Alcooloxidaza

(EC 1.1.3.13 )
Sursa de obtinere: basidiomicete
drojdii metilotrofe
Localizare : peroxizomi
Functie: metabolismul aerob al mediului ce contine
metanol drept sursa de carbon
catalizeaza prima reactie in oxidarea
secventiala a metanolului (metabolismul
compusilor C1)
Structura cuaternara: octamer alcatuit din 8
holosubunitati
Masa moleculara: 643.000 – 669.000 kD
Grupare prostetica: 1 molecula FAD
Reactie totala: Alcool + O2 -----> aldehida + H2O2
Specificitate de reactie: activa fata de metanol,
etanol, 1-propanol, 2-butanol
inactiva fata de alcoolii al
caror lant alchil este mai mare de 5, fata de alcoolii
secundari si tertiari si fata de alcoolii aromatici
 Biosinteza alcooloxidazei de origine microbiana
Sursa de obtinere : celule de Hansenula polymorpha
Drojdie metilotrofa
Parametrii biosintezei
volum de lucru
raport inoculare
temp de lucru
debit de aer in perioada de lag si in urmatoarele ore
agitare
pH mediu initial
corectie pH
antispumant
durata procesului
Caracteristica : alcooloxidaza este inhibata de prezenta apei oxigenate; din aceasta
cauza este obligatoriu insotita la nivel celular de catalaza, enzima care descompune apa
oxigenata
Sistem celular Sistem analitic
Alcooloxidaza Alcooloxidaza
Alcool + O2 -----> aldehida + H2O2 Alcool + O2 -----> aldehida + H2O2
Catalaza Peroxidaza
2 H2O2 --> 2 H2O + O2 H2O2 +DH2 -----> 2 H2O + D unde
D= o-dianisidina oxidata
 SCHEMA DE LUCRU
Mod de lucru

Mediu nutritiv agarizat

Colonii izolate din cultură stoc

Selectie naturala in
functie de capacitatea de
biosinteza a
alcooloxidazei

Mediu minimal de geloza Mediu de cultura sterilizat

Preinocul pe tuburi Inocul: cultura agitata Biosinteza in cultura

cu geloza inclinata pe mediu la 380 C, 48 h submersa, la 380 C, 36-44 h
72 h 370 C

Purificare parţială Celule Separare prin

centrifugare
 Celule Hansenula polymorpha

Permeabilizarea Cicluri repetate de

peretilor celulari inghet-dezghet
Tampon fosfat de
sodiu 0,05-0,2 M Dezagregare celule in moara cu bile (Dyno-Mill)
pH 7-9

Centrifugare Proteine balast

Debriuri celulare
Supernatant
Temp 50 C
Precipitare fractionata cu sulfat de amoniu 0-30% saturatie
Sulfat de
amoniu
Precipitat 0-30%
Centrifugare saturatie

Supernatant 30% saturatie sulfat de amoniu

 Temp 50 C
Precipitare fractionata cu sulfat de amoniu 30-60% saturatie
Sulfat de
amoniu

Centrifugare Supernatant 60%

saturatie sulfat de
amoniu
Precipitat 60% saturatie

Solubilizare
apa distilata

Omogenizare prin agitare magnetica

Dializa Temp 50 C

Centrifugare Particule insolubile

Solutie de alcooloxidaza in prezenta de catalaza

Filtrare
Adsorbant pe baza
de silice Adsorbtie selectiva
Tampon fosfat de
sodiu 0,05-0,2 M
pH 7-9 Agitare magnetica

Centrifugare Catalaza adsorbita

Solutie de alcooloxidaza fara catalaza

Regenerare adsorbant
Glicerina Conditionare

Produs finit: ALCOOLOXIDAZA

Aspect: lichid de culoare galbena, fara rezidii de decantare
Proprietati fizico-chimice: complex solubil in apa
Activitate alcooloxidazica: 32- 166 UI
Activitate catalazica: max 3% din activitatea initiala
 Metoda colorimetrica de dozarea activitatii alcooloxidazei
Principiul metodei:cuplare doua reactii enzimatice
Alcooloxidaza
metanol+ O2 -----> aldehida formica+ H2O2
Peroxidaza
H2O2 + o-dianisidina redusa -----> 2 H2O + o-dianisidina oxidata
Determinarea activitatii enzimatice

Reactivi si solutii: Proba Martor Blanc

Preparat 0,5 - -
1. Reactiv 1: peroxidaza+o- enzimatic (ml)
dianisidina in HCl+tampon fosfat
de sodiu 0,05 M pH 7,5+ metanol Apa distilata (ml - - 0,5
Reactiv 1 (ml 1,0 1,0 1,0
2. Solutie H2O2 0,08 M (solutie
stoc pentru construirea curbei Timp de reactie 30 secunde
etalon) HCl 1,2 N (ml 1,0 1,0 1,0

3. Solutie HCl 1,2 N Preparat - 0,5

enzimatic (ml
Colorimetrare la 446 nm
Calculare rezultate pe baza curbei de etalonare si exprimarea
activitatii in moli H2O2 consumat/ml preparat enzimatic/min