OBŢINEREA PROTEINELOR DIN ETANOL

CU AJUTORUL DROJDIILOR

Proteinele din drojdii dezvoltate pe etanol reprezintă o gama largă de produse intermediare
între medicamente şi alimente, care au avantajul că pot fi utilizate timp îndelungat fără efecte
secundare. Aceste produse au efect benefic asupra organismului şi intervin în echilibrarea
metabolismelor dereglate, mai ales în bolile de nutriţie, completând astfel disponibilităţile
terapeutice ale medicinei tradiţionale.
Utilizarea etanolului ca substrat pentru obţinerea de biomasă proteică cu ajutorul drojdiilor
prezintă o serie de avantaje:
- această materie primă este disponibilă cantitativ, calitativ şi accesibilă economic (are
un preţ de cost scăzut);
- etanolul nu ridică probleme de acceptabilitate de către publicul larg, el fiind utilizat în
mod curent ca ingredient alimentar;
- pe acest substrat se pot obţine în timp relativ scurt şi în flux continuu producţii mari, la
un preţ de cost accesibil;
- valoarea nutritivă a biomasei obţinute este ridicată.
Principalul dezavantaj al etanolului îl constituie efectul inhibitor pe care îl manifestă la
concentraţii relativ ridicate, necesare pentru rentabilizarea procesului. Din acest motiv, la nivel
industrial se folosesc tulpini selecţionate de drojdie, în general specii din genurile Saccharomyces
şi Candida, se operează în condiţii aseptice, cu concentraţii limitate de substrat şi cu adaosuri în
bioreactor.
Bioprocesul de obţinere a proteinelor din etanol cu ajutorul drojdiilor este aerob, iar la
scară industrială se preferă operarea în sistem continuu, în care substratul (etanolul), substanţele
nutritive (amoniacul, sărurile minerale, microelemente, factori de creştere) şi aerul sunt
transformate în masă celulară, dioxid de carbon, apă şi căldură.

Microorganism şi medii de cultură

- tulpină selecţionată de Saccharomyces cerevisiae din Colecţia de Microorganisme

Industriale - Timişoara, pe mediu de întreţinere YPG cu etanol 0,25 ml%;
Caracterizarea microbiologică a tulpinii Saccharomyces cerevisiae:
• caractere morfologice: celule rotunde sau ovoide, Gram pozitive, imobile;
• caractere fiziologice: facultativ aerob, fermentează zaharurile, se dezvoltă în mediu etanol
şi acetat, la pH acid şi temperaturi de 26-310C;
• caractere de colonie: pe mediu agarizat coloniile sunt mari, rotunde, cu profil convex şi
contur întreg, au suprafaţa alb-crem, netedă, ceroasă, mată şi consistenţă grasă.
- mediul pentru preinocul are următoarea compoziţie (g/v);
- Extract de porumb 0,2%
- H3PO4 0,3%
 - KCl 0,3%
- MgSO4 0,1%
- CaCl2 0,05%
- Etanol 0,25 ml % (v/v)
- Agar 2%
pH (corectat cu soluţie amoniacală 25%) 4,5
Se prepară 100 ml mediu solid agarizat, care se repartizează în eprubete şi se corectează
pH-ul. După sterilizare la 1210C, timp de 20 minute, se răceşte la 45oC, şi se adaugă în mod aseptic
0,25 ml etanol. Mediul astfel preparat se solidifică în eprubete în poziţie înclinată. Se verifică
eficienţa sterilizării prin incubare la termostat, la 30-370C, timp de 48 de ore.
- mediul pentru inocul conţine (g/v):
- Extract de porumb 0,2%
- (NH4)2SO4 0,3%
- KH2PO4 0,3%
- MgSO4 x 7H2O 0,05%
- FeSO4 x 7H2O 0,001%
- Soluţie de microelemente (sterilă) 0,1 ml % (v/v)
- Etanol 0,25ml% (v/v)
pH (corectat cu soluţie amoniacală 25%) 4,5
Se prepară 400 ml mediu, care se repartizează în 4 flacoane Erlenmayer cu capacitatea de
500 ml (câte 100 ml mediu/flacon). Se sterilizează la 1210C timp de 30 minute, se răceşte la 280C
şi apoi se adaugă soluţia de microelemente (sterilizată separat prin filtrare cu filtru bacteriologic
Millipore) şi etanolul. Se corectează pH-ul şi se verifică sterilitatea mediului.
- mediul de biosinteză are o compoziţie similară cu a mediului pentru inocul.
Se prepară 4 l de mediu (fără etanol şi microelemente) cu pH corectat la valoarea 4,5, care
se sterilizează la 1210C timp de 30 minute şi se răceşte la temperatura de lucru (280C). Apoi se
adaugă 4 ml din soluţia de microelemente (sterilă) şi 10 ml de etanol. Pe parcursul bioprocesului
se continuă adăugarea de antispumant (1-2 ml) şi etanol. Adaosurile se realizează în condiţii sterile,
sub protecţie de flacără.

Faza de bioproces
Preinocul: Din cultura-stoc se însămânţează prin epuizarea ansei 8 eprubete care conţin
mediu cu etanol 0,25ml% (v/v). Apoi tulpina Saccharomyces cerevisiae este dezvoltată timp de
48 de ore, la 280C.
Prin spălarea cu mediu lichid pentru inocul a eprubetelor se obţine o suspensie de celule
care reprezintă preinoculul. Preinoculul se verifică microscopic, pe preparate lamă/lamelă sau fixe.
Inocul: Mediul pentru inocul dintr-un flacon Erlenmayer este însămânţat cu suspensia
microbiană din 2 eprubete cu preinocul. În mod similar se procedează cu celelalte trei flacoane cu
mediu pentru inocul. Dezvoltarea inocului se realizează la 280C, în condiţii aerobe, pe un agitator
rotativ la 240 rpm, timp de 48 de ore. Pentru transvazarea în bioreactor inoculul din toate flacoanele
Erlenmayer se reuneşte, în mod aseptic, într-un singur flacon steril de 500 ml şi se verifică puritatea
lui.
Cultura de drojdie din inocul trebuie să fie pură şi bine dezvoltată, formată din celule tinere,
în faza logaritmică de creştere.
Inocularea: Mediul de biosinteză se inoculează în condiţii sterile şi se fixează parametrii
de lucru ai bioreactorului.
În timpul cultivării se realizează trei adaosuri de etanol, pentru ca să se ajungă la o
concentraţie totală de 2% (v/v):
- înainte de inoculare ¼ din volumul total de etanol;
- după 12 ore de cultivare ¼ din volumul total de etanol;
- după 24 de ore de cultivare ½ din volumul total de etanol.
Parametrii de cultivare:
• Raport de inoculare: 1:10;
• Temperatură: 280C;
• pH iniţial: 4,5 (la intervale de 12 ore s-au făcut corecţii de pH cu soluţie amoniacală 25%);
• Agitare: 500 rpm;
• Rata de aerare: 0,8- 1 l aer/ l mediu/ minut;
• Timp: 48 de ore.
Controlul analitic al bioprocesului: Pe toată durata procesului tehnologic se recoltează
probe din 8 în 8 ore (în condiţii aseptice) şi se analizează:
- menţinerea purităţii culturii microbiene şi stadiile de dezvoltare a acesteia, prin efectuarea
de preparare microscopice lamă/lamelă sau frotiuri;
- acumularea biomasei micobiene (D.O. la 570 nm) şi evoluţia pH-ului şi se reprezintă
grafic;
- biomasa umedă - WCW (g/l);
- substanţa uscată - DCW (g/l);
- conţinutul în oxigen (cu ajutorul electrodului de oxigen);
- cantitatea de etanol cu ajutorul alcoolmetrului.
La finalul bioprocesului se determină:
- biomasa umedă - WCW final (g/l) şi substanţa uscată - DCW final (g/l);
- densitatea optică la 570 nm - D.O. final;
- pH final;
- cantitatea de etanol reziduală (cu alcoolmetrul).

Prelucrarea mediului de biosinteză

Biomasa de drojdie este centrifugată (cu centrifuga MLW K-80, la 4000 rpm, 15-20
minute) şi uscată prin atomizare (cu atomizorul de laborator tip Buchi) sau liofilizare. O altă
variantă de prelucrare a mediului de cultură constă în centrifugare urmată de uscarea drojdiei în
etuvă, în curent de aer ,la 370C.
Produsul finit va fi caracterizat prin următoarele analize:
 - determinarea umidităţii reziduale;
- determinarea proteinelor;
- determinarea cenuşei;
- determinarea acizilor nucleici;
- determinarea macroelementelor: Na, K, Mg, Ca, P, Cl;
- determinarea microelementelor: Pb, Hg, As, Mn, Zn, Cu, Se, Co, Mo;
- determinarea etanolului rezidual şi a formaldehidei.
Spre exemplificare, prezentăm analiza elementară a biomasei uscate obţinută prin creşterea
tulpinii Saccharomyces cerevisiae ICCF 3.20 pe etanol (tabel 11.1).

Tabel 11.1. Analiza elementară a biomasei uscate obţinută prin creşterea tulpinii
Saccharomyces cerevisiae ICCF 3.20 pe etanol
C 45,01 48,82
H 6,82 7,40
O 7,35 7,97
N 33,02 35,80
Cenuşă 7,8 -
Total 100 99,99
Formula biomasei: CH1,82N0,14O0,55
M 24,58

Evaluarea procesului biotehnologic

Se calculează:
- cantitatea de biomasă umedă - WCW (g/l);
- determinarea substanţei uscate - DCW (g/l);
cantitatea de etanol consumatã
 etanol (%) =  100
cantitatea de etanol initialã
Cantitatea de etanol consumată = cantitatea totală de etanol - cantitatea de etanol reziduală.