5.

Genetica bacteriană (Gabriela Loredana Popa)

5. 1. Suportul eredităţii
Genetica bacteriană studiază ereditatea şi variabilitatea la bacterii.
Suportul material al eredităţii este reprezentat de ADN. Molecula de ADN conţine
codificată informaţia ereditară, care se exprimă prin sinteza unor proteine şi se transmite prin
replicare şi diviziune la descendenţi. Gena reprezintă unitatea funcţională a eredităţii iar
noţiunea de genă este cunoscută încă din anul 1909.
Dacă nu au loc modificări genetice, toţi descendenţii unei bacterii vor fi identici cu bacteria
„mamă” şi identici între ei. O celulă bacteriană inoculată pe un mediu de cultură va produce
prin multiplicare în condiţii prielnice de pH, temperatură, umiditate etc şi având la dispoziţie
nutrienţii necesari o colonie bacteriană, o clonă.
Materialul genetic al unei celule bacteriene poate fi modificat fie prin incorporarea unui
fragment de material genetic exogen (în procesul de recombinare genetică), fie prin mutaţie
(fenomen spontan sau indus), care poate consta în adăugarea, pierderea, substituirea sau
inversarea ordinii unor baze într-una din secvenţele polinucleotidului.
Structura ADN (acidul dezoxiribonucleic)
ADN este un macropolimer de dezoxirbonucleotide.
Unitatea structurală este formată dintr-o bază azotată purinică (adenina, A; guanina, G)
sau pirimidinică (timina, T; citozina, C), o pentoză (dezoxiriboza) şi acid fosforic. Legături
fosfodiester unesc carbonul 5 al unei molecule de dezoxiriboză cu carbonul 3 al moleculei
adiacente, formând o catenă lungă polinucleotidică. Prin analiza compoziţiei în baze azotate
a ADN (provenit din surse diferite) s-a demonstrat că există o anumită compoziţie care diferă
la diferite specii. Raportul A+T / C+G nu este egal cu 1 şi este specific pentru specii diferite
(de ex. această valoare este egală cu 0,51 la Pseudomonas aeruginosa sau este egală cu 0,97
la Escherichia coli).
ADN apare ca o macromoleculă formată din două catene polinucleotidice antiparalele şi
complementare răsucite în dublu helix. Cele două catene sunt unite prin punţi de hidrogen
formate între bazele azotate opuse (A-T şi G-C). Modelul structural al ADN a fost propus de
către Watson şi Crick în anul 1953. Complementaritatea bazelor azotate este cea mai
importantă proprietate a acizilor nucleici şi condiţionează toate proprietăţile ADN, mai ales
cea de replicare (autoreplicare) şi de transfer al informaţiei genetice. Ulterior a fost descrisă şi
structura terţiară şi cuaternară a acizilor nucleici.
Rolul genetic al ADN a fost dovedit prin experienţe succesive, iniţial prin cercetările lui
W. Grifith (1928) privind fenomenul de transformare bacteriană, ulterior prin experienţe care
au confirmat rezultatele obţinute de Grifith, dar abia în 1944 Avery, MacCloud şi Mc Carthy
demonstrează faptul că ADN este substratul chimic al eredităţii şi reprezintă materialul genetic
al oricărei celule (funcţie îndeplinită de ARN la ribovirusuri).
ADN este o structură stabilă în condiţii fiziologice normale, datorită legăturilor
intracatenare (2 între A şi T şi 3 între C şi G), la temperatura camerei. Dacă temperatura
depăşeşte 65ºC, stabilitatea punţilor de hidrogen începe să cedeze, structura dublu-helix începe
să se desfacă şi rezultă două catene complementare (denaturare termică). Denaturarea devine
completă la temperaturi care depăşesc valoarea de 90ºC. Renaturarea („reannealing”)
reprezintă refacerea structurii bicatenare a ADN, iar prina acest proces se poate stabili relaţia
filogenetică între două specii (în funcţie de procentul de renaturare). De ex. dacă se utilizează
ADN denaturat provenit de la E. coli şi ADN denaturat provenit de la Salmonella spp., fiecare
marcat cu acelaşi izotop (ex. 14C), fracţiunea de ADN marcată şi evaluată prin diferite tehnici
va fi fracţiunea din ADN care este complementară pentru cele două specii (aceste experienţe
au stat la baza brevetării tehnicilor de hibridare moleculară). Renaturarea este un proces mai
lent decât denaturarea. Denaturarea şi renaturarea acizilor nucleici sunt procese fizice
importante, folosite fie în tehnologia ADN recombinant, fie în studierea relaţiilor filogenetice
între diferite specii. Cu cât speciile sunt mai înrudite, cu atât secvenţele de baze azotate au un
mai mare grad de similitudine (lanţurile lor monocatenare renaturează mai rapid).
Genom. Genotip. Fenotip
Genomul reprezintă suma genelor unui organism.
Totalitatea informaţiei genetice a unui organism se numeşte genotip.
Suma caracterelor observabile, specifice unui organism, produse de genotip în
interacţiune cu mediul ambiant se numeşte fenotip.

Funcţiile ADN ca material genetic:

- conservarea informaţiei genetice;
- replicarea;
- transcrierea şi traducerea materialului genetic;
- protejarea materialului genetic propriu, „self”;
- reglarea şi controlul activităţii celulare.

Transmiterea mesajului genetic la bacteriile descendente

Transmiterea mesajului genetic se face prin dublarea cantităţii de material genetic urmată
de diviziune.
Replicarea ADN constă în sinteza unor noi molecule de ADN, identice cu molecula
parentală şi identice între ele, pe bază de complementaritate (replicarea semiconservativă).
După ruperea legăturilor de hidrogen şi separarea celor 2 catene, fiecare catenă serveşte drept
matriţă pentru sinteza unei noi catene. Replicarea ADN este una dintre cele mai importante
reacţii din lumea vie. Watson şi Crick au fost primii care au propus modelul semiconservativ
de replicare a ADN. În celula care se dezvoltă rapid există posibilitatea ca înainte ca prima
replicare să se fi încheiat să se iniţieze încă o replicare şi în acest caz celula bacteriană va putea
fi meroploidă (doar anumite regiuni cromozomiale sunt copiate de mai multe ori) sau chiar
poliploidă (tot cromozomul a fost copiat de mai multe ori). Dacă replicarea cromozomială nu
este succedată de diviunea celulei (aşa cum se întâmplă în mod obişnuit), putem remarca în
celula bacteriană existenţa mai multor cromozomi. Cromozomii suplimentari (în total 2 sau 4)
nu aduc o informaţie genetică diferită pentru că ei reprezintă copii ale cromozomului iniţial
(identici cu acesta).
Repliconul (Jacob, Brenner, Cuzin)
In vivo se pot replica numai moleculele de ADN constituite într-o unitate de replicare
independentă numită replicon. Indiferent dacă celula are mai mulţi cromozomi (celula
eucariotă) sau un singur cromozom (celula procariotă), tot genomul trebuie să fie replicat.
Repliconul este moleculă de ADN bicatenară şi circulară caracterizată prin: - o secvenţă
nucleotidică specifică marcând începerea replicării;
- gene care codifică sinteza unor proteine specifice numite iniţiatori;
- o secvenţă nucleotidică semnal pentru terminarea replicării.
Exemple de repliconi:
- cromozomul şi plasmidele bacteriene;
- genomul bacteriofagilor etc.
Cromozomul bacterian este unul dintre cele mai ilustrative exemple de replicon. O genă
structurală din cromozom are toată informaţia necesară sintezei iniţiatorului replicării (o
proteină complexă). După ce replicarea a început, nu mai poate fi oprită până în momentul
când se ajunge la dedublarea cromozomului. Faptul că cromozomul bacterian funcţionează ca
un replicon este dovedit de experienţa în care fragmentele de ADN introduse într-o celulă
bacteriană (de ex. prin conjugare) nu se pot replica dacă rămân „libere” în citoplasmă, dar vor
putea fi replicate odată cu întregul cromozom în cazul în care sunt integrate în cromozomul
bacterian.
Replicarea corectă este controlată de un mecanism foarte precis care „identifică” apariţia
de nucleotide libere, împerecheate eronat şi în momentul apariţiei unui astfel de eveniment
acesta este „tăiat” iar polimerizarea se opreşte (corectitudinea citirii este realizată de existenţa
ADN-polimerazei I).

5. 2. Hibridizarea acizilor nucleici

Reacţia de hibridizare a acizilor nucleici se poate realiza datorită complementarităţii
nucleotidelor (structura primară). Prin această tehnică se poate demonstra înrudirea sau
eventual identitatea a două microorganisme, pe baza gradului (procentului) de omologie al
secvenţelor nucleotidice. Din punct de vedere tehnic, cultivăm o bacterie de referinţă
(cunoscută) în aşa fel încât să putem marca ADN-ului cromozomial (însă uneori aceste
experienţe se fac prin marcarea ADN-ului plasmidic). Spre exemplu, o variantă poate fi
reprezentată de cultivarea în mediu cu timidină tritiată, astfel încât rezultă marcarea radioactivă
a ADN cu tritiu. ADN-ul extras din fiecare microorganism este tratat pentru a obţine fragmente
monocatenare. ADN-ul dublu catenar se reface dacă fragmentele ADN ale bacteriei testate au
secvenţe nucleotidice complementare cu fragmentele ADN de referinţă.
Cu cât gradul de complementaritate dintre „sonda moleculară” şi „ţintă” este mai mare, cu
atât structura hibridă formată va fi mai stabilă şi mai greu de disociat. Actualmente sondele
moleculare sunt sintetizate chimic sau enzimatic.
Utilitatea hibridizării acizilor nucleici
Această tehnică se utilizează în taxonomia microbiană şi stă la baza funcţionării sondelor
nucleotidice care depistează rapid şi cu foarte mare sensibilitate microorganisme sau numai
unii determinanţi genetici ai acestora. Un alt aspect important este reprezentat de specificitatea
sondei utilizate. Se apreciază că pentru a elimina riscul hibridizării „la întâmplare”, sonda
nucleotidică ar trebui să aibă cel puţin 20 nucleotide.

5. 3. Amplificarea genetică
Conceptul amplificării cantităţii de acizi nucleici a fost introdus în 1983 de către Mullis,
dar anul 1955, odată cu descoperirea ADN polimerazei I, a reprezentat un moment crucial.
Folosind ADN-polimeraza şi două secvenţe scurte de ADN (oligonucleotide, primeri), s-a pus
la punct un test repetitiv de sintetizare a ADN-ului care a fost numit „Reacţia de polimerizare
în lanţ” (Polymerase Chain Reaction, PCR).
ADN-polimeraza este capabilă să conducă la sinteza unui al doilea lanţ de ADN,
întotdeauna orientat 5’-3’, folosind ca substrat patru nucleotide trifosfat, un lanţ de ADN ca
„matrice” (model) şi un fragment scurt de ADN complementar utilizat drept „primer”
(amorsă). Pentru un lanţ de acid nucleic, vom utiliza de fapt doi primeri, complementari la
două secvenţe specifice diferite ale ADN-ului ţintă.
Iniţierea sintezei de ADN va putea avea loc numai după ce ADN-ul dublu catenar este
denaturat (termic). Urmează o etapă de răcire, permiţând astfel ataşarea primerilor (care sunt
furnizaţi în exces) de fragmentele de ADN complementar. Sinteza de ADN mediată de ADN
polimerază va produce două molecule dublu catenare. Dacă procesul se repetă, vor rezulta
patru molecule de ADN. ADN-ul se multiplică exponenţial (dublându-se de fiecare dată) ori
de câte ori se repetă reacţia. Teoretic, PCR poate amplifica un fragment scurt de ADN pornind
de la o singură moleculă la 1.000 de copii dacă procesul se repetă de 10 ori şi la circa un milion
de copii dacă procesul se repetă de 20 de ori. Acest proces poate avea loc automat într-un
aparat numit termociclor; aparatul repetă ciclul constând în denaturarea prin căldură (la 94-
96ºC), ataşarea primerilor (la 40-60ºC) şi sinteza ADN-ului (la 65-75ºC), folosind ADN-
polimeraza termostabilă (Taq-polimeraza) izolată de la o bacterie care trăieşte în izvoarele
termale din Yellowstone National Park, Thermus aquaticus.

Aplicaţiile tehnicii de amplificare genetică

PCR a început să fie aplicată în numeroase domenii ale cercetării medicale fundamentale.
Succesul depinde de puritatea sursei de ADN, precum şi de metoda de extragere şi de
recuperare a ADN-ului. Datorită sensibilităţii extrem de mari a procesului, contaminarea
datorată manipulării produselor de amplificare PCR obţinute anterior în acelaşi laborator
poate reprezenta o problemă deosebit de serioasă. Contaminarea se poate realiza fie între
probe, în timpul desfăşurării protocolului de lucru, fie datorită diferitelor manipulări. Prima
variantă este mai uşor de evitat, astfel încât sursa majoră de contaminare în laboratorul de
biologie moleculară rămâne eventuala contaminare a reactivilor. Verificarea acestei posibile
erori este obligatorie pentru orice reacţie PCR, printr-o reacţie de control (control negativ) la
care nu se adaugă ADN. Această problemă a contaminării nu este superpozabilă cu cea a
rezultatelor fals-pozitive. O contaminare între probe este mult mai dificil de identificat.
Principalele măsuri de precauţie ar fi reprezentate de: utilizarea unor camere de lucru separate
pentru manipularea produselor care conţin ADN şi respectiv pentru prepararea celorlalţi
reactivi, folosirea micropipetelor (două seturi de micropipete, pentru produse cu şi fără
ADN), utilizarea conurilor cu filtru, lucrul într-o nişă special amenajată şi dotată cu hotă cu
flux laminar de aer. Recent s-a demonstrat faptul că lumina ultravioletă are capacitatea de a
inactiva ADN-ul dublu catenar contaminant. Alte modalităţi de a elimina (diminua) riscurile
contaminării sunt reprezentate de: includerea unei nucleotide modificate în PCR (înlocuirea
deoxiuridinei-P cu deoxitimidină-3P) şi respectiv folosirea enzimelor de restricţie pentru
îndepărtarea ADN-ului contaminat din RT-PCR (transcriere inversă).

Utilizarea PCR în diagnosticul bolilor infecţioase

PCR poate fi utilă în diagnosticul bolilor virale, bacteriene, fungice sau parazitare. În
infecţia cu HIV, PCR şi-a dovedit utilitatea atât în diagnostic (secvenţele HIV-1 sunt
detectabile în 100% din cazuri atunci când virusul este cultivabil şi în 64% din cazuri în situaţia
unor culturi negative), cât şi în stabilirea prognosticului. În cazul infecţiilor cu citomegalovirus
(CMV), PCR poate detecta ADN viral în sânge cu 7-10 zile mai devreme decât sunt identificate
antigenemia sau viremia. În mod asemănător, PCR este utilă în identificarea altor agenţi
etiologici (în contextul general epidemiologic, clinic şi paraclinic) precum virusurile hepatitei
B şi C, virusurilor papilloma, herpes virusurilor sau a unor enterovirusuri.
Diagnosticul infecţiilor bacteriene poate beneficia de asemenea de tehnicile moleculare
prin amplificare genică. Actualmente sunt puse la punct protocoalele de lucru utile identificării
agenţilor etiologici ai tusei convulsive (Bordetella pertussis), legionellozei (Legionella
pneumophila), pneumoniei atipice (Mycoplasma pneumoniae), tuberculozei (Mycobacterium
tuberculosis), proceselor inflamatorii pelviene (Chlamydia trachomatis), gonoreei (Neisseria
gonorrhoeae), sifilisului (Treponema pallidum), meningitei (Haemophilus influenzae,
Neisseria meningitidis), gastritelor şi ulcerului (Helicobacter pylori), febrei tifoide
(Salmonella typhi), dizenteriei bacteriene (Shigella dysenteriae), septicemiei cu E. coli
(enterotoxigen), bolii Lyme (Borrelia burgdorferi), leprei (Mycobacterium leprae) etc. Dacă
în cazul majorităţii bolilor enumerate există alternative bacteriologice sau imunologice clasice
decisive, atunci când sunt implicate microorganismele aparţinând genului Mycobacterium
(Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae) se ridică anumite probleme. În
tuberculoză, agentul etiologic se izolează relativ dificil din produsele patologice, se multiplică
lent, coloniile vizibile apărând pe mediile de cultură după 2-8 săptămâni, iar testele necesare
identificării fenotipice clasice necesită 2-6 săptămâni suplimentare şi nu au relevanţă în 100%
din cazuri. Pe de altă parte, Mycobacterium leprae nu se multiplică pe nici un tip de mediu de
cultură. Cu alte cuvinte, aplicarea unor metode sensibile şi specifice este foarte necesară.
Sunt puse la punct protocoalele de lucru PCR utile în scopul diagnosticării infecţiilor
grave produse de Candida albicans, pneumoniei la pacienţi imunodeprimaţi (Pneumocystis
carinii), meningitei cu Cryptococcus neoformans sau al unor infecţii cu Coccidioides immitis
(ex. la persoane infectate cu HIV), pentru a enumera câteva din aplicaţiile biologiei moleculare
în domeniul afecţiunilor produse de fungi.
În domeniul parazitologiei, exemplele cele mai bine cunoscute sunt legate de diagnosticul
dizenteriei amoebiene (Entamoeba histolytica), altor diarei de origine parazitară (de exemplu,
cele produse de Giardia lamblia), malariei (Plasmodium falciparum) sau diagnosticul
toxoplasmozei (Toxoplasma gondii).
Actualmente s-au pus la punct şi alte metode de amplificare genetică utile în diagnosticul
sau în identificarea agenţilor etiologici ai maladiilor transmisibile. În mod suplimentar dorim
să menţionăm faptul că dacă iniţial tehnicile de bază ale biologiei moleculare (hibridizarea
moleculară, utilizarea sondelor nucleotidice marcate radioactiv sau neradioactiv, amplificarea
genică) erau utilizate individual, majoritatea protocoalelor de lucru actuale cuprind combinaţii
de tehnici, din ce în ce mai complexe şi mai subtile. Pe de o parte, există şi o întregă serie de
variante tehnice ale reacţiei de amplificare genică, de ex. Invers-PCR (pentru amplificarea unei
regiuni la care nu este cunoscută secvenţa, dar zonele învecinate au secvenţe cunoscute); LCR
(ligase chain reaction) în care este necesar să cunoaştem integral secvenţa ADN-ului ţintă; RT-
PCR (PCR înainte de care are loc o revers-transcriere, pornind de ex. de la ARNm şi obţinând
ADNc); Nested PCR (în care are loc o amplificare dublă a acidului nucleic folosind 2 perechi
de primeri diferiţi) etc. Pe de altă parte, tehnica PCR este utilizată din ce în ce mai frecvent ca
o completare esenţială a unei alte tehnici (de exemplu RFLP, restriction fragment length
polymorphism; SSCP-PCR; DRE-PCR, double repetitive element PCR; DRV-PCR, direct
variable repeat-PCR; UP-PCR, single universal primer-PCR; spoligotyping etc).

5. 4. Organizarea genomului bacterian

Genomul bacterian este alcătuit din două categorii de determinanţi genetici: 1. genele
esenţiale, localizate în structura cromozomului bacterian şi
2. genele accesorii extracromozomale prezente în structura:
- plasmidelor şi
- elementelor genetice transpozabile.

Plasmidele
 Plasmidele sunt elemente genetice extracromozomiale, capabile de replicare fizic
independentă de cromozom (replicon), dar depinzând de factori codificaţi de nucleul
bacterian. Conţin informaţie genetică neesenţială pentru viaţa celulei bacteriene. Sunt
transmise stabil de-a lungul generaţiilor. Dimensiunea plasmidelor variază între 1kpb şi circa
200 kpb. În majoritate sunt alcătuite din molecule de ADN circular dar există şi plasmide
liniare (ex. la Borrelia burgdorferi). Unele plasmide sunt ADN dublu catenar dar există şi
plasmide de ADN monocatenar (se consideră că plasmidele de ADN monocatenar reprezintă
de fapt o situaţie intermediară în cursul procesului de replicare; au fost detectate de ex. la
Staphylococcus aureus).
Unele plasmide (numite şi episomi) pot exista alternativ în stare autonomă (libere în
citoplasmă) sau integrate în cromozomul celulei gazdă (de exemplu factorul F, bacteriofagul
temperat etc). Celelalte plasmide persistă indefinit numai în stare autonomă (de exemplu
plasmida R, Col, F etc).
Clasificarea plasmidelor
În raport cu caracterele exprimate fenotipic, plasmidele se pot clasifica în: 1. plasmide care
codifică rezistenţa la agenţi antibacterieni:
- factorii R (primul factor R a fost izolat de la o tulpină de Shigella dysenteriae); - plasmidele
de rezistenţă la UV etc.
2. plasmide care codifică sinteza unor agenţi antimicrobieni:
- factorii Col (conferind capacitatea de producere de colicine) etc.
3. plasmide de patogenitate care codifică sinteza de:
- hemolizine;
- factorii de colonizare;
- enterotoxine sau alte exotoxine etc.
4. plasmide care codifică enzime ale unor căi metabolice particulare:
- în anumite condiţii, unele bacterii pot utiliza ca sursă de C diferite substanţe cu potenţial
toxic, precum octanul sau toluenul, iar plasmidele care permit supravieţuirea şi dezvoltarea în
aceste condiţii se numesc plasmide degradative;
5. plasmide care permit transferul genelor cromozomiale de la o celulă care deţine
respectivul plasmid (F) la alta, putând fi transmis inclusiv plasmidul (factorul) F; 6. plasmide
criptice, pentru care nu se cunosc caracterele fenotipice exprimate.

Plasmidele R
Plasmidele R (de rezistenţă la antibiotice) conferă celulei purtătoare rezistenţa la unul sau
la mai multe antibiotice. Plasmidele R au o structură genetică complexă, fiind alcătuite din:
- gene care asigură proprietatea de rezistenţă la antibiotice;
- gene care formează „factorul de transfer al rezistenţei” (RTF).
Asigură capacitatea de replicare autonomă şi de transfer prin conjugare (cele două tipuri
de elemente pot exista independent sau se pot asocia).
Transferul plasmidelor R se poate face prin conjugare bacteriană sau prin transducţia
mediată de bacteriofagi.

Plasmidele „Col”
 Plasmidele „Col” codifică proprietatea unor bacterii de a elabora substanţe antibiotice de
tip special, numite bacteriocine (colicine, pesticine, vibriocine, piocine etc). Plasmidele „Col”
sunt transferabile de la tulpinile Col+la tulpini Col prin transformare genetică, transducţie
fagică sau prin conjugare.
Bacteriocinele sunt bactericide, au un spectru de activitate limitat (faţă de specia
omologă), iar biosinteza lor nu are efect letal pentru specia producătoare.

Factorul F (factorul de „sex”, factorul de „fertilitate”)

Factorul F controlează capacitatea unor bacterii de a acţiona ca donatoare de material
genetic în procesul de conjugare. Factorul F codifică structurile (de exemplu pilul „F”) şi
enzimele necesare transferului de ADN.
În funcţie de prezenţa plasmidelor de sex F, de raportul lor cu cromozomul bacterian şi de
modul în care facilitează transferul de material genetic, bacteriile se pot grupa în patru categorii
distincte: bacterii F-; bacterii F+; bacterii Hfr; bacterii F’.
Bacteriile F
Bacteriile F sunt lipsite de factorul F. Sunt echivalente unor celule „femele” care se
comportă ca receptoare de material genetic.
Bacteriile F+
Bacteriile F+deţin factorul F autonom în citoplasmă. Sunt echivalente unor celule
„mascule”, donatoare de material genetic, capabile să transmită factorul F. Bacteriile Hfr
(High frequency of recombination)
Bacteriile Hfr (cu mare frecvenţă de recombinare) deţin factorul F integrat în cromozomul
bacterian. Se comportă ca donatoare de material genetic cu o mare frecvenţă de conjugare şi
recombinare. Prezenţa factorului F integrat determină de obicei transferul unui număr variabil
de gene cromozomale şi mai rar, chiar transferul factorului F.
Bacteriile F’
Bacteriile F’ deţin o structură plasmidică de tip special (factor de fertilitate recombinant)
care a fost anterior integrată în structura unui cromozom şi s-a desprins din acesta, încorporând
în structura sa unele gene cromozomale. Aceste bacterii au caracter de „mascul” şi se comportă
ca donatoare de material genetic (factorul F’).
Elemente genetice transpozabile
O anumită secvenţă specifică de ADN constituie un element genetic transpozabil dacă îşi
menţine integritatea fizică, structurală şi genetică, funcţională în cursul translocaţiei de la o
poziţie la alta pe acelaşi genom, replicon (intramolecular) sau pe genomuri diferite
(intermolecular). De obicei fenomenul de transpoziţie poate avea loc pe orice replicon, la
„întâmplare”, dar există şi situaţii în care un transpozon „are” anumite zone specifice unde se
va insera (zone „calde”).
Pe baza complexităţii lor, elementele care îndeplinesc această condiţie se pot grupa în trei
categorii:
- secvenţe de inserţie (SI);
- transpozoni (Tn);
- bacteriofagi.

Secvenţele de inserţie (SI)

Secvenţele de inserţie nu conţin nici o genă şi nu au nici o altă funcţie (cunoscută) în afară
de cea de inserţie. Sunt cele mai simple elemente transpozabile. După inserţia lor pot apărea
modificări în expresia unor gene sau modificări în rata incidenţei deleţiilor în regiunile
adiacente situsului lor de inserţie.
Există anumite secvenţe de inserţie care au intrat în istoria practică medicală datorită
importanţei în diagnosticul anumitor afecţiuni. De ex. IS6110 se întâlneşte în una sau mai
multe copii în genomul Mycobacterium tuberculosis şi poate fi pus în evidenţă prin reacţia
PCR pornind fie de la cultură, fie chiar şi de la produsul patologic, permiţând un diagnostic
mai rapid.
Transpozonii (Tn)
Transpozonii diferă de secvenţele de inserţie prin complexitate şi prin faptul că poartă
gene care conferă bacteriilor funcţii noi, detectabile, de exemplu:
- rezistenţa la antibiotice;
- capacitatea de sinteză a unor enzime;
- producerea de enterotoxine;
- sinteza antigenelor bacteriene de suprafaţă (de exemplu K 88);
- sinteza unor factori de colonizare intestinală etc.
Există transpozoni compuşi, care pe lângă funcţia de transpoziţie includ şi o serie de
determinanţi genetici şi transpozoni complecşi. Dintre aceştia din urmă, transpozonul Tn3 a
fost identificat la o tulpină de E. coli.
Bacteriofagii
Spre exemplu bacteriofagul Mu (numele rezultă prin prescurtarea „mutator”, pentru că a
fost identificat ca factor mutagen la tulpini de E. coli) are un genom de 30kpb şi o structură
lineară. După infectarea celulei bacteriene, bacteriofagul Mu se inseră în cromozom la
„întâmplare” şi ulterior în diferite poziţii ale cromozomului bacterian apar copii ale acidului
nucleic Mu. Atunci când structura genetică Mu va părăsi genomul bacterian va prelua o parte
din structura genetică bacteriană (circa 100-150 pb).

5. 5. Mecanismele de variabilitate bacteriană

Bacteriile sunt microorganisme haploide (cu excepţiile prezentate anterior), au un singur
cromozom iar pentru remanierea prin recombinare a genomului este necesară transferarea de
material genetic de la o tulpină („donator”) la tulpina receptor. În mod clasic poate avea loc un
transfer genetic „pe orizontală” între tulpini care fie fac parte din aceeaşi specie fie fac parte
din specii foarte înrudite, chiar dacă genotipic sunt diferite. Relativ recent a fost demonstrată
posibilitatea unor schimburi genetice între tulpini din specii diferite (ex. în ecosistemul
intestinal). Variabilitatea bacteriană presupune modificarea la un moment dat a
comportamentului celulei bacteriene sau a descendenţilor ei şi pot exista în principiu două
variante:
- variabilitatea fenotipică şi
- variabilitatea genotipică;

Variabilitatea fenotipică
Variaţiile fenotipice reprezintă modificări morfologice sau fiziologice de tip adaptativ,
care nu se transmit ereditar. Genomul nu este afectat.

Variabilitatea genotipică
 Variaţiile genotipice reprezintă modificări definitive ale materialului genetic
(cromozomial sau extracromozomial) care se transmit descendenţilor.
Mecanismele variaţiei genotipice sunt reprezentate de:
- mutaţie;
- transfer genetic urmat de recombinare genetică.
Mutaţia
Mutaţia reprezintă o modificare accidentală în secvenţa nucleotidică a unei gene, ducând
la modificări ale mesajului genetic.
Mutaţiile pot apărea prin:
- substituţii la nivelul materialului genetic;
- inversii;
- inserţii;
- deleţii.
Mutaţia spontană
Mutaţiile care apar în condiţii de mediu obişnuite şi fără intervenţia unui factor decelabil
se numesc mutaţii spontane.
Mutaţia indusă
Mutaţiile care se produc sub acţiunea unor factori fizici (de exemplu raze UV, radiaţii
ionizante etc.) sau chimici (de exemplu agenţii alchilanţi) care acţionează ca agenţi mutageni
se numesc mutaţii induse.
Rata mutaţiilor induse este semnificativ mai mare decât rata mutaţiilor spontane. Mutaţia
punctiformă are ca substrat alterarea unui singur nucleotid, respectiv a unui singur codon.
Mutaţiile extinse reprezintă alterări care depăşesc limitele unui codon, putând afecta
secvenţe mai mari ale uneia sau mai multor gene (mutaţie poligenică).
Mutaţiile regresive (retromutaţii) afectează celule mutante, determinând revenirea
acestora la tipul iniţial, restabilind secvenţa nucleotidică originară.
Mutaţiile supresoare permit exprimarea funcţiei anterioare a genei, deşi o modificare a
secvenţei bazelor nucleotidice persistă.
Principalele mecanisme de transfer al materialului genetic de la o bacterie donor la o
bacterie receptor sunt:
- transformarea;
- transferul mediat de bacteriofagi (transducţia);
- conjugarea.

Transformarea
Transformarea este un transfer genetic realizat atunci când bacteria acceptă ADN liber
provenit de la o bacterie donor sau din alte surse. Bacteria receptor trebuie să fie „competentă”
în a accepta ADN-ul de la bacteria donor.
Prima transformare a fost descrisă în 1928 de către Griffith, în experimente referitoare la
virulenţa pneumococilor faţă de şoarecele alb.
Transformarea poate avea loc doar atunci când bacteriile intră în faza staţionară a ciclului
celular. Pătruns în celula receptoare, un fragment de ADN exogen poate înlocui (prin
recombinare genetică) o secvenţă nucleotidică omologă, bacteria receptoare dobândind un
caracter genetic nou (de exemplu sinteza unei structuri capsulare).

Unele bacterii sunt „competente” în mod natural. În cazul bacteriilor care nu sunt „natural
competente”, pentru a putea realiza fenomenul de transformare este necesară tratarea chimică
a acestora, de ex. cu ioni de calciu.

Transferul genetic mediat de bacteriofagi se poate realiza prin:

- transducţie;
- conversie lizogenică.

Transducţia
Transducţia reprezintă transferul unui fragment genetic (cromozomial sau
extracromozomial) de la o bacterie la alta prin intermediul unui bacteriofag (de obicei un fag
temperat). Fagul se numeşte transductor. Bacteria receptoare se numeşte transductant.
Transducţia specializată (restrictivă)
Transducţia specializată este caracteristică fagilor transductori care au proprietatea de a
transfera numai un număr restrâns de gene bacteriene situate în imediata apropiere a situsului
de legare a profagului în cromozomul bacterian.
Transducţia generalizată (nerestrictivă)
Prin acest fenomen virtual, oricare din genele cromozomului bacterian, indiferent de
poziţia lor în genom, pot fi încorporate în mod accidental în particula virală matură pentru a
forma un fag transductor, care le poate transmite unor bacterii receptoare.
Transducţia generalizată poate fi realizată de un mare număr de fagi neintegraţi în
cromozomul bacterian atunci când intră în ciclul litic.

Conversia lizogenică reprezintă apariţia unui caracter nou la bacteriile care găzduiesc un
profag, de exemplu producerea toxinei difterice este realizată numai de către C. diphtheriae
purtător al fagului temperat (profagul β care deţine gena tox) iar producerea toxinei
scarlatinoase este posibilă numai în cazul în care Streptococcus pyogenes de grup A este
lizogenizat. Există şi fagi care sunt integraţi în regiuni care codifică pentru un anumit produs,
din genomul bacterian (ex. fagul P4 de la E. coli se integrează într-o genă care codifică pentru
leucină).

Conjugarea bacteriană reprezintă un proces de transfer de material genetic (cromozomial

sau extracromozomial) realizat prin intermediul unei legături intercelulare directe. Este
condiţionată de prezenţa factorului F în celula donatoare.
Receptorii specifici
Pentru realizarea legăturii intercelulare este necesară existenţa unor „receptori” de
suprafaţă atât la celula donator, cât şi la celula receptor. Aceştia vor permite „recunoaşterea
reciprocă”.

Fiziologia conjugării bacteriene

După un număr de ciocniri întâmplătoare, bacteriile F+formează cu bacteriile F-„perechi
de recombinare” şi între celulele alăturate se formează un canal de conjugare. Prin canalul de
conjugare se realizează transferul unidirecţional al materialului genetic. Fragmentul transferat
poate fi apoi integrat parţial sau total în genomul celulei receptoare, ducând la apariţia unor
proprietăţi noi ale acesteia, manifeste sau nu.
5. 6. Povestire adevărată
„Folosirea cunoştinţelor din domeniul geneticii, în munca de detectiv”
Îmbinarea examinării foarte detaliate a secvenţelor genomice microbiene cu o cunoaştere
aprofundată a evoluţiei bacteriilor poate fi utilă atât în obţinerea unor diagnostice de mare
precizie, cât şi în aplicarea unor teste de diagnostic relevante în medicina legală.
Spre exemplu, dorim să amintim situaţia creată în urma atentatelor teroriste din SUA, din
finalul anului 2001, perioadă în care o serie de instituţii, dar şi persoane particulare, au primit
plicuri conţinând un praf alb sau maroniu, care s-a dovedit în o parte dintre cazuri (au existat
şi situaţii de „alarmă falsă”) că au conţinut spori de Bacillus anthracis. Elemente mai concrete
cu privire la situaţia din acea perioadă vor fi prezentate la capitolul dedicat genului Bacillus.
După cartografierea genomului de B. anthracis s-au evidenţiat circa 3.500 de posibile
mutaţii nucleotidice unice. În funcţie de acestea se cunoaşte actualmente că tulpinile cunoscute
pot fi împărţite în 8 grupe, fiecare grup fiind la rândul său divizat în mai multe subgrupe.
Toate aceste grupe studiate sunt foarte stabile din punct de vedere al unei posibile variaţii
genetice (nu există „cross-link”-are între grupe), ceea ce face ca Bacillus anthracis să
reprezinte un „candidat ideal” pentru studii de biologie moleculară folosite în scopul punerii
la punct a unor teste care să identifice cu mare fineţe o anumită tulpină, inclusiv „originea”
acesteia.
Prin metode ale biologiei moleculare s-a demonstrat de exemplu că tulpina de B. anthracis
folosită în atacurile teroriste face parte din grupul Ames. Această încadrare a putut să fie
stabilită prin evidenţierea a 6 mutaţii specifice grupului Ames (4 la nivel cromozomial, una la
nivelul plasmidului pX01 şi una la nivelul plasmidului pX02).
Aşadar, iată cum, pentru o bacterie stabilă din punctul de vedere al unei posibile variaţii
genetice, se poate realiza o adevărată „muncă de detectiv” şi prin metode specifice de laborator
se poate stabili originea şi apartenenţa sa, pornind de la caracteristicile sale genetice.