Enzimologia

 
INTRODUCERE
Enzimologia este o ramura a biochimiei a biochimiei, care se ocupa de studierea structurii
chimice a enzimelor, cineticii enzimatice, localizarea în sistemele vii si utilizarea acestora.
Enzimele sunt substante complexe de natura proteica ce catalizeaza reactiile de sinteza si
degradare din celulele vii.

Sunt biocatalizatori cu rol fundamental in reglarea proceselor de crestere si regenerare tisulara

si permit realizarea unor reactii chimice, care in vitro nu se pot realiza decat in conditii
incompatibile cu viata celulara. Acestea au fost folosite inca din antichitate la procesele de
fermentatie (paine,vin,otet,produse lactate, maturarea carnii).

Inca din secolul 19 diferiti cercetatori au studiat si facut descoperiri folosind enzimele :

-1835 : J.J. Berzilius dezvolta teoria catalizei chimice, mentionand diastazele ce au potential de a
hidroliza amidonul, comparand procesul cu hidroliza acida

-1850-1870 : Louis Pasteur demonstreaza ca fermentatia este facuta de microorganisme

-1897 :Eduard Buchner obtine primul preparat enzimatic din zimaza, o substanta produsa de
celulele vii de drojdie

-1926 :James B. Summer obtine prima enzima in stare cristalizata (ureaza din soia) si pe baza
unor experimente demonstreaza ca enzima obtinuta este o proteina

In 1964 Comisia de Enzimologie a Uniunii Internationale de Biochimie a creat o clasificare a

enzimelor :

-oxidoreductaze : catalizeaza reactiile de oxido reducere

-transferaze: catalizeaza reactiile de trabsfer a unor grupari functionale

-hidrolaze: catalizeaza reactiile de hidroliza

-liaze: catalizeaza reactiile de scindare nehidrolitica

-izomeraze: catalizeaza reactiile de izomerizare

-ligaze: catalizeaza reactiile de formare a unor legaturi chimice (sintetaze)

In august 2018 Comisia de Enzimologie a adaugat o noua categorie de enzime numite
translocaze. Acestea catalizeaza miscarea ionilor sau a moleculelor in membrane sau separarea
lor din membrane.

Studiul enzimelor este important pentru explicarea proceselor care au loc in organismele vii,
pentru a stabilii structurile produsilor naturali. Aceste cercetari ale proceselor enzimatice au
dus la descoperirea a diferite proprietati benifice, care sunt folosite in medicina pentru
efectuarea analizelor, diagnosticarea bolilor, producerea de medicamente sau in industria
alimentara pentru producerea de alimente.

Cap 1

Tirozinaza este o enzima care are rolul de a controla producerea melaninei . Enzima este
prezenta in tesuturile plantelor, la animalele nevertebrate ( diferite specii de sepie,
crustacee),la unele mamifere (iepuri), la oameni, in fungi( Agaricus bisporus, Neurospora
crassa) si in bacterii( Rhizobium, Pseudomonas maltophilia,Streptomyces glaucescens). Datorita
catalizarii melaninei si ai altor pigmenti prin oxidare, unele legume precum cartoful decojit se
innegresc daca stau expuse prea mult timp la aer.

Tirozinaza este preluata din interiorul melanozomilor, organite celulare care au rolul de
transport si stocare a melaninei si sunt sintetizate in pielea melanocitelor ( celule ce se gasesc
pe epiderma pielii).
La om, tirozinaza este o proteina transmembranara cu o singura membrana, monomerii ei au
mai mult de o izoforma si are un continut de carbohidrati de 13%. Aceasta este sortata in
melanozomi, unde se afla si domeniul catalitic activ al proteinei. Doar o parte mica enzimatica
neesentiala se extinde in citoplasma melanocitului. Deasemenea, culoarea pielii la oameni si
animale este data de gena TYR.

Acesti atomi de cupru ai enzimei se leaga de oxigenul atomic, catalizand cele doua reactii
distincte ale sintezei melaninei (situsuri catalitice) :

Are loc hidroxilarea unui monofenol:

Are loc conversia unui o-difenol in o-chinona:

Codul

Numarul de comisie (1.14.18.1.) al tirozinazei arata ca aceasta face parte din clasa
oxidoreductazelor, iar subclasa este cea a polifenolior. Enzima prezinta specificitate fata de
structurile chimice derivate din fenol (dopamina, adrenalina, crezol). Datorita acestei
caracteristici, tirozina poate fi utilizata pentru analiza concentratiei de fenoli din alimente si
mediul inconjurator.

Prin tirozina se pot obtine biosintetizatori ce pot fi folositi pentru a determina nivelul de
dopamina din creier, care ajuta la diagnosticarea persoanelor cu boli mintale.

Pot aparea problema la tirosinaza, daca gena TYR este cumva alterata sau deteriorata, atunci nu
se poate produce melanina. La oameni si animale pielea si parul au culoarea alba, iar culoarea
ochilor la animale devine roz sau rosie (vasele de sange de pe retina sunt vizibile). Persoanele si
animalele care sufera de albinism sunt mai predispusi la bolilele canceroase pentru ca pielea nu
este rezistenta la radiatiile ultraviolete.

Reactii catalizate

Tirozinaza realizeaza oxidarea fenolilor precum tirozina si dopamina folosind dioxigenati (O2).
In prezenta 1,2-dihideoxibenzenului (catecol) se formeaza benzochinona. In urma reactiei se
elimina hidrogeni din catecol si se combina cu oxigenul pentru a forma apa.
Tirozinaza de la mamifere se foloseste de structura levogir a enzimei sau forma levogir a 3,4-
dihidroxialaninei (L- DOPA este precursorul dopaminei), unde L-Dopa trebuie sa fie cofactor.

Parametrii

Pentru determinarea temperaturii si ph-ului optim s-a folosit o solutie tampon ce avea structura
similara cu cea a 1,2-dihidroxibenzenului, un spectofotometru si bai de apa la temperaturi
diferite. Dupa efectuarea experimentului s-a determinat ca temperatura optima este de 40 de
grade C, iar pH-ul optim este de 6. La aceste valori s-a observat ca activitatea tirozinazei si
productia de melanina sunt mai mari cand temperatura este ridicata, iar mediul este slab acid.
Metode de determinare a Activitatii enzimatice

Spectofotometru Lambda 465 UV/Vis

Referinte bibliografice

1. Maniatis, F.L., Firitsch, E.F., Sambrook, J., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Press, New York, 1982.

2. Rodney Boyer, Modern Experimental Biochemistry, 3rd ed.: Benjamin/Cummings, 2000.

3.Aplicatii ale Tirozinazei si Lacazei:Biosenzori enzimatici electrochimici, Sef de

lucrari Monica Florescu, doctor Andreea Valceanu, profesor universitar doctor
Gheorghe Coman, Facultatea de Medicina, Universitatea ,,Transilvania’’ din
Brasov

4. . Algieri C., Donato L., Bonacci P., Giorno L., Tyrosinase immobilised on polyamide tubular
membrane for the l-DOPA production: Total recycle and continuous reactor study, Biochemical
Engineering Journal 2012, 66, 14- 19

Aberg C. M., Chen T., Ayotunde O., Srinivasa R. R., Gregory F. P. (2004). Enzymatic Grafting
of Peptides from Casein Hydrolysate to Chitosan. Potential for Value-Added Byproducts from
Food-Processing Wastes. J. Agric. Food Chem,52(4),788–793

Cap 3

Utilizari ale enzimei

Tirozinaza este implicate in biosinteza melaninei din melanozomi, fiind responsabila de culoarea
pielii, a parului si ochilor, oferind protectia impotriva radiatiilor ultraviolet. Enzima are un rol
important in sistemul imunitar al plantelor si nevertebratelor, ajutand la vindecarea ranilor. Este
essential pentru formarea sporilor pentru ca protejeaza tesutul ranit al fungilor, protejand-ul de
bacteria. Enzima este folosita in industria medicala pentru sinteza melaninei, folosita pentru
scopuri terapeutice, producerea de L-Dopa, folosit ca medicament pentru diferite boli neuronale
precum boala Parkinson si producerea de diferiti antibiotic. Tirozinaza extrasa din ciuperci este
folosita pentru tratarea bolilor pielii, precum Vitiligo. Deasemenea poate fi folosita pentru
detectarea celulelor tumorale din straturile superficiale ale epidermii pielii.

In industria alimentara, tirozinaza este folosita pentru producerea de hidroxitirozol(C8H10O3),

care este folosit ca aditiv alimentar. Enzima este folosita la producerea de teaflavina
(C29H24O12), un compus ce se gaseste pe frunzele dec eai, in specialla cel negru si are
proprietati anticanceroase. La producerea carnii, enzima are rol in gelificarea proteinelor
musculare care expuse la caldura in timpul procesarii carnii si dau forma acesteia. Este folosita si
la procesarea laptelui pentru ca proteinele din lapte sa faca legaturi incrucisate.

In industriile de fabricare ale hartiei, a pielii, a textilelor si in cea de extragere a carbunilor si

petrolului se elimina surse de poluare care constau din fenoli si derivatii acestora. Tirozinaza este
capabila sa oxideze acesti fenoli si sa le transforme in substante insolubile, care apoi pot fi
eliminate prin precipitare sau filtrare. Deasemenea in industria fabricarii textilelor, pielii si
hartiei produc substante colorate toxice, formate in mare parte din azoderivati, care sunt nocive
pentru mediul inconjurator. In anumite conditii, aceste substante sunt mai intai decolorate de
bacterii si apoi degradate de tirozinaza.

Mai este folosita si in industria de cosmetice la prodcuerea lotiunilor de autobronzare.

Concluzii

-Tirozinaza este foarte importanta pentru ca ea catalizeaza reactia de formare a pigmentilor pielii,
oferind protectie impotriva razelor ultraviolete.

-Este o enzima comerciala foarte importana, fiind folosita la prepararea medicamentelor si in

tehnologiile de bioprocesare ale produselor alimentare

- Este folosita pentru obtinerea de noi polimeri prin incrucisarea legaturilor dintre polimerii
naturali

-Ofera o metoda usoara pentru conversia produsilor folositi in procesarea alimentelor, care nu
afecteaza mediul inconjurator si ofera caracteristici functionale valoroase

-Poate fi folosita pentru altoirea compusilor specifici in biopolimeri si obtinerea de bioproduse

-Poate oxida substantele reziduale toxice precum fenolii pentru a fi mai usor de eliminati
-Poate actiona ca substanta de referinta pentru mediul inconjurator, detectand substantele toxice
din apa si sol

-Datorita abilitatii sale de a reactia cu fenolii este utila in aplicatiile biotehnologice, biosenzoriale
si biocatalizatoare

-Gena TYR este folosita ca model in studiile legate de plierea proteinelor, de glicozilare si
procesarea glicanilor in studiul melanomelilor

Structura tirozinazei

Datorita surselor multiple din care se poate extrage tirozinaza, structura acesteia poate varia de
la specie, impreuna cu distributia tesuturilor si celulelor. Astfel la fiecare specie se observa
proteine diferite. Diferenta dintre enzime in functie de specie poate fi observata in structura
primara, la locurile active si la mecanismul de glicozilare. Singurul lucru comun pe care il are
fiecare specie este centrul binuclear de tip III de cupru, care este format din doi atomi de cupru,
iar fiecare atom este legat de sase molecule de histidina in locul lor activ.