Enzimele n procese metabolice

Enzime
1. Definiie

2. Istoric
3. Caracteristici ale catalizei enzimatice

4. Mecanisme de aciune cinetica reaciilor enzimatice

5. Structur
6. Specificitate
7. Localizare intracelular
2

Enzime. Definiie

catalizatori biochimici propriu-zii (biocatalizatori),

biocompui de natur organic,
proteine nalt specializate
biomolecule caracterizate prin - eficien
- specificitate
- putere catalitic deosebit
- capacitate de reglare mult superioar
catalizatorilor, utilizai in vitro, n chimia anorganic i organic

acioneaz n condiii blnde de reacie (condiii fiziologice,

compatibile cu viaa celulei umane):
pH neutru (~7);
temperatura organismului uman (~36C);
presiune atmosferic normal.

CARACTERISTICILE CATALIZEI ENZIMATICE

I. Caracteristicile aproximativ comune catalizei chimice
Mresc viteza de reacie fr s se consume
Dup terminarea unei reacii pot cataliza transformarea altei
molecule de substrat
Cantiti mici de enzime sunt capabile s transforme cantiti

mari de substrat
Nu modific starea de echilibru, ci viteza cu care se ajunge la
echilibru
Catalizeaz n general reacii reversibile

II. Caracteristicile specifice catalizei enzimatice, sunt determinate de:

1. Structura proteic
2. Natura biocompuilor transformai
3. Condiiile existente n organismele vii:
Numar mare de transformare (turnover)

CONDIII BLNDE DE REACIE (pH, temperatur, presiune)

Transform substane cu inerie chimic mare
Vitez foarte mare

Particularitile catalizei enzimatice:

Cataliz microeterogen (i omogen i eterogen): enzimele sunt

compui macromoleculari fixai pe formaiuni subcelulare

Eficien extraordinar
Grad (foarte) mare de specificitate (menine ordinea n celule)
Enzimele catalizeaz numai reaciile care sunt termodinamic posibile
G < 0

Procesele enzimatice sunt procese autoreglate (enzimele catalizeaz

n general reacii care se petrec n lan)
mbtrnirea enzimelor (natura proteic)
(n organismele vii au loc permanent procese de degradare i de sintez
proteic)
6

MECANISMUL CATALIZEI ENZIMATICE

EXPLICAIA EFICACITII ACIUNII ENZIMELOR

Enzimele mresc viteza reaciilor chimice

Eficacitatea catalizatorilor, n general i deci i a enzimelor poate fi

explicat aplicnd LEGEA LUI ARRHENIUS:
dlnk
dT

Ea
=

RT2

n care:

k=constanta de vitez
Ea=energia de activare
T=temperatura (grade Kelvin)
R=constanta gazelor

Accelerarea vitezei unei reacii cu enzime n raport cu viteza unei

reacii fr catalizator poate fi chiar de 106 1017 ori !
=> VITEZA DE REACIE DEVINE ASTFEL APROPIAT DE LIMITA TEORETIC
7

=> Ca i n cazul unor reacii spontane din chimia general

accelerarea vitezei unei reacii chimice are loc prin mai multe modaliti:
1.) Creterea numrului de molecule bogate n energie care s realizeze
ciocnirile eficace dintre molecule DAR, acestea sunt condiii improprii
organismului viu!!

2.) Scderea energiei de activare - n organismul viu

Energia de activare= energia n exces necesar moleculelor dintr-un mol de
substan la o temperatur dat pentru a atinge starea de activare.
Energia de activare reprezint diferena de energie dintre moleculele active

i cele neactive.

Enzimele scad energia de activare prin formarea unui complex

intermediar activat enzim-substrat (ES) nalt energetic, cu
reactivitate mare (i cu energie de activare sczut)
Enzimele ajut reactanii s nving bariera energetic nainte ca
reacia s aib loc
Enzimele permit realizarea a numeroase reacii n condiii fiziologice

MECANISME CARE INTERVIN I POT EXPLICA FORMAREA

COMPLEXULUI ACTIVAT ENZIM - SUBSTRAT [ES]
=> Efect de PROXIMITATE
(POZIIONARE, APROPIERE, VECINTATE) dintre
centrul activ al enzimei i moleculele care urmeaz a fi
transformate.

=> EFECT DE AEZARE CONFORMAIONAL FAVORABIL

=> EFECT DE CATALIZ COVALENT

Exemplu: formarea unei baze Schiff ntre substrat i unele grupri

funcionale din centrul activ al enzimei.
EFECT DE CATALIZ ACID-BAZ

10

ENZIMELE INDUC ARANJAREA SUBSTRATULUI NTR-O POZIIE RELATIV

FAVORABIL LA GRUPRILE CATALITICE NLESNINDU-LE INTERACIUNILE
(EFECT DE APROPIERE).

Interaciile dintre centrul activ i substrat au loc prin intermediul acelorai

legturi care stabilizeaz i structura proteic, i anume:
interacii hidrofobe, electrostatice, de hidrogen, sau de tip van der Waals.
11

FORMAREA COMPLEXULUI ACTIVAT ENZIM - SUBSTRAT [ES]

Pentru realizarea actului catalitic, enzima E trebuie s se fixeze pe
substratul specific S pentru a forma
COMPLEXUL ENZIM-SUBSTRAT [ES]
O reacie enzimatic parcurge mai multe stadii:
E+S

ES

ET

E+P

Enzimele au eficacitate catalitic deosebit datorit formrii unei

combinaii specific reactive ntre gruprile catalitice i substrat
COMPLEXUL ACTIVAT [ES]

12

Centrul activ al enzimei (galben) cu o conformaie

adaptat la substrat (rou).
13

Formarea complexului enzim-substrat [ES] activat i n starea de

tranziie, i formarea produsului de reacie

14

Exemplul clasic:
Reacia catalizat de CATALAZ
H2O2 + H2O2 2 H2O + O2

G < 0

Descompunerea H2O2 LA CLDUR: ENERGIA DE ACTIVARE = 18 kcal (76 kJ/mol)

Descompunerea H2O2 CU CATALIZATOR MINERAL (Pt):
ENERGIA DE ACTIVARE = 8 kcal (49 kJ/mol)
Descompunerea H2O2 CU ENZIMA CATALAZA:
ENERGIA DE ACTIVARE = 2,3 kcal (8 kJ/mol)
Aplicnd legea i ecuaia lui Arrhenius s-au calculat constantele de vitez pentru:
Recia catalizat de PLATIN
Reacia catalizat de CATALAZ
S-A DEMONSTRAT C :

k catalaz
k platin

= 106

Deci, la 37OC CATALAZA DESCOMPUNE PEROXIDUL DE HIDROGEN DE CIRCA UN

MILION DE ORI MAI REPEDE DECT PLATINA
15

CATALAZA

H2O2 + H2O2

2 H2O + O2

G < 0

Scderea energiei de activare n reacia de descompunere a peroxidului

de hidrogen, n prezena platinei i a enzimei catalaza
16

CENTRII ACTIVI AI ENZIMELOR

Centrul activ al enzimei sau centrul catalitic al enzimei reprezint o
parte special structurat a enzimei care fixeaz substratul asupra
cruia acioneaz.

Reprezint regiuni bine determinate de pe suprafaa enzimei.

17

STRUCTURA ENZIMELOR
Cu foarte rare excepii enzimele sunt proteine sau heteroproteine
Excepiile, descoperite n ultimii 20 de ani structur de acizi

ribonucleici
Exemple: Ribonucleaza P Complex protein Acid ribonucleic
DOU MARI CATEGORII DE ENZIME DIN PUNCT DE VEDERE STRUCTURAL:
I. CU STRUCTUR UNITAR: - PROTEINE SIMPLE - CONSTITUITE NUMAI DIN
AMINOACIZI

II. CU STRUCTUR BINAR: - HETEROPROTEINE PROTEINE CONJUGATE:

PROTEIN + COFACTOR (PARTE NEPROTEIC)
18

I.

ENZIMELE CU STRUCTUR UNITAR, PROTEINE SIMPLE

Exemple:
RIBONUCLEAZA (124 RESTURI DE AA) ARE 12.700 DALTONI TRIPSINA

(24.000 DALTONI)
PEPSINA (33.000 DALTONI)

1 DALTON = 1,661 x 10-24 grame

MURAMIDAZA (LIZOZIM) 129 AA

Activitatea acestor enzime depinde numai de structura proteinelor

19

I. ENZIMELE CU STRUCTUR UNITAR

Centrul activ este reprezentat de un numr mic de aminoacizi.
Exemplu: la chimotripsin centrul activ este format din HISTIDIN i SERIN

OBSERVAIE! Aminoacizii din centrul catalitic al enzimei:

Pot fi la distan din punct de vedere al structurii primare

Dar spaial apropiai din punct de vedere al structurii tridimensionale

Ribonucleaza: centrul activ His + Ser

Colinesteraza: centrul activ Ser
Hexokinaza: centrul activ- gruprile SH ale cisteinei

20

Centrul activ al
chimotripsinei
His + Ser

Centrul catalitic al anhidrazei

carbonice
Zn2+ + 3 molecule de His + H2O
21

II. ENZIMELE CU STRUCTUR BINAR: HETEROPROTEINE PROTEINE

CONJUGATE:

PROTEIN + COFACTOR (PARTE NEPROTEIC)

Structura binar este indispensabil manifestrii aciunii catalitice
COMPONENTA PROTEIC SE NUMETE APOENZIM
COFACTORUL poate fi:
COENZIM (legtura dintre apoenzim i componenta neproteic este
labil, se poate separa prin dializ sau prin alte mijloace de partea

proteic)
GRUPARE PROSTETIC (cofactorul se fixeaz pe apoenzim prin
legturi covalente i nu pot fi separate prin dializ)
22

COFACTORII, din punct de vedere chimic pot fi:

VITAMINE
HORMONI
METALE
Coenzimele i gruprile prostetice au structuri chimice, funcii i
mecanisme de aciune diferite.
Unii cofactori sunt considerai cosubstrate
DE EXEMPLU: REACIILE REDOX

ROLUL COMPONENTEI PROTEICE:

Confer specificitatea de substrat

Dirijeaz i specificitatea de aciune

ROLUL COFACTORULUI:

Particip la realizarea funciei catalitice

Confer specifictatea de reacie (de aciune)

23

II. ENZIMELE CU STRUCTUR BINAR : 2 CENTRI ACTIVI

1. Unul aflat pe fragmentul proteic
2. Altul aflat pe fragmentul neproteic

III. ENZIMELE ALLOSTERICE pot avea i 3 CENTRI ACTIVI

24

Reprezentarea schematic a structurii enzimelor i a centrilor activi:

(a) protein-enzima, cu structur unitar;
(b) heteroproteina, cu structur binar (apoenzima + cofactor)
25

STRUCTURA ENZIMELOR

STRUCTURA APOENZIMEI
STRUCTURA PRIMAR

Se refer la scheletul covalent al lanului polipeptidic i la secvena de

aminoacizi componeni.
Se specific:

numrul de aminoacizi
felul aminoacizilor
succesiunea lor n lan
tipurile de legturi
locul punilor disulfurice (-S-S-)
Structura primar a enzimei
Ribonucleaza A din pancreasul bovin
26

STRUCTURA SECUNDAR

Desemneaz aranjamentul obinuit ntr-o singur dimensiune n spaiu,

prin dispunerea elicoidal a catenei polipeptidice.
Conformaia unic, n zig-zag, este determinat de starea

de hibridizare a atomilor participani la structura lanului

Exist dou tipuri de lanuri:
- -helix
- -helix (tip foaie pliat).

Structur secundar de tip -helix (a) i -helix (tip foaie pliat) (b)
27

STRUCTURA TERIAR
Desemneaz asamblarea n spaiul tridimensional (organizarea spaial)

a lanurilor polipeptidice cu structur primar i secundar bine definite

Determin tipurile de legturi noncovalente stabilite ntre radicalii
aminoacizilor care pot stabiliza conformaia respectiv
Exist dou tipuri diferite de structuri teriare :
1) globular (ghem), Ex: albumina, ribonucleaza, lizozimul

2) fibrilar (fibre), Ex: colagenul

Caracteristicile structurii teriare:
Imprim enzimelor diferite proprieti biologice.

Este stabilizat prin:

- interaciuni electrostatice;
- legturi de hidrogen;
- interaciuni de tip hidrofob;
- puni disulfurice;
- interaciuni ntre radicalii polari ai aminoacizilor.

28

Structura schematic tridimensional a Ribonucleazei A:

(a) tip panglic sau ribbon- ilustreaz structurile de tip - i helix ale lanurilor polipeptidice, (b) tip bilue sau space filling
ilustreaz atomii din componena lanurilor polipeptidice

29

STRUCTURA CUATERNAR

Specific protein-enzimelor oligomere, poate rezulta din:

- asocierea unor lanuri polipeptidice cu structur teriar;

- asocierea unor protomeri (dimeri, trimeri, tetrameri, etc)

Protomerii se leag ntre ei prin legturi de tip noncovalent, realizate prin

puncte sau suprafee complementare.

Caracteristic enzimelor de tip allosteric, cu funcii nalt specifice.

Activitatea catalitic a enzimelor depinde de integritatea conformaiei

proteinei native.

Prin denaturare sau disociere n subunitile componente, activitatea sa

catalitic se pierde (de obicei).

30

Integritatea structurii primare, secundare, teriare i cuaternare

sunt eseniale pentru activitatea catalitic a enzimelor !

Niveluri de organizare n structura apoenzimei

31

SPECIFICITATEA ENZIMATIC
1. SPECIFICITATEA DE REACIE = capacitatea enzimei de a cataliza un
anumit tip de reacie (sau reacie nrudit) posibil din punct de vedere
termodinamic.
Exemple:
oxidoreductaze
transferaze
- Determinat n special de structura chimic a cofactorului (coenzimei sau a
gruprii prostetice)
Excepii:
Enzimele dependente de piridoxal-fosfat (PLP) sunt enzime care au n
structura lor vitamina B6 activat, pot cataliza reacii de:
decarboxilare
transaminare
izomerizare
- Mecanismele sunt diferite !

32

2. SPECIFICITATEA DE SUBSTRAT = proprietatea enzimei de a aciona

asupra unei anumite substane sau asupra unui grup de substane
cu unele caracteristici chimice comune.

Determinat de natura apoenzimei (partea proteic a enzimelor).

Asigur ordinea desfurrii reaciilor chimice n celul, mpiedicnd

formarea i degradarea haotic a diferiilor constitueni.

Gradul de specificitate variaz de la o enzim la alta.

Modelul cheie-lact
de reprezentare a
specificitii
enzimatice pentru un
anumit substrat
33

A. Specificitatea absolut de substrat

Exemple: ureaza, fumaraza, arginaza
- acioneaz asupra unui singur substrat cataliznd un singur tip de
reacie chimic.

34

Specificitatea stereochimic
Configuraia spaial a moleculelor substratului.
Specificitatea optic
Specificitatea geometric

tipuri de specificitate
absolut de substrat

Asimetria structural
este o caracteristic
generala a sistemelor
biologice !

Capacitatea de a recunoate specific substraturi care conin centrii

asimetrici.
Acioneaz asupra unuia dintre izomerii optici
Exemple: L aminoacid oxidaza, D aminoacid oxidaza, maltaza
fumaraza, enzim ce catalizeaz reacia de hidratare numai pentru
izomerul trans, acidul fumaric
lactat dehidrogenaza (LDH) acid L-lactic
OBSERVAIE: Existena specificitii se poate corela cu necesitile metabolice ale
celulei.
35

B. Specificitatea relativ de substrat

Catalizeaz acelai tip de reacie dar pot aciona asupra mai multor substrate cu
structuri chimice comune.
Exemple:

Peptidazele hidrolizeaz legturile peptidice.

Specificitatea peptidazelor = anumite legturi peptidice la care particip

aminoacizi determinai:
Exemplu: Pepsina hidrolizeaz numai legturile peptidice realizate
ntre un aminoacid dicarboxilic i un aminoacid cu structur aromatic.

Fenoloxidazele - catalizeaz reaciile de oxidare a diferiilor fenoli.

Glucozidazele - hidrolizeaz legturile glucozidice dintre un glucid i un alt

compus (agliconul).
36

LOCALIZAREA ENZIMELOR N ORGANE I ESUTURI

- Repartizarea poate fi neuniform.
- Se cunosc enzime prezente n cvasi-totalitatea esuturilor animale.

Exemple:
enzimele din lanului respirator
enzimele din ciclul Krebs
fosfatazele
Alte enzime nu sunt elaborate dect de ctre anumite celule ale unor organe.
Exemplu:
pepsina

Un caz interesant: existena mai multor izoforme enzimatice izoenzime- n organe diferite, n cadrul aceluiai organism.
Exemplu:
La om exist izoenzime ale lactat dehidrogenazei (LDH) n funcie de organ
(esut muscular, hepatic).
37

LOCALIZAREA ENZIMELOR N SISTEMUL DIGESTIV

Glande salivare
-amilaza

Pancreas
exocrin
-amilaza
Chimotripsina
Tripsina
Lipaza

Glande fundice ale

stomacului
Pepsina
Intestin subire
Zaharaza
Maltaza
Lactaza

38

LOCALIZAREA INTRACELULAR A
ENZIMELOR

Tehnici moderne de fracionare a

omogenatului celular prin
ultracentrifugare diferenial =>
Repartizarea enzimelor pe
diferite formaiuni subcelulare;
Orientarea reaciilor enzimatice
n funcie de nevoile celulei =>

reglarea metabolismului celular

39

Diferitele organite subcelulare conin enzime marker specifice

Nucleul
Enzimele necesare biosintezei acizilor nucleici
Exemplu: ADN polimeraza
Mitocondriile
Sediul respiraiei celulare i a fosforilrii oxidative, deci
conin enzimele necesare acestui proces
Reticulul endoplasmic rugos (RER)
Asociat cu ribozomii, conine o mare varietate de enzime care
asigur att sinteza de proteine i polizaharide (glicoproteine)

Reticulul endoplasmic neted (REN)

Enzimele necesare oxidrii i detoxifierii compuilor
xenobiotici (medicamente, pesticide)
Lizozomii
Sunt bogai n enzime hidrolitice, de degradare
40

FACTORII CARE INFLUENEAZ VITEZA UNEI REACII

ENZIMATICE

1. Temperatura mediului de reacie

2. pH-ul mediului de reacie
3. Concentraia enzimei
4. Concentraia substratului
5. Efectorii enzimatici - activatori
- inhibitori

1. TEMPERATURA MEDIULUI DE REACIE

Temperatura mediului de reacie

efector fizic

Temperatura poate modifica:

stabilitatea enzimei;
afinitatea enzimei pentru substrat;
viteza de scindare a complexului enzim-substrat [ES];
afinitatea enzimei pentru diferii activatori i inhibitori: temperatura
influeneaz pozitiv viteza de reacie pn la atingerea unei temperaturi
optime, dup care viteza de reacie scade rapid.
Temperatura optim = temperatura
corespunztoare vitezei maxime de
aciune a enzimei
(aproximativ 40- 50C)

Vt 10
Q10
Vt

Q10 2 3

2. INFLUENA pH-ului MEDIULUI DE REACIE ASUPRA

ACTIVITII ENZIMELOR
pH-ul mediului de reacie = concentraia ionilor de hidrogen

pH-ul optim al unei enzime: pH-ul mediului de reacie pentru care

activitatea enzimei respective ca i viteza de reacie este maxim.
pH-ul optim poate varia n funcie de: - natura substratului,
- concentraia de substrat,
- originea enzimei,
- temperatur, presiune.
Pentru enzimele din organismul uman pH-ul optim de aciune este chiar
pH-ul normal al mediului n care ele i ndeplinesc funcia catalitic.
La majoritatea enzimelor pH-ul optim este n jurul valorii 7
Influena exercitat de pH-ul mediului se datoreaz:
ionizrii centrilor activi din molecula enzimei;
ionizrii substratului, modificndu-se astfel activitatea sa pentru centrii activi
ai enzimei

Exemplu amilaza salivar acioneaz numai la nivelul cavitii bucale deoarece

este inhibat de pH-ul acid al stomacului.

Pentru majoritatea
enzimelor, variaia vitezei
de reacie n funcie de
pH are aspectul unei
curbe n form de clopot
(pH = 5,5-8).

Excepii:

pepsina, tripsina, papaina,

arginaza, colinesteraza

FACTORII CARE INFLUENEAZ VITEZA UNEI REACII ENZIMATICE

1. Temperatura mediului de reacie

2. pH-ul mediului de reacie

3. Concentraia enzimei

4. Concentraia substratului
5. Efectorii enzimatici - activatori

- inhibitori

45

INFLUENA CONCENTRAIEI ENZIMEI ASUPRA VITEZEI DE REACIE

Viteza unei reacii enzimatice depinde de concentraia enzimei din mediul de reacie.
v = k [E]

unde k constanta caracteristic pentru fiecare reacie enzimatic

v viteza de reacie
[E] concentraia de enzim

Viteza de reacie este proporional cu concentraia enzimei.

Dar, cu ct concentraia de enzim este mai mare cu att cantitatea de substrat
necesar desfurrii reaciei va fi mai mare.

46

Influena concentraiei de enzim [E] asupra vitezei de reacie:

- n condiii normale (N),
- n cazul reducerii concentraiei de substrat (B),
- n prezena activatorilor (A) sau a inhibitorilor (I) enzimatici n mediul de reacie,
- n prezena unor impuriti (C).
47
Poriunea din grafic O C = perioad de lag

FACTORII CARE INFLUENEAZ VITEZA UNEI REACII

ENZIMATICE

1. Temperatura mediului de reacie

2. pH-ul mediului de reacie
3. Concentraia enzimei
4. Concentraia substratului
5. Efectorii enzimatici - activatori
- inhibitori

48

INFLUENA CONCENTRAIEI SUBSTRATULUI ASUPRA VITEZEI REACIILOR

ENZIMATICE
Ecuaia Michaelis-Menten
Formarea complexului activat enzim - substrat (ES)

Prima teorie privitoare la dependena vitezei

unei reacii enzimatice de concentraia
substratului a fost elaborat n 1913, la Berlin,

de Leonor Michaelis i de Maud Menten.

49

Ipoteza formrii unui complex activat ntre enzim i substrat, notat ES.
E + S ES ET* EP E + P

Schematic, reacia enzimatic se desfoar astfel:

E + S

ES

E + P

unde se noteaz: [E] = concentraia total a enzimei

[S] = concentraia substratului

[ES] = concentraia complexului activat enzim-substrat

([E]-[ES]) = concentraia enzimei libere
Se consider c reacia global este ireversibil, deci c produsul de reacie nu rmne
legat de enzim.

50

E + S

ES

E + P

Fiecare din cele trei reacii se caracterizeaz printr-o vitez de reacie,

respectiv printr-o constant de vitez specific:

E + S

k+1

ES

k+2

E + P

k-1
Se consider prima parte a reaciei, care este reversibil:
k+1
E + S
ES
k-1

Cele dou viteze de reacie, pentru ambele sensuri, sunt

proporionale cu concentraiile reactanilor:

v+1 = k+1([E] - [ES]) [S]

v1 k 1[ES]
La echilibru, cele dou viteze de reacie sunt egale : v+1 = v-1

k+1([E] - [ES]) [S] = k-1[ES]

51

n orice moment al reaciei vitezele de formare i de scindare ale complexului

ES sunt aproximativ egale, aa nct [ES] poate fi considerat constant.
Se mparte ecuaia cu factorul k+1[ES]:
Se separ constantele de vitez i rezult:

k+1([E] - [ES]) [S] = k-1[ES]

k+1[ES]

k+1[ES]

k-1
([E] - [ES]) [S]
= KM
k+1
[ES]
(1)
unde KM a fost denumit iniial constanta Michaelis, fiind de fapt
constanta de disociere a complexului enzim-substrat.

k-1
k-1
([E] - [ES]) [S]
([E] - [ES]) [S]
= KM
= KM
=
=
k+1
k+1
[ES]
[ES]

KM [ES] = ([E] - [ES]) [S]

KM [ES] = [E] [S] - [ES] [S]
KM [ES] + [ES] [S] = [E] [S]

[ES]( KM+ [S] ) = [E] [S]

[E] [S]
[ES] =
KM + [S]

(2)
52

Prelucrm a doua parte a reaciei enzimatice:

E + S

k+1

ES

k+2

E + P

k-1
k +2
[ES]
E P

[ES] =

v+2 k 2 [ES]

v+2

(3)

k+2
ntr-o reacie enzimatic se urmrete formarea produsului de reacie P, deci
viteza de reacie notat v+2 poate fi considerat viteza propriu-zis a reaciei
enzimatice notat v, vitez de interes practic.
v
(4)
[ES] =
k+2
Se egaleaz relaia (4) cu relaia (2):

v
[E] [S]
=
KM+ [S]
k+2
Din relaia (4) rezult:
v Vmax

v=

(5)

v = k+2 [ES] (7)

k+2 [E] [S]

KM + [S]

(6)

unde k+2 = constant catalitic (indic

eficacitatea enzimei)

[ES] = [E]

Vmax = k+2 [E] (8)

v=

Vmax [S]
KM + [S]

(9)

Ecuaia MichaelisMenten

53

v=

Ecuaia Michaelis-Menten: expresia matematic ce

definete relaia cantitativ dintre viteza unei reacii
enzimatice, concentraia de substrat i valoarea
constantei lui Michaelis KM.

Vmax [S]
KM + [S]

Ecuaia permite calcularea KM, n funcie de

concentraia substratului.

v=

Vmax

Vmax

Vmax [S]
KM + [S]
saturare

2KM + [S] = 2 [S], deci KM = [S]

Influena concentraiei substratului [S] asupra cineticii reaciilor

enzimatice. Reprezentarea grafic a ecuaiei Michaelis-Menten
54

PRELUCRRI ALE ECUAIEI MICHAELIS-MENTEN

E + S

k+1

ES

k+2

E + P

k-1
Ecuaia Michaelis-Menten se baza pe o ipotez care nu corespunde realitii:
k-1 >> k+2
k+2 = constanta de vitez a reaciei de descompunere a complexului enzimsubstrat, n enzim i produi de reacie (adic n substrat transformat), este
suficient de mic pentru a nu influena mersul reaciei, care este condiionat
exclusiv de k+1 i k-1.
Deci n teoria Michaelis-Menten nu are loc transformarea substratului; se consider
k+2 ca fiind foarte mic, ceea ce nu corespunde realitii.
n mod real se micoreaz [S] i crete [P] !!
Aceast contradicie aparent a teoriei Michaelis-Menten se poate elucida dac
cinetica reaciilor enzimatice este interpretat inndu-se seama de cinetica strii
staionare.

55

TEORIA BRIGGS I HALDANE. CINETICA STRII STAIONARE

G.E. Briggs i J.B.S. Haldane au analizat ecuaia general a reaciilor enzimatice
i au elaborat n anul 1925 o teorie mai cuprinztoare.

Echilibrul dinamic ntre

concentraiile de
substrat (S), enzim (E),
complex enzimsubstrat (ES) i produs
de reacie (P), n cursul
unei reacii enzimatice.
Concentraia total de
enzim, [E]T = [E] + [ES]

56

Faza staionar sau starea staionar poate fi definit ca perioada de timp n care viteza de
formare a produsului reaciei i concentraia tuturor produilor intermediari rmn
constante.

concentraie
staionar a
complexului [ES]

La un moment dat, viteza de formare a complexului ES este proporional cu

produsul concentraiei substratului [S] i a enzimei libere ([E]-[ES])

57

ALTE PRELUCRRI ALE ECUAIEI MICHAELIS-MENTEN

Ecuaia Lineweaver-Brk
Hans Lineweaver i Dean Brk au propus n 1934 inversarea ecuaiei Michaelis-Menten

v=

K + [S]
1
= M
v
Vmax [S]

Vmax [S]
KM + [S]

(17)

Ecuaia Lineweaver-Brk:

KM . 1
1
1
+
=
v
[S]
Vmax
Vmax

(18)

Ecuaie de tipul y = ax + b:
unde:

x=

1
[S]

; y=

1
v

58

Importana practic a reprezentrii Lineweaver-Brk

Mult mai exact pentru evaluarea experimental a KM !
Se poate determina experimental viteza de reacie (1/v)
corespunztoare la cel puin trei valori cunoscute ale
concentraiei de substrat (1/[S]).
Dreapta stabilit experimental intersecteaz
axa 1/v n punctual 1/Vmax;
prin prelungirea ei, dreapta intersecteaz
axa abscisei n punctul 1/KM,
obinndu-se astfel grafic valoarea KM .

KM . 1
1
1
(18)
+
=
v
[S]
Vmax
Vmax

Atunci cnd x = 0 i y = 0,
se determin coordonatele la origine.
pentru y = ax + b, atunci cnd y = 0 1/v = 0, ecuaia (18)
devine:
KM 1
1
=
Atunci cnd x = 0, deci 1/[S] = 0, relaia (18) devine:
[S]
V
V
max

max

1
=
[S]

1
Vmax
KM
Vmax

=-

1
KM

1
v

1
Vmax
59

Semnificaia biochimic a constantei Michaelis-Menten (KM)

KM este un parametru cinetic, practic i util pentru caracterizarea unei enzime;
- este o caracteristic a fiecrei enzime, independent de concentraia de enzim;
- se exprim n uniti de concentraie de substrat (moli/litru).
Valorile KM variaz :
n funcie de structura substratului ;
n funcie de pH-ul mediului de reacie ;
independent de concentraia enzimei.

E + S

k+1

ES

k+2

E + P

k-1

k -1 k 2
KM
k 1

KM este o constant ce poate fi determinat practic din datele experimentale

Pentru o reacie enzimatic simpl, KM red capacitatea de disociere a lui ES n E i S.
KM red tria legturii ntre E i S.
1/KM reprezint n prim aproximaie afinitatea enzimei pentru substratul su.
valori mici ale KM, (1/KM mare) => afinitate mare a enzimei pentru substrat (10-5 - 10-8 mol/L) ;
valori mari ale KM (1/KM mic) => afinitate mic (legturi slabe ntre E i S) (10-1 - 10-2 mol/L).
60

Valorile constantelor Michaelis-Menten pentru unele enzime

Denumirea
enzimei
Alcool
dehidrogenaza

Lactat
dehidrogenaza
izoenzima H4

Codul EC

Sursa biologic

1.1.1.1

Drojdie

1.1.1.27

Inim de bou
Bacillus subtilis

Aspartat
2.6.1.1
aminotransferaza

Inim de porc

Pepsina

Mucoasa
stomacal
porc

3.4.23.1.

Substrat
Etanol
NAD+
Acetaldehid
NADH
Lactat
NAD+
Piruvat
NADH
Lactat
NAD+
Piruvat
NADH
L-aspartat
2-oxoglutarat
Oxalacetat
L-glutamat
Acetil Lalanildiiodtirozina
Acetil L-fenilalanil-Lfenilalanin

KM (M)
1,3 x 10-2
7,4 x 10-5
7,8 x 10-4
1,0 x 10-2
1,7 x 10-2
1,0 x 10-4
1,4 x 10-4
2,4 x 10-5
3,0 x 10-2
9,0 x 10-4
8,0 x 10-4
6,5 x 10-5
3,9 x 10-3
4,3 x 10-4
8,8 x 10-5
8,9 x 10-3
7,5 x 10-5
4,3 x 10-4
61

Pentru multe enzime valoarea KM = 10-2 - 10-8 M

n cinetica enzimatic se utilizeaz i o alt constant, notat Kcat care
se definete prin raportul :
v
K cat max
[E]T - concentraia totala de enzim
[E]T
Constanta catalitic (Kcat) red numrul de transformri substrat => produs pe
care fiecare centru activ le catalizeaz intr-o unitate de timp (turnover).

Cunoscnd valorile i semnificaiile lui KM i Kcat se poate calcula raportul KM/Kcat,

raport care red eficiena catalitic a enzimei.
Enzima

Substratul

KM (M)

Kcat (S-1)

Kcat / KM

Acetil colinesteraza

Acetil colin

9,5 x 10-5

1,4 x 104

1,5 x 108

Anhidraza carbonic

CO2

1,2 x 10-2

1,0 x 106

8,3 x 107

Anhidraza carbonic

HCO3-

2,6 x 10-2

4,0 x 105

1,5 x 107

Catalaz

H2O2
Esterul etilic al
N-acetil-glicinei

2,5 x 10-2

1,0 x 107

4,0 x 108

4,4 x 10-1

5,1 x 10-2

1,2 x 10-1

Fumaraz

Fumarat

5,0 x 10-6

8,0 x 102

1,6 x 108

Ureaz

Uree

2,5 x 10-2

1,0 x 104

4,0 x 105

Chimotripsin

Medicamentele
influeneaz
viteza reaciilor
enzimatice i
eficiena
catalitic a
enzimelor
62

FACTORII CARE INFLUENEAZ VITEZA UNEI REACII ENZIMATICE

1. Temperatura mediului de reacie

2. pH-ul mediului de reacie
3. Concentraia enzimei
4. Concentraia substratului
5. Efectorii enzimatici - activatori
- inhibitori

63

EFECTORII ENZIMATICI DEFINIIE

Se numesc efectori enzimatici substanele care pot mri sau

micora activitatea catalitic a unei enzime, deci care pot
accelera sau respectiv diminua viteza unei reacii enzimatice.

- activatori
- inhibitori

64

EFECTORII ENZIMATICI
1.

Activatorii enzimatici

substane nespecifice;
natur anorganic sau organic;
capabili s accelereze viteza unei reacii enzimatice.

Tipuri de de mecanisme de activare enzimatic

1. Activarea prin aciunea protectoare a unor substane asupra enzimelor
2. Activarea prin favorizarea legturii dintre enzim i substrat
3. Activarea prin favorizarea trecerii unor enzime din starea inactiv (zimogene,
proenzime) n forma catalitic activ
4. Activarea enzimelor cu rol reglator prin adenozin monofosfat ciclic (AMPciclic,
AMPc).
5. Activarea prin control genetic

65

Tipuri de mecanisme de activare enzimatic

1. Activarea prin aciunea protectoare a unor substane asupra enzimelor:
Exemplu: cisteina i glutationul redus (GSH)
gruprile SH libere = aciune activatoare, protectoare a gruprilor SH eseniale,
situate n centrul activ al unor enzime;
unele vitamine: tocoferoli, filochinone, acid ascorbic protejeaz multe enzime
de aciunea toxic a peroxizilor lipidici care apar uneori n cursul metabolismului.

66

2. Activarea prin favorizarea legturii dintre enzim i substrat.

Unii ioni metalici pot nlesni formarea complexului ES prin diferite mecanisme:
Exemple:

meninerea substratului n centrul catalitic al enzimei: ionii de magneziu (Mg2+) n cazul

pirofosfatazei ,favorizeaz legtura dintre enzim i substrat;
ali ioni metalici pot fi chiar cofactori enzimatici:

ATP (adenozin trifosfat) aza, fosfotransferazele, fosfohidrolazele activate de

Mg2+;
amilaza (de origine animal) activat de Na+ i anionul clorur, (Cl-);

tirozinaza, ceruloplasmina, citocrom oxidaza activate de Cu2+;

alcool dehidrogenaza, glutamat dehidrogenaza, carboxi-peptidaza, anhidraza
carbonic activate de Zn2+;

enzimele din procesul coagulrii - activate de Ca2+;

citocromii, peroxidaze, catalaza activate de Fe2+ sau Fe3+;
arginaza activat de Mn2+;
67

3. Activarea prin favorizarea trecerii unor enzime din starea inactiv (zimogene,
proenzime) n forma catalitic activ.
Mecanismul: hidroliza unor legturi peptidice specifice.
Are loc nlturarea unui inhibitor, i demascarea centrului catalitic.

Exemplu:
Proenzimele inactive (digestive) sunt convertite la enzime active prin proteoliz
limitat (pepsina, chimotripsina, tripsina, enzimele coagulrii sngelui, fibrinolizei)

Enterokinaz
Tripsinogen (activator)
(inactiv)

Tripsin activ + Inhibitor

68

4. Activarea enzimelor cu rol reglator prin adenozin monofosfat ciclic (AMPciclic, AMPc).
Exemplu:
Protein kinazele, enzime cu rol n fosforilarea unor protein-enzime din interiorul celulei.
Enzime formate din 4 subuniti :
- 2 subuniti catalitice care cuprind situsul activ;
- 2 subuniti reglatoare care au un centru de fixare pentru AMP ciclic
AMPciclic (AMPc) se formeaz din ATP prin activarea enzimei adenilat-ciclaz
O
HO

OH

OH

O
HO

CH2

O
HO

NH2

NH2

adenilat ciclaza
EC 4.6.1.1

5'

CH2

PPi

3'

OH

OH

OH

OH
adenozin trifosfat (ATP)

AMP ciclic

69

Mecanismul de activare enzimatic a protein kinazei A sub aciunea AMPc

Enzima (form inactiv) + AMP ciclic

Enzima n form + subunitatea

reglatoare
activ
(subunitatea catalitic)

70

EFECTORII ENZIMATICI
2. Inhibitorii enzimatici

Substane care prin prezena lor n mediul de reacie diminueaz sau

anihileaz activitatea enzimelor.
Studiul inhibiiei enzimatice - importan teoretic i practic.
Din punct de vedere:
- biochimic
informaii utile asupra specificitii de substrat a enzimelor;
studiul grupelor funcionale din centrul catalitic al enzimei;
studiul grupelor funcionale ce intervin n meninerea conformaiei active
specifice a enzimei.
- fiziologic - informaii privind mecanismele de reglare a proceselor fiziologice

- farmacologic, patologic i toxicologic, o serie de inhibitori enzimatici sunt

utilizai n toxicologie - ca antidoturi, i n patologie - ca medicamente care s
moduleze unele procese declanatoare de dezechilibre ce produc diverse
maladii.
71

CLASIFICAREA INHIBIIEI ENZIMATICE

Inhibiie ireversibil
I. Dup cinetica reaciei enzimatice
Inhibiie reversibil
II. Dup mecanismul inhibiiei

Inhibiie prin exces de substrat

Competitiv
Necompetitiv
Mixt
(noncompetitiv)

Inhibiie prin analogi structurali

ai substratului

Inhibiie prin ageni complexani

Inhibiie prin legare covalent a
inhibitorilor de enzime
Inhibiie alosteric
Inhibiie "feed-back"
(retroinhibiie)
Inhibiie prin control genetic
(represie enzimatic)

72

CLASIFICAREA INHIBIIEI ENZIMATICE

Inhibiie ireversibil
I. Dup cinetica reaciei enzimatice

Inhibiie reversibil

Competitiv
Necompetitiv
Mixt
(noncompetitiv)

73

INHIBIIA IREVERSIBIL = INACTIVARE

otrvuri enzimatice sau otrvuri catalitice
Caracteristicile inhibiiei ireversibile:
legare covalent (deci puternic) de centrul catalitic al enzimei.
aciune lent, este necesar un anumit timp de contact dintre inhibitor i
enzim.

Nu este afectat de diluia mediului de reacie i nici de concentraia de

enzim.
inhibiie NESPECIFIC.
Exemple:
toate enzimele care au n centrul catalitic aminoacizi cu gruparea SH vor
fi inhibai ireversibil de anumii inhibitori.

enzimele care au n centrul catalitic serina, deci un aminoacid cu gruparea

OH vor avea ca inhibitori ireversibil ali compui.

74

Exemple de inhibitori ireversibili cu proprieti alchilante:

Monoiod-acetamida este un agent inhibitor cu proprieti
alchilante pentru fosfataze.
Alchileaz gruprile SH din structura unor centri activi ai
enzimelor.

O
Enzim - CH2-SH

I-CH2-C

NH2

O
Enzim-CH2-S-CH2-C

NH2

75

Diizopropil-fluorofosfat (DFP sau DIFP) - compus organofosforic

(pesticid).
Inhib prin fosforilare enzimele care au n centrul activ serina.

Exemple: acetilcolinesteraza, chimotripsina.

DFP este un toxic nervos : inhib acetilcolinesteraza => blocarea
transmiterii influxului nervos => paralizie.

76

INHIBITORII REVERSIBILI

Caracteristici generale:

n general, prin dializ se poate elimina inhibitorul;

se poate restaura activitatea enzimatic;
este un proces rapid;
nu este o inhibiie specific
competitiv

exist mai multe modaliti de inhibiie reversibil

necompetitiv
noncompetitiv

E + I

kI

(denumit i mixt)

EI

kI - constanta de inhibiie
77

INHIBIIA COMPETITIV Caracteristici generale

inhibitorul se fixeaz pe acelai centru catalitic al enzimei;

inhibitorul intr n competiie pentru centrul activ al enzimei;

presupune o analogie de structur dintre substrat i inhibitor;

legtura dintre enzim i inhibitor este de aceeai natur cu cea dintre enzim
i substrat;

inhibitorul competitiv reduce numrul de molecule de enzim care leag

substratul;

se pot, deci, substitui reciproc n funcie de concentraia lor n mediul de

reacie;

deci inhibiia competitiv poate fi reversat prin creterea concentraiei

substratului;

din punct de vedere cinetic Vmax rmne constant, KM crete

78

MECANISMUL INHIBIIEI COMPETITIVE

Reaciile dintre enzim, substrat i inhibitor n cazul inhibiiei competitive

79

MECANISMUL INHIBIIEI COMPETITIVE

kI
E + I

kI =
1
v

EI

[E] [I]
[EI]

i - competitiv

v=
fr inhibitor

Vmax [S]
[I]
1
+
(
) KM + [S]
kI

1
Vmax

1
-

KM

Ecuaia Lineweaver-Brk va avea forma:

1
[S]

KM

Vmax = constant; 1/Vmax = constant; KM crete

1
v

KM
[I]
1
+
(
=
Vmax
kI

1
1
+
Vmax
[S]
80

INHIBIIA COMPETITIV

Exemplu: inhibiia competitiv a succinat dehidrogenazei

COOH

Succinat
dehidrogenaza

CH2
CH2

CH
HC

COOH

COOH

FAD
FADH2

Acid succinic

COO

COOH

Acid fumaric

CH2
CH2

COO -

CH2

CH2

COO -

COO -

COO COO 81

INHIBIIA NECOMPETITIV
(UNCOMPETITIVE INHIBITION)
Caracteristici generale:

Formarea complexului activat [ES] are loc normal

Inhibitorul se leag n alt centru catalitic dect substratul

Inhibitorul se combin numai cu complexul [ES], dnd un complex inactiv [ ESI ]

Complexul inactiv [ ESI ] se formeaz urmnd un mecanism secvenial ordonat,

plecnd numai de la complexul [ES].

Complexul [ ESI ] fiind inactiv, are loc inhibarea reaciei enzimatice, nu se mai pot
forma produi finali de reacie.

Din punct de vedere cinetic, fiecare parametru Vmax i KM este micorat prin acelai
factor,
[ I ] care depinde de concentraia inhibitorului i constanta reaciei
[1
]
de inhibiie.

Ki

Acest tip de inhibiie se ntlnete n cazul enzimelor

ce catalizeaz reacii ntre dou substrate.

82

MECANISMUL INHIBIIEI NECOMPETITIVE

Reaciile dintre enzim, substrat i inhibitor n cazul inhibiiei necompetitive

83

MECANISMUL INHIBIIEI NECOMPETITIVE

kI

ES + I

ESI

Ecuaia Michaelis-Menten devine :

1
v

i - necompetitiv
fr inhibitor

1
KM

[I]

(1+

kI

v=

KM

(1+

[I]

(1 + K )

Vmax

. [S]

Vmax

[I]
kI

+ [S]

1
[S]

KM

Vmax i KM - micorai prin acelai factor

[1

[I]
]
Ki

84

Exemplu:
Acetazolamida diuretic foarte utilizat, acioneaz inhibnd necompetitiv
enzima anhidraza carbonic la nivelul rinichiul
anhidraza
carbonic

CO2

H2O

HCO3- +

Exemplu: enzimele care necesit ioni metalici pentru activitatea lor vor fi
inhibate necompetitiv de ageni capabili s lege ionul metalic respectiv
EDTA
(etilendiamino
tetracetic)

Agent de chelare care leag reversibil Mg2+

85

INHIBIIA MIXT (denumit i NONCOMPETITIV)

(NONCOMPETITIVE INHIBITION)
Caracteristici generale:

Inhibitorul se poate lega de enzim direct, simultan cu legarea

substratului, dar se poate lega i cu complexul activat ES

Inhibitorul se leag n alt centru activ dect substratul (deci se poate lega
de enzim simultan cu substratul)

Aciunea inhibitorului nu poate fi reversibil prin creterea concentraiei

substratului
Din punct de vedere cinetic: scade vmax i KM rmne relativ aceeai

+S

ES

ESI
+I

E+P

EI
86

MECANISMUL INHIBIIEI NONCOMPETITIVE

Reaciile dintre enzim, substrat i un inhibitor noncompetitiv

87

MECANISMUL INHIBIIEI NONCOMPETITIVE

Ecuaia Michaelis-Menten devine:

. [S]

Vmax

(1+

[I]
kI

v=
i - noncompetitiv

1
v

KM

Vmax

1 +

[I]
KI

Vmax

0
-

1
KM

1
KM'

1 +

[I]
KI

[S]

)
fr inhibitor

KM

Exemplu: ionii unor metale grele:

Cu2+, Hg2+, Ag2+ i derivaii lor,
inhib unele enzime care au
grupri SH n centrul activ.

1
[S]

Scade vmax i KM rmne relativ acelai

88

CLASIFICAREA INHIBIIEI ENZIMATICE

II. Dup mecanismul inhibiiei Inhibiie prin exces de substrat
Inhibiie prin analogi structurali ai substratului
Inhibiie prin ageni complexani
Inhibiie prin legare covalent a inhibitorilor de enzime
Inhibiie allosteric
Inhibiie "feed-back" (retroinhibiie)
Inhibiie prin control genetic (represie enzimatic)

89

Inhibiia prin exces de substrat

Cnd n mediul de reacie concentraia substratului este foarte mare,

n afar de complexul activat ES, se formeaz i complexul ESS inactiv sau
mai puin activ.

Efectul inhibitor al substratului este cu att mai pronunat cu ct

concentraia acestuia este mai mare
La concentraii mari de substrat, se
depete capacitatea catalitic a
enzimei i are loc un efect invers, de
ncetinire a vitezei de reacie.

Viteza de
reactie

E+S

ES

E+P

+S
[S]

ESS

ES + S
90

CLASIFICAREA INHIBIIEI ENZIMATICE

II. Dup mecanismul inhibiiei Inhibiie prin exces de substrat
Inhibiie prin analogi structurali ai substratului
Inhibiie prin ageni complexani
Inhibiie prin legare covalent a inhibitorilor de enzime
Inhibiie alosteric
Inhibiie "feed-back" (retroinhibiie)

Inhibiie prin control genetic (represie enzimatic)

91

Inhibiia prin analogi structurali ai substratului

Exemple:
COOH
CH2
CH2
COOH

Inhibitorii de tip competitiv

ai succinat dehidrogenazei
(malonat, oxalat, glutarat)

COOH
CH2

COOH

COOH

COOH

Acidul fluorocitric inhibitor al aconitazei

COOH
CH2
HO

COOH

COOH
F

CH

HO

COOH

CH2

CH2

COOH

COOH

acid citric

acid fluorocitric

92

CLASIFICAREA INHIBIIEI ENZIMATICE

II. Dup mecanismul inhibiiei Inhibiie prin exces de substrat
Inhibiie prin analogi structurali ai substratului
Inhibiie prin ageni complexani
Inhibiie prin legare covalent a inhibitorilor de enzime
Inhibiie allosteric
Inhibiie "feed-back" (retroinhibiie)
Inhibiie prin control genetic (represie enzimatic)

93

Inhibiia prin ageni complexani

Inhibitorii complexani = substane chimice capabile de a complexa metalul din structura
unor enzime (la unele metal-enzime, metalul se afl n centrul activ al enzimei).
Exemple:
Ionul cianur pentru numeroase metalenzime:
succinat-dehidrogenaza (Fe2+)
citocromi (Fe2+)
citocromoxiaza (Fe2+, Cu2+)
Monoxidul de carbon fixeaz fierul din citocromoxidaz
Fluorurile inhib enzimele cu calciu i magneziu
EDTA (etilendiamino-tetracetat) poate complexa Mg2+ din structura a numeroase enzime
(ATP-aza, pirofosfataza).

94

Inhibiia prin legarea covalent a inhibitorilor cu enzimele

Este un tip ireversibil de inhibiie
Sunt compui care blocheaz gruprile funcionale de la nivelul centrului
activ al enzimei
Exemple:
-Agenii alchilani care blocheaz gruprile SH ale cisteinei din centrul activ
al unor enzime (ex: monoiodacetat)
- Compui care esterific gruprile OH ale serinei din centrul activ al
acetilcolinesterazei (ex: diizopropilfluorofosfatul-DIFP)
- Substanele care pot acetila gruprile NH2 ale lizinei din structura
enzimelor (ex: acidul acetilsalicilic acetileaz unele grupri NH2 din centrul
activ al ciclooxigenazei enzim din metabolismul acidului arahidonic)

95

INHIBIIA ALLOSTERIC
Efectorii allosterici
Acioneaz asupra conformaiei spaiale a enzimelor de tip allosteric
ENZIME ALLOSTERICE
Termenul de allosteriam desemneaz proprietatea caracteristic a unor
enzime de a funciona prin variaii (allo) ale conformaiei tridimensionale (steriam).

Caracteristici structurale
Sunt proteine complexe cu rol reglator n reaciile metabolice
Sunt formate din subuniti monomere identice (protomeri)
Structura cuaternar reprezint asocierea simetric a protomerilor componeni
Sunt enzime care se pot combina cu mai multe substrate, avnd mai muli centri
activi
Enzimele allosterice pot adopta n mod reversibil mai multe stri conformaionale
distincte care difer prin:
- Numr de protomeri
- Distribuia protomerilor
- Afinitatea protomerilor pentru efectorii stereospecifici

96

Reprezentarea
schematic a
inhibiiei
allosterice

Enzimele allosterice au mai multe situsuri de legare (cel puin 3 situsuri catalitice)
- un situs de tip catalitic care realizeaz transformarea propriu-zis a
substratului, i care se afl situat pe subunitatea catalitic a enzimei;
- mai multe situs-uri allosterice de care se pot lega efectorii enzimatici
(activatori sau inhibitori), situai pe subunitatea reglatoare a enzimei.
ntre situsul catalitic i cel allosteric exist anumite interacii (efect cooperant).

Legarea inhibitorului allosteric la situsul allosteric induce modificarea tridimensional

a moleculei proteinei enzimatice
Centrul activ catalitic al enzimei devine inapt pentru a fixa substratul

97

Enzimele allosterice manifest o comportare cinetic diferit de cea

postulat n teoria Michaelis Menten.

Aspectul sigmoid este atribuit

structurii cu mai muli
protomeri, a existenei mai
multor situsuri de legare
pentru fiecare molecul de
enzim ntre care se manifest
efecte de cooperare.

98

LEGAREA SECVENIAL, REVERSIBIL, A SUBSTRATULUI N MODELUL

ENZIMELOR ALLOSTERICE
Legarea primei molecule de substrat de un protomer, va induce modificri
conformaionale a protomerului vecin pentru a-l face apt s lege urmtoarea
molecul de substrat (efect cooperant). Procesul decurge pn cnd se leag
toate moleculele de substrat

Mecanismul de aciune al unor

medicamente are la baz efectul
allosteric asupra unor enzime
99

Exemplu de enzime allosterice:

Protein kinazele de tip A, C, G care transfer grupri fosfat de la molecula
de ATP la gruprile OH ale unor aminoacizi specifici din structura

anumitor proteine (serin, treonin, tirozin), cataliznd astfel reacii de

fosforilare a unor enzime
NH2

O
HO

OH

O
OH

HO

OH

HO

OH
O

ADP

OH

O
Rest de serin, treonin
sau tirozin din structura
proteic a unei enzime

Protein
kinaze

CH2

Protein-enzim
fosforilat

OH

OH

adenozin trifosfat (ATP)

Deci rezult ca produs de reacie protein-enzime n stare fosforilat, care pot

reprezenta formele active ale acestor enzime, care intervin n numeroase
procese energetice, de cretere i difereniere celular.
100

Enzima
Modul de aciune al protein kinazei A i
al reglrii sale allosterice de ctre AMPc
(mesager secundar intracelular)

101

Inhibiia de tip feed-back (retroinhibiia)

Reprezint un caz special de inhibiie allosteric

Const n inhibiia activitii primei enzime de ctre produsul final al

lanului metabolic din care face parte:

E1

E2

E3

E4

E5

Acumularea excesiv de produs final F n celule, determin printr-un

mecanism allosteric, inhibiia enzimei E1 care catalizeaz transformarea
substanei A n substana B.
Exemplu: Hemul acumulat (n procesul de biosintez a hemoglobinei) i
poate inhiba propria biosintez.

102

Importana inhibiiei de tip feed-back

Aceste mecanisme sunt importante n reglarea metabolismului

intermediar celular (enzima E1 se numete enzim reglatoare de proces).

Se permite astfel meninerea unui echilibru dinamic ntre produii de

catabolism i procesele de biosintez.

Aceasta dovedete o bun strategie din partea celulei

Are loc reglarea unei ci metabolice la nivelul primei etape, economisind

la maxim metaboliii

103

Inducie i inhibiie enzimatic prin control genetic

1961, F. Jacob i J. Monod

Enzimele pot fi prezente n celul

n cantiti aproximativ constante
=
exprimare
constitutiv
(enzimele
lanului
respirator
mitocondrial)
Anumite enzime pot fi prezente n
mod obinuit sub forma unei
exprimri mai slabe (sau chiar s
nu fie deloc exprimate) dar a cror
biosintez s creasc semnificativ
(chiar de mii de ori) n anumite
condiii, n special atunci cnd
substratul lor este prezent n exces
= enzime inductibile.

104

Mecanismul inhibiiei prin produs final

105

Inhibiie i inducie enzimatic prin control genetic Importan practic

Unele medicamente pot induce biosinteza de enzime necesare propriei lor

metabolizri => Importan farmacologic i toxicologic- st la baza fenomenului
de obinui la medicamente i a toxicomaniei.

Inducia enzimatic st i la baza fenomenului de rezisten la medicamente.

Ca rspuns la lezrile celulare cauzate de expunerea la compui xenobiotici

(medicamente, compui toxici poluani), celulele elaboreaz mecanisme de aprare
adaptativ ce includ, ntre altele, i inducia unor gene specifice care codific n
special biosinteza unor enzime de biotransformare.

106

Medicamente
inhibitori enzimatici

107

Medicamente inhibitori enzimatici

Inhibiia

enzimatic

mecanismelor biochimice

este

implicat

explicarea

de aciune ale unor medicamente la

nivel molecular, celular, n esuturile int.

108

Clasificarea medicamentelor inhibitori enzimatici

Medicaia antihipertensiv (anti-HTA)
- inhibitori ai enzimei de conversie .............................captopril, enalapril, perindopril
Medicaia antiinflamatoare
-inhibitori ai fosfolipazei A2 .........................antiinflamatoare steroidiene, AIS
-inhibitori ai ciclooxigenazelor (I i II) .......... antiinflamatoare nesteroidiene, AINS
Medicaia antiastmatic
-inhibitori de lipooxigenaz
Medicaia hipocolesterolemiant
-inhibitori ai HMG-CoA reductazei ...............statinele
Medicaia antigutoas
-inhibitori ai xantinoxidazei ................................................alopurinol
Medicaia bacteriostatic. Sulfamidele bacteriostatice
-inhibitori ai enzimei de sintez a acidului folic .................sulfamidele antibacteriene
Medicaia anticanceroas
- inhibitori de replicaz ......................................6-mercaptopurina
- inhibitori de timidilat sintetaz .........................5-fluorouracil
- inhibitori de dihidrofolatreductaz ....................metotrexat
- inhibitori de amidotransferaz...........................azaserina
- inhibitori ai ADN-topoizomerazelor (I i II)......... etoposid
109

Clasificarea medicamentelor inhibitori enzimatici

Medicaia antiviral
Anti-HIV
-inhibitori ai revers transcriptazei .......................azidotimidin (AZT)
-inhibitori ai proteazei .........................................amprenavir
- inhibitori ai integrazei ........................................zintevir
Antivirale n general
- inhibitori ai proteinkinazei virale..........................................maribavir.
- inhibitori ai ADN-polimerazei virusului herpetic ..........aciclovir (zovirax)
-inhibitori ai neuraminidazei virusului gripal............oseltamivir, zanamivir
Medicaia anti-Parkinson
- inhibitori ai DOPA-decarboxilazei........................................carbidopa
- inhibitori ai monoaminoxidazei izoforma B.......................selegilina
-inhibitori ai catecol-O-metiltransferazei (COMT) ................tolcapon
Medicaia diuretic
- inhibitori ai anhidrazei carbonice ............................acetazolamida

110

Medicaia antihipertensiv

Hipertensiunea arterial (HTA):

Tensiunea arteriala sistolica > 140mmHg i/sau
Tensiunea diastolica > 90mmHg.

Inhibitori ai enzimei de conversie a angiotensinei

(Angiotensin Converting Enzyme ACE)
ACE catalizeaz reacia
de transformare a angiotensinei I
(decapeptid) n angiotensin II (octapeptid).
O

OH

NH2
O

N
H

O
N

OH
lisinopril

CH3
HS

OH
captopril

111

Inhibitori
ACE

112

Medicaia antiinflamatoare

Inhibitori ai enzimelor care intervin n

formarea factorilor proinflamatori.

Principalii factori biologici endogeni

proinflamatori sunt prostaglandinele,
prostaciclinele, tromboxanii,
leukotrienele, biomolecule care fac
parte din categoria eicosanoizilor
derivai din acidul arahidonic.
Semnele clinice ale inflamaiei: calor,
tumor, dolor, rubor, functio laesa.

113

Acizi grasi eseniali

fosfolipide membranare
Stimuli
Fosfolipaza A2
Fizici, chimici,biologici
COOH

Lipooxigenaza

COX 1 i COX 2

Acid 5,8,11,14
eicosatetraenoic
(substrat fals)

LEUCOTRIENE

PGG 2

O
prostaciclin-sintaza O
PGI 2

COOH
OH PGH 2

Tromboxan-sintaza
TXA2

hidroliza
izomeraze
PGE 2
oxidare

PGF
PGF

metaboliti urinari

reductaze
PGF

izomeraze
PGD 2

TXB 2

PGE-Metabolit
PGD-Metabolit
PGF-Metabolit

114

1. Inhibitori ai fosfolipazei A2.

Fosfolipaza A2 : eliberarea, din fosfolipidele membranare, a acidului arahidonic
care este substrat pentru formarea compuilor proinflamatori.
Medicamente cu structur corticosteroidic (antiinflamatoare steroidiene, AIS),
foarte eficiente dar cu numeroase efecte adverse.
Medicamente utilizate n afeciuni inflamatorii severe: poliartrit reumatoid,
reumatism poliarticular acut, artrita acut gutoas, etc.
2. Inhibitori ai ciclooxigenazelor (I i II) din cascada acidului arahidonic.
Compui cu structuri diverse non-steroidice (antiinflamatoare nesteroidiene, AINS).
Ciclooxigenaza = enzim ce determin apariia unor substane pro-inflamatoare. 2
izoforme: COX-1, enzim constitutiv i COX-2, enzim inductibil n timpul inflamaiei
(accentueaz rspunsul inflamator).
=> dou categorii de AINS:
- inhibitori COX neselectivi (denumite AINS clasice), medicamente ce inhib att COX1, ct i COX-2: acidul acetilsalicilic, diclofenac, indometacin,ibuprofen, piroxicam, etc.
- inhibitori selectivi COX-2: celecoxib, rofecoxib, parecoxib, etc.
SO2NH2
F3 C

CH3
celecoxib

115

Mecanismul prezumtiv de aciune al acidului

acetilsalicilic, inhibitor COX neselectiv

116

Medicaia antiastmatic

Astmul bronic este o afeciune

inflamatorie a cilor respiratorii, cu
caracter cronic, care se manifest
clinic, periodic, prin crize de dispnee
expiratorie, cu senzaie de sufocare.

Medicamente care reduc

intensitatea i frecvena crizelor de
astm bronic: inhibitorii selectivi ai
enzimei 5-lipoxigenaz - zileuton
ce catalizeaz biosinteza leucotrienelor
(LT) bronhoconstrictoare, din acid
arahidonic.
Inhibarea formrii leucotrienelor
conduce la bronhodilataie, efect
antiastmatic selectiv.
OH O
S
CH-N-C-NH2
CH3
zileuton

117

Hipocolesterolemiante.
Statinele
- Statinele = compui ce inhib competitiv enzima
3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductaza
(HMG-CoA reductaza), care intervine n biosinteza
colesterolului cataliznd transformarea HMG-CoA n acid
mevalonic.
- Principalii compuii inhibitori ai HMG-CoA reductazei
aprobai pentru utilizare terapeutic sunt statinele:
atorvastatina,
fluvastatina,
HO
O
lovastatina,
O
simvastatina,
O
rosuvastatina
H3C
H3C

O H
CH3

H3C
simvastatin

CH3

HO
O

O
H3C

O H
CH3

CH3

H3C
lovastatin

118

Guta este o maladie cronic,

determinat de dezechilibrul
ntre formarea acidului uric i
eliminarea sa.

Medicaia antigutoas

Medicamentele uricoinhibitorii micoreaz concentraia seric a

acidului uric prin inhibarea biosintezei acestuia.
Alopurinolul = analog structural al hipoxantinei (precursor n
biosinteza acidului uric), ce inhib xantinoxidaza, enzim ce
catalizeaz principale etape din catabolismul nucleotidelor purinice.
O

O
N

HN
N

N
H

xantin-oxidaza

HN
O

N
H

N
H

hipoxantina

2 mecanisme:
competitiv
ca analog structural;
necompetitiv
prin intermediul
aloxantinei, metabolit
activ al alopurinolului.

xantina

HN
O

O
N
H

N
H

acid uric

acumulare

HN

N
N

xantin-oxidaza

H
N

GUTA

N
H

alopurinol
119

Medicaia bacteriostatic.
Sulfamidele bacteriostatice

=> efect antimicrobian

Sulfamidele = antagoniti structurali ai acidului p-aminobenzoic

Medicamente care inhib enzimele care intervin n sinteza acidului folic, n

mod special dihidropteroat sintetaza, enzima ce catalizeaz ncorporarea
acidului p-aminobenzoic n acid dihidropteroic, precursor al acidului folic.
COOH
SO2NH2

NH2
acidul para-amino-benzoic

NH2
sulfanilamida
120

Anticanceroasele (citostaticele) sunt

substane capabile s reduc volumul
tumorilor, s amelioreze starea clinic, s
prelungeasc supravieuirea sau s induc
vindecarea n afeciunile canceroase.

Medicaia
anticanceroas

Analogii structurali ai bazelor azotate purinice sau pirimidinice, medicamente ce

blocheaz activitatea enzimelor ce intervin n biosinteza acizilor nucleici, deci biosinteza
proteic n celulele tumorale. Astfel, prin acest mecanism se oprete creterea tumoral
(aciune antineoplazic).
1. Inhibitori ai enzimei
dihidrofolatreductaza:
medicamentele analogi
structurali cu acidul folic
(coenzim n reacii de metilare
i factor de cretere celular).

NH2

CH3
N

CH2-N

COOH

C - NH - CH

10

H2N

CH2
CH2
COOH

metotrexatul al acidului folic

metotrexatul = antimetabolit
121

2. Inhibitori ai replicazei din biosinteza ADN.

medicamentele analogi structurali ai bazelor azotate purinice: 6-mercaptopurina,
6-tioguanina, cladribina, pentostatin, azouridina, bromodeoxiuridina, etc.
O

SH

SH

H
N

N
N

mercaptopurina

H2N

HN

H
N

N
N

HO-CH2

Br

HN

HO-CH2

tioguanina
HO

OH

HO
bromodeoxiuridina

azouridina

3. Inhibitori ai timidilat-sintetazei din

biosinteza ADN.
medicamentele analogi structurali ai
bazelor azotate pirimidinice:
5-fluorouracil,
floxuridina,
3azido-2,3-dideoxi timidina (denumit
zidovudin, azidotimidin sau AZT), etc.

CH3

HN
N

HOH2C

3'

2'

N
N+
N3'-azido-2',3'-dideoxi timidina
(AZT)

122

COOH

4. Inhibitori ai amidotransferazei, enzim care intervine

n biosinteza nucleotidelor purinice.
Azaserina - medicament analog structural al glutaminei

5. Inhibitori ai ADN-topoizomerazelor (I i II), enzime

responsabile de clivarea i refacerea lanurilor de ADN,
medicamente:
etoposid, teniposid medicamente ce formeaz un complex
cuaternar cu topoizomeraza II, producnd rupturi ireversibile la
nivelul ADN-ului dublu catenar;
topotecan, irinotecan medicamente ce formeaz un
complex cuaternar cu topoizomeraza I.

CH2
Cl

azaserina
H
O
O
HO

CH3

OH

CH3

HO

CH2
O

H 3C

CH2-N

HC - NH2

N
O

O
H3C-H2C

OH O

H3C

topotecan

CH3

OH
etoposid

123

Substane biologic active care intervin

n sistemele enzimatice implicate n
multiplicarea viral.

Medicaia antiviral

1. inhibitori ai revers transcriptazei virusului imunodeficienei umane (HIV): azidotimidin

(AZT), abacavir, didanozin, lamivudin, etc. Aceste medicamente sunt analogi structurali ai
bazelor pirimidinice din structura ADN.
2. inhibitori ai integrazei HIV: zintevir.
3. inhibitori ai proteazei HIV: amprenavir, atazanavir, ritonavir, nelfinavir.
4. inhibitori ai proteinkinazei virale: maribavir.
5. inhibitori ai ADN-polimerazei virusului herpetic: aciclovir (zovitax), penciclovir, ganciclovir.
6. inhibitori ai neuraminidazei virusului gripal: oseltamivir, zanamivir.
O
HN

H2N

HO-H2C

CH3

HN
N

HN

HN

H2N

CH2O-CH2-CH2-OH

zalcitabina (ddc)

HO-H2C

stavudina

HO-H2C

didanozina (ddi)

9-[(2-hidroxietoxi) metil] guanina

aciclovir (zovirax)

124

Sindromul Parkinson se caracterizeaz, n

principal, prin scderea concentraiei
neuronale a neuromediatorului
dopamin

Medicaia anti-Parkinson

LEVODOPA = precursorul metabolic fiziologic al dopaminei, fiind

folosit ca medicaie de substituie n parkinsonism.
Reacia este catalizat de DOPA-decarboxilaz i are loc la
nivel periferic dar i la nivel central.
HO
Asociat cu LEVODOPA, se administraz:

OH
N
H

1. Inhibitori ai dioxifenilalanin (DOPA)-decarboxilazei HO

benserazida i carbidopa (inhib decarboxilarea L-DOPA n
periferie fr a o modifica la nivel central)
OH

H
N

benserazid

CH2
H2N CH
COOH
L - DOPA

OH
HO

DOPA- Decarboxilaza

CO2

CH2
CH2-NH2
Dopamin

OH
O

OH
OH

NH2

HO

HN

OH
CH3
NH2

carbidopa

125

2. Inhibitori ai monoaminoxidazei izoforma B (MAO-B): selegilina =

inhibitor selectiv i ireversibil al enzimei MAO-B, enzim ce metabolizeaz
dopamina;
CH3
N
CH
CH3
selegilina

3. Inhibitori ai catecol-O-metiltransferazei (COMT) - tolcapon, entacapon =

inhibitori selectivi i reversibili ai COMT, enzim ce metabolizeaz, de asemenea,
dopamina.

126

NOMENCLATURA I CLASIFICAREA

ENZIMELOR

127

Istoric privind nomenclatura enzimelor

I ETAP : denumiri vechi - nu au terminaia az
Pepsina, tripsina, chimotripsina
Ptialina din saliv (amilaza)
Emulsina din intestin (lipaza)
n general sunt hidrolaze, enzime cu rol n digestie.
De exemplu: amilaza are ca denumirea tiinific sistematic -1,4-glucan4-glucan hidrolaza, iar amilaza: -1,4-glucan-malto-hidrolaza.
II ETAP: se introduce terminaia -aza, la denumirea substratelor care se
transform.
De exemplu: ureaza, amilaza, arginaza, fumaraza, tirozinaza, hexokinaza,
lipaza, etc.
Aceste denumiri nu explic tipul de reacie care are loc.
128

lll ETAP: Apar denumiri de enzime care cuprind:

- denumirea substratului
- tipul de reacie
- terminaia aza
Exemplu : Succinat dehidrogenaza (SDH)
Lactat dehidrogenaza (LDH)
Malat dehidrogenaza (MDH)
Piruvat decarboxilaza
Piruvat carboxilaza
Precizeaz tipul reaciei dar sunt incomplete.
Sunt denumiri convenionale.
Denumiri de lucru
Se precizeaz donorul de hidrogen (exemplu: succinat), dar nu se precizez acceptorul de
H.
IV ETAP: n 1957-1961 Uniunea Internaional de Biochimie (din cadrul IUPAC), Comisia
de Enzimologie (EC) a elaborat o nomenclatur sistematic precum i o clasificare a
enzimelor bazat pe tipul de reacie chimic catalizat de o anumit enzim.
Aceast abordare a fost determinat de creterea continu a numrului de enzime
izolate i caracterizate din punct de vedere structural i al mecanismului de aciune.
Deci din 1961 enzimele sunt grupate in 6 clase, fiecare enzim avnd numere de cod
(denumire ,,EC") = DENUMIRE SISTEMATIC

129

Conform recomandrilor acestei Comisiei de Enzimologie (EC), denumirea unei

enzime trebuie s cuprind detalii privind:
-numele substratului asupra cruia acioneaz enzima (cu evidenierea
donorului i a acceptorului de electroni, de hidrogen, sau de grupri funcionale,
etc);
-numele tipului de reacie catalizat;
-sufixul az.
Deci numrul de cod al fiecrei enzime (EC) este alctuit din 4 numere:
- primul numr : codul pentru clasa de enzime (16)
- al doilea numr : codul pentru subclas (substratul donor de grupri) (199)
- al treilea numr: codul pentru sub subclas (acceptorul acelei grupri 199)
-al patrulea numr : locul individual al enzimei.

Acest tip de nomenclatur este deosebit de precis, descriptiv i

informativ, permind introducerea de enzime nou descoperite.

130

CLASIFICAREA ENZIMELOR CONFORM COMISIEI DE ENZIMOLOGIE (EC)

EC : 1
Oxidoreductaze
Reacii de transfer de electroni sau de electroni i de protoni (deci de hidrogen) termen
mai general echivaleni reductori.
EC : 2
Transferaze
Reacii de transfer a unei grupri funcionale de pe un donor pe un acceptor.
EC : 3
Hidrolaze
Reacii de hidroliz a biomoleculelor, adic reacii de fixare a moleculei de ap pe o legtur
specific substratului care se scindeaz. Determin ruperea unei legturi cu ajutorul unei
molecule de ap.
EC : 4
Liaze
Reacii de rupere a unei legturi carbon-carbon, carbon-azot, carbon-oxigen etc.
EC : 5
Izomeraze
Reacii de izomerizare, epimerizare, racemizare, conversie cis-trans, adic, altfel spus, reacii
de tranfer de grupri n interiorul aceleiai molecule.
EC : 6
Ligaze
Reacii de formare a unor legturi carbon-carbon, carbon-azot, carbon-oxigen, etc. Sunt
reacii consumatoare de energie (de molecule ATP sau de alt nucleotid cu legturi
macroergice).
131