie de excludere
din gel (gel-cromatografia)
Cromatografia pe coloana= fractionare sau purificare
Principiul de baza consta in trecerea unui amestec de proteine printr-o coloana de sticla sau
de plastic ce contine o matrice (suport) solida, de obicei
Pregatirea coloanei
1. Se suspenda matricea (rasina, schimbatorul de ioni, suport) in tampon de echilibrare;
2. Se umple coloana de sticla cu tampon de echilibrare, avand robinetul coloanei inchis;
3. Se deschide robinetul, permitand curgerea cu viteza foarte mica a tamponului;
4. Cu ajutorul unei pipete se incarca coloana cu suspensia de rasina;
5. Se permite depunerea libera a rasinii pana la nivelul necesar;
6. Se spala coloana cu 2-3 volume de tampon de echilibrare, inainte de a aplica proba.
Realizarea cromatografiei pe coloana
• Diferitele proteine strabat matricea cu viteze diferite datorate caracteristicilor lor chimice
si felului in care aceste caracteristici determina interactia lor cu matricea
• Atat amestecul de proteine cat si matricea sunt imersate in solvent.
• Proba (amestecul de proteine in solvent) este aplicat la capatul superior al coloanei, iar
solventul permite strabaterea lenta a coloanei umplute cu suport.
• Odata ce proba a patruns in interiorul matricei, solventul continua sa fie adaugat (nu este
permis ca suportul sa fie in stare uscata).
• Solventul este colectat in eprubete separate (fractionare) pe la partea inferioara a coloanei.
• Diferitele componente ale amestecului de proteine parcurg coloana cu viteze diferite in
functie de proprietatile chimice si pot fi astfel fractionate in probe separate.