OBTINEREA

FRAGMENTELOR DE ADN
DE INTERES
Tehnicile care urmăresc manipularea directă a
ADN prin clonare moleculară se desfăşoară în
etape succesive, una dintre acestea fiind
obţinerea genelor de interes. Aceasta se poate
realiza fie prin izolarea genelor naturale, fie prin
sinteza chimică a unor molecule de ADN ce
codifică proteinele dorite. În prezent, prin aceste
tehnici se poate realiza prelucrarea şi transferul
unor secvenţe relativ mici, de dimensiuni
cuprinse între 1.000-20.000 pb.
Reuşita experimentelor în urma intervenţiilor prin
diverse procedee este condiţionată de prezenţa
integrală a genei dorite şi a unei cât mai mici
cantităţi de ADN “contaminant”, inutil pentru
buna funcţionare a genei de interes.
Obţinerea fragmentelor de ADN ce servesc pentru
clonare se poate realiza pe mai multe căi:
– izolarea genelor din ADN natural cu ajutorul enzimelor
de restricţie
– izolarea şi amplificarea genelor prin tehnologia PCR
– sinteza enzimatică a ADN dublu catenar
complementar (ADNc)
– sinteza chimică a genei.
Metodele enumerate presupun utilizarea unei
game variate de enzime, cum ar fi:
– enzime de restricţie (endonucleaze de restricţie)
– metilaze
– ADN polimeraze dependente de ADN
– Reverstranscriptaza (ADN polimerază dependentă de ARN)
– fosfataza alcalină
– ligaza
– polinucleotid kinaza
– nucleaze (DN-aze, RN-aze).
 ENZIMELE DE RESTRICTIE
Enzimele restricţie (endonucleazele de restricție; restrictaze)
sunt produse de către bacterii şi sunt răspunzătoare de
fenomenul de degradare a moleculelor de ADN străin ce
pătrund în interiorul celulelor bacteriene. Aceste enzime, după
"recunoaşterea" unei secvenţe nucleotidice specifice,
hidrolizează moleculele de ADN dublu catenar. Hidroliza ADN
se realizează prin clivarea a două legături fosfodiesterice,
situate câte una pe fiecare catenă a moleculei de ADN,
determinând formarea unui număr limitat de fragmente per
moleculă.
In celulele producătoare, endonucleazele de restricţie fac parte
integrantă dintr-un sistem de restricţie/modificare (R/M),
alcătuit dintr-o restrictază şi o enzimă de modificare.
"Modificarea", realizată în special prin metilare, protejează
ADN propriu faţă de acţiunea restrictazelor specifice, în timp
ce ADN străin, pătruns în celulă, fiind lipsit de o modificare
adecvată, este sensibil la distrugerea cu aceste enzime.
In prezent au fost studiate în detaliu peste
4000 enzime de restricție, fiind
comercializate aprox. 611 enzime ce includ
262 particularități specifice. De ex.
compania BioLabs comercializa, în anul
2013, 267 tipuri de enzime de restricție
dintre care 250 sunt recombinate.
Descoperirea enzimelor de restricție
Sistemele de restricţie şi
modificare au fost descoperite prin
efectul lor asupra bacteriofagilor ce
infectează celulele bacteriene.
Astfel, în anii 50, cercetătorii au
observat că particulele fagice
eliberate prin liza celulelor
bacteriene aparţinând unei
anumite tulpini determină
infectarea eficientă a altor bacterii
aparţinând aceleiaşi tulpini dar
sunt ineficiente în cazul în care
infectează bacterii aparţinând altor
tulpini (numărul de plaje de liză,
dovada eficienţei infecţiei cu
bacteriofagi virulenţi, este foarte
mic sau chiar nu se produc plaje
de liză).
La sfârșitul anilor 60 Stewart Linn
și Werner Arber au reușit să
explice acest fenomen prin
izolarea unor enzime specifice
care au primit denumirea de
enzime de restricție.
Faptul că în anumite situaţii apar plaje de liză, dovedeşte că sistemul
de restricţie nu este absolut. Există astfel posibilitatea ca ADN
exogen să scape fenomenului de restricţie fie datorită unor mutaţii
spontane apărute la nivelul situsurilor ţintă pentru enzimele de
restricţie, fie acţiunii ineficiente a acestora.
Particulele fagice din noile plaje de liză sunt capabile să infecteze
eficient noua tulpină bacteriană, dar nu şi cea de origine. Aceasta
dovedeşte că ADN din aceste particule fagice a suferit tipul de
modificare specific noii gazde şi nu mai este recunoscut de gazda
de origine.
In 1968, Arber şi Linn au demonstrat
activitatea restrictazică a enzimei
Eco B (primind premiul Nobel în anul
1978 pentru această descoperire),
produsă de o tulpină de E.coli, iar
Meselson şi Yuan (1968) au purificat
o enzimă cu acţiune similară,
sintetizată de tulpina E.coli K. Aceste
enzime au fost capabile de a
degrada ADN izolat din alte surse
dar nu şi pe cel al tulpinii
producătoare, ele “tăind” ADN în
mod întâmplător, la nivelul unor
regiuni localizate departe de situsul
de recunoaştere.
In 1970, Smith, Wilcox şi Kelly au reuşit purificarea şi
caracterizarea unei alte enzime de restricţie, Hind II, enzimă
care “taie” macromolecula de ADN la nivelul situsului de
recunoaştere. Această enzimă a fost apoi utilizată de Dana
şi Nathans (1971) pentru clivarea genomului circular al
virusului SV40 reuşind obţinerea a 11 fragmente distincte.
Acest experiment a însemnat realizarea primei hărţi de
restricţie.
Nathans (stânga) și Smith (dreapta)
 Werner Arber Daniel Nathans Hamilton O. Smith

Premiul Nobel în anul 1978 pentru Fiziologie și Medicină pentru

„descoperirea enzimelor de restricție și a aplicațiilor acestora în genetica
moleculară”
 Nomenclatura enzimelor de restricție

• Pentru denumirea unei enzime de restricție a

fost propus un model original, ce combină
denumirea speciei şi a tulpinii de la care s-a
izolat enzima (abreviere) şi numărul de enzime
pe care aceasta le produce (cifre romane).
• De exemplu, tulpina Escherichia coli R produce
mai multe enzime de restricţie notate Eco RI,
Eco RII, Eco RV, în timp ce Bacillus globigii
sintetizează două enzime de restricţie, Bgl I şi
Bgl II.
Trăsătura de bază a unui sistem de restricţie şi
modificare este aceea că tulpina bacteriană
prezintă o activitate de metilare a ADN propriu
cu aceeaşi specificitate de secvenţă ca şi
activitatea restrictazică.
Metilaza adaugă grupări metil la resturile de
adenină sau citozină de la nivelul situsurilor ţintă
ale enzimei de restricţie corespunzătoare, ceea
ce conferă respectivelor molecule de ADN
rezistenţă la acţiunea restrictazei (protejează
ADN propriu de “autodigestia” pe care ar
produce-o enzima de restricţie sintetizată).
http://vle.du.ac.in/mod/book/print.php?id=11908&chapterid=23665
Toate endonucleazele de restricţie recunosc
scurte secvenţe de nucleotide de la nivelul
macromoleculelor de ADN, secvenţe ce
reprezintă situsurile de recunoaştere şi legare.
Aceste secvențe sunt de tip palindromic.
Legarea este urmată de clivarea legăturilor
fosfodiesterice fie la nivelul situsului de
recunoaştere fie la depărtare de acesta, în
funcţie de enzimă.
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
ADN genomic al bacteriei ce produce o anumită enzimă de restricţie este metilat la nivelul
situsurilor ţintă, astfel încât devine imun la acţiunea enzimei de restricţie corespunzătoare. ADN
este metilat pe ambele catene însă, în cursul procesului de replicare, moleculele fiice conţin doar
una dintre catene metilată (cea matriţă); se poate spune în acest fel că ele sunt hemimetilate. In
acest moment întră în acţiune enzimele ce catalizează procesul de metilare şi introduc grupări
metil la nivelul bazelor azotate corespunzătoare. Atunci când în celulă pătrunde însă o moleculă
de ADN străin, care nu prezintă modelul de metilare al respectivei gazde, el este rapid
recunoscut de enzimele de restricţie şi degradat.
 Clasificarea sistemelor de restricție/modificare

Sistemele enzimatice de restricţie/modificare au fost împărţite în

patru categorii: tipul I, tipul II, tipul III şi tipul IV.
Diferenţa principală dintre cele trei categorii este aceea că
sistemele enzimatice de tipul II conţin enzime diferite ce
realizează metilarea, respectiv restricţia, în timp ce sistemele
de tip I şi III grupează enzime ce prezintă atât proprietăţi de
metilare cât şi de restricţie. Enzimele de tipul IV clivează doar
situsuri metilate și prezintă slabă specificitate de secvență.
Enzimele ce alcătuiesc aceste sisteme au 2-3 subunităţi
heterologe cu proprietăţi funcţionale distincte și necesită
intervenția mai multor cofactori enzimatici (ATP, ioni de
magneziu sau S-adenozilmetionină).
Sistemele enzimatice de tip I şi III sunt mai puţin cunoscute şi
mai puţin folosite în practică deşi sunt interesante din punct
de vedere biologic.
Model al mecanismelor prin care o enzimă de restricție ajunge la situsul țintă
(recunoaștere și/sau restricție): „țopăială”, săritură, difuziune de-a lungul
ADN (1D), difuziune 3D,
Actiunea enzimelor de restricție de tip I și II

Enzimele de tip II (în general dimeri proteici)

clivează ADN la nivelul situsului specific
după care se desprind de țintă lăsând
fragmentele de ADN rezultate, libere
In cazul enzimelor de tipul I, acestea sunt
alcătuite din mai multe subunități:
subunitatea care recunoaște ADN (S), două
subunități de tip metiltransferaze (M) și
două subunități responsabile de restricție
(R). Miezul M2S este responsabil de
menținerea metilării cromosomului gazdei și
de țintirea restricției propriu zise la nivelul
secvențelor specifice, nemetilate.
Reacția de restricție presupune un proces de
translocare ce necesită energie (furnizată
prin hidroliza ATP), proces în care sunt
implicate și alte enzime (helicaze). Clivarea
propriu zisă are loc la o oarecare distanță
de situsul de legare al enzimei.
 Structura enzimei EcoRI: aceasta este un homodimer, format din 2 catene
polipeptidice (verde și bleu), capabile să se lege la nivelul moleculei de ADN.
La nivelul moleculei proteice există 2 ioni de magneziu situați în apropierea
situsurilor de clivare, ei având un important rol în activitatea catalitică.
Enzimele de restricţie ce recunosc secvenţe de tip palindrom rup legăturile
fosfodiesterice la nivelul acestor secvenţe, generând fie extremităţi
monocatenare complementare 3’ sau 5’ (atunci când clivarea se face
decalat în raport cu axul de simetrie al secvenţei palindromice), fie
extremităţi drepte (atunci când clivarea se face în aceeaşi poziţie pe
ambele catene ale ADN).
Un alt element de flexibilitate legate de modul de clivare al enzimelor de
restricție este acela că mai multe enzime de restricție recunosc aceeași
secvență de nucleotide dar pe care o clivează în mod diferit = enzime de
restricție izoschizomere.
De exemplu, enzimele Xma I și Sma I sunt izoschizomere: ambele recunosc
același situs de recunoștere (CCCGGG) dar Xma I generează prin clivare
extremități monocatenare complementare în timp de Sma I determină
formarea de fragmente cu extremități drepte.
Una dintre caracteristicile enzimelor de restricţie este
aceea că ele recunosc anumite secvenţe de
nucleotide (situsul de recunoaştere) şi clivează în
mod specific legăturile fosfodiesterice dintre anumite
nucleotide (situsul de clivare), situsurile fiind plasate
pe ambele catene ale ADN.

La multe enzime de restricţie, situsul de recunoaştere

coincide cu cel de clivare (mai ales la enzimele de
restricţie de tip II), fiind format dintr-un număr limitat
de nucleotide (4, 5, 6, 7 sau 8 perechi de
nucleotide), cu structură de palindrom.
ex. Eco RI recunoaşte o secvenţă specifică
formată din 6 nucleotide, GAATTC.
Numărul şi mărimea fragmentelor de ADN
generate prin acţiunea enzimelor de restricţie
depinde de frecvenţa apariţiei situsurilor de
recunoaştere la nivelul ADN supus clivării.
Presupunând că, în medie, conţinutul în G+C al
ADN ar fi 50%, aceasta ar însemna că un
situs de restricţie format din patru nucleotide
s-ar regăsi la nivelul acelui ADN la fiecare
256 perechi de baze (44). Dacă situsul de
restricţie este format din şase nucleotide, el
s-ar regăsi la fiecare 4096 perechi de baze
(46), în timp ce un situs de restricţie format
din opt nucleotide ar putea apărea la fiecare
65.536 perechi de baze (48).
In funcţie de enzima de restricţie utilizată şi de scopul
urmărit în experiment, ADN poate fi scindat în
fragmente de dimensiuni mici (ca în cazul
experimentelor de amprentare genetică = „DNA
fingerprinting”) sau mai mari, mai ales atunci când
sunt folosite enzime al căror situs de recunoaştere
este format din 8 nucleotide (ca în cazul
experimentelor de clonare a unor fragmente
genomice sau în cele de cartare genetică).
De exemplu, în cazul utilizării pentru clivarea ADN
bacterian, care are aproximativ 4 x 10 6 pb (4 Mb), a
enzimei EcoRI ar trebui, teoretic, să se obțină
fragmente de aproximativ 4kb (aproximativ 1000
pb).
Pentru testarea acţiunii enzimelor de restricţie se pot utiliza diferite
tipuri de ADN la care se cunoaşte numărul de situsuri de
recunoaştere (stabilit prin studii anterioare). Dintre acestea, cele mai
utilizate molecule de ADN provin de la bacteriofagul λ, de la
adenovirusul Ad2, bacteriofagul X174, plasmida pUC18 sau
pBR322
RFLP (restriction fragments lenght polymorphism)
- Polimorfismul lungimii fragmentelor de restricție -

Tehnica RFLP se referă la detectarea variațiilor la nivelul

numărului de situsuri de restricție pentru anumită enzimă
de restricție prin compararea unor probe de ADN provenite
de la indivizi diferiți aparținând aceleiași populații (specii).
Prin compararea profilului de restricție, cu aceeași enzimă,
al ADN provenit de la 2 indivizi diferiți, pot fi evidențiate
eventuale mutații la nivelul unor gene (al situsurilor de
restricție dintr-o anumită genă).
 Aplicațiile tehnologiei RFLP

- Agricultură – metodă directă pentru selectarea unor

gene de interes (de ex.gene de rezistență la boli)
- În domeniul judiciar („forensic”) etc)
- Cartarea genelor: permite determinarea statusului
genetic al unui individ pentru o anumită maladie
genetică (Huntington, fibroza chistică, anemia
falciformă)
- Consiliere genetică – pentru familiile cu risc genetic
RFLP este o metodă de amprentare genetică, utilă pentru analiza
probelor ADN prelevate de la locul unei crime, în determinarea
paternității, evidențierea diversității genetice sau a profilurilor genetice de
ameliorare în populațiile de plante sau animale. In practica judiciară
această metodă este mai puțin utilizată în ultimii ani datorită posibilelor
erori ce pot apărea (reproductibilitate relativ scăzută), ea fiind înlocuită de
alte tehnici. Dacă se utilizează atunci, de regulă se folosesc sonde
moleculare specifice unor anumite secvențe țintă.