Curs 11- Genetic

RECOMBINAREA GENETIC LA EUCARIOTE

Recombinarea genetic este procesul prin care are loc
transferul intra- sau intermolecular a unor secvene de ADN,
avnd ca rezultat modificri n nlnuirea genelor sau a unor
pri din gene. Se poate produce astfel, reasortarea unor nucleotide la
nivelul aceleiai molecule de ADN sau ntre molecule separate,
rezultnd, n final, una sau dou molecule recombinate.
La eucariote procesul de recombinare genetic este legat de
fenomenul sexualitii i se realizeaz n special n cursul meiozei,
fiind condiionat de realizarea contactelor ntre cromosomi urmat de
disjuncia independent a perechilor de cromosomi (bivaleni). n
cazul organismelor eucariote au fost descrise 3 tipuri de recombinare
genetic:
- recombinarea

intracromosomal

prin

crossing-over

(schimbul reciproc de segmente cromosomale);

- recombinarea

intercromosomal

prin

disjuncia

independent a cromosomilor omologi;

- recombinarea genetic nereciproc prin conversie genetic.
Recombinarea

intracromosomal

(crossing-over)

se

realizeazatt n meioz ct i n mitoz.

1

Ea poate avea loc intergenic, ct i intragenic.

Recombinarea intragenic este un fenomen rar. Acest fenomen
manifest interferen negativ care determin creterea probabilitii
ca un al 2-lea crossing-over s aib loc n apropierea primului.
Formarea bivalenilor n meioz presupune participarea a 2
cromosomi de origine diferit (matern i patern), ntre care se
stabilesc contacte intercromatidice (sinapse) ce conduce la formarea
unei structuri specializate numit complex sinaptinemal.
Importana complexului sinaptinemal n desfurarea recombinrii
genetice intracromosomale este dovedit de faptul c la organismele la
care nu se produce acest complex, nu are loc procesul de crossingover.
Formarea chiasmelor este dependent de sinteze proteice ce au loc
la sfritul zigotenului.
Procesul de recombinare genetic implic ruperea i reunirea
cromatidelor participante, fapt ce conduce la un schimb reciproc
de segmente de ADN de dimensiuni egale i la apariia de
cromosomi (iar apoi de gamei) recombinai (Fig. 1).

Fenomenul de crossing-over se realizeaz mai mult sau mai puin

randomic, de-a lungul perechilor de cromosomi omologi. Astfel,
probabilitatea realizrii recombinrii ntre 2 loci crete odat cu
distana dintre acetia pe cromosomi.
Deoarece procesul de crossing-over afecteaz numai 2 dintre
cromatidele bivalenilor, doar 50 % dintre produii meiozei sunt de
tip recombinat, restul de 50 % sunt de tip parental.
S-a constatat c ntre genele plasate pe cromosomii omologi, n
afar de crossing-over simplu, pot aprea i crossing-overe multiple
(Fig.2). Dac procesul de recombinare are loc la nivelul unor gene
heterozigotze, indiferent de numrul de crossing-overe ce se
realizeaz, procentul de recombinare nu depete 50 %.

Procesul recombinrii genetice poate avea loc i n celulele

somatice. Schimburile intercromatidice (sister chromatid exchange)
au fost evideniate mai ales n celulele mamaliene aflate n cultur
in vitro, ele nefiind urmate, de obicei, de modificri fenotipice
deoarece cromatidele implicate sunt identice.
Fenomenul recombinrii mitotice a fost studiat n special n
cazul fungilor (Aspergillus nidulans, S. cerevisiae) la care n ciclul
de via predomin haplofaza.
Recombinarea mitotic poate avea loc n cursul metafazei i
presupune asocierea cromosomilor omologi i realizarea schimbului
genetic nainte de diviziunea centromerului.

Procesul de crossing-over se poate produce i la nivelul aceleiai

gene (crossing-over intragenic).
n mecanismul molecular al recombinrii genetice de tip
crossing-over,

sunt

implicate

proteine

specifice,

procesul

recombinrii fiind asociat cu cel de reparare genetic.

Recombinarea intercromosomal are loc prin disjuncia
independent a perechilor de cromosomi care reprezint suportul
material pentru disjuncia perechilor de factori ereditari.
Segregarea independent are loc la trecerea celulelor sexuale de
la metafaza I la anafaza I, cnd are loc aezarea ntmpltoare a
cromosomilor de origine matern sau patern deasupra sau
dedesubtul planului ecuatorial al plcii metafazice.
Acest comportament al cromosomilor de origine maten, care se
mperecheaz cu cei de origine patern i apoi separarea perechilor
respective, a fost comparat de ctre Muller cu formarea perechilor
de dansatori n timpul dansului i separarea lor la sfritul acestuia.
Din aceast cauz, Muller a denumit acest comportament dansul
cromosomilor . Cu ct numrul cromosomilor i a genelor coninute
este mai mare cu att numrul de combinaii posibile de gamei i
de organisme este mai mare. Posibilitatea ca un organism s fie
asemntor cu altul este de (1/2)2n, n care n =numr de perechi de

cromosomi, iar 2n reprezint numrul total de cromosomi din

complementul speciei respective.
Conversia genic este o recombinare nereciproc. In cadrul
conversiei genice, un segment din molecula de ADN a unei
cromatide se desprinde i se ataeaza de alta cromatida. Este posibil,
in acest mod, ca un cromozom sa conina o gena in doua exemplare
(daca transferul s-a realizat intre cromozomi omologi), iar altul o
gena in minus. Are loc cu o frecventa mai mare in cursul diviziunii
meiotice dar poate avea loc si in celulele somatice.

Ea a fost

evideniat prin analiza tetradelor la ciupercile din genurile

Saccharomyces, Aspergillus, Neurospora unde apar abateri de la
raportul normal de segregare alelic, ca i cum se produce o
transformare a alelei A n a (Fig. 3).

Frecvena recombinrii genetice nereciproce poate crete de la un

capt la altul al unui locus genic, fenomen numit polarizarea
6

conversiei. Astfel , la fungi, n locul raportului de segregare normal

de
4 : 4, se ntlnesv valori diferite ale acestui raport: 6 : 2, 5 : 3, 7: 1
sau chiar 8 :0. fenomenul conversiei genice a fost evideniat i la
plante, n cazul unor gene ce intervin n determinismul pigmentaiei,
precum i la virusuri (n special bacteriofagi). Unii autori consider
c, de fapt, conversia genic este consecina unui proces de
recombinare, n urma cruia apar nepotriviri ale unor baze azotate
situate pe cromatide omoloage. Aceste zone de nepotrivire sunt
reparate prin excizie i prin adugarea nucleotidei corespunztoare.
Prin reparaie poate reaprea astfel, tipul normal.

Curs 12- Genetic

RECOMBINAREA GENETIC LA PROCARIOTE
La procariote au fost descrise mai multe ci de transfer de
material genetic: transformare genetic, conjugare, sexducie i
transducie, asociate cu mecanisme ce asigur integrarea noii
informaii genetice n genomul gazdei. Indiferent de natura sa,
transferul de gene reprezint un fenomen n care moeculele
informaionale i schimb gazda, avnd de traversat dou bariere
celulare: una la ieire din celula donatoare i alta la intrarea n celula
receptoare.
1. Transformarea genetic
Fenomenul transformrii genetice a fost descoperit n 1928 de ctre
Griffith, n urma experimentelor realizate cu pneumococi asupra
oarecilor. Ulterior , Avery, Mac Leod i McCarthy, au descoperit, n
1944, c agentul transformant este reprezentat de ADN izolat din
celulele bacteriene.
8

Transformarea genetic la bacterii presupune transferul unui

fragment de ADN (cromosomal sau plasmidial) de la o bacterie
donatoare i ncorporarea acestuia n genomul unei bacterii
receptoare.
Asemenea fragmente de ADN sunt, n general, de dimensiuni mari
(n medie de 20.000 perechi de nucleotide), putnd conine gene utile
care, ptrunse n bacteria receptoare, pot nlocui printr-un proces de
recombinare o secven de nucleotide omoloag din genomul acesteia.
Informaia genetic nou integrat n cromosomul bacteriei receptoare
este transmis stabil de-a lungul generaiilor.
Fenomenul de transformare genetic a fost evideniat prima dat la
pneumococul Diploccocus pneumoniae i ulterior la Bacillus subtilis,
Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Staphylococcus sp., etc.
Pentru a putea prelua ADN exogen din mediul extracelular, celulele
receptoare trebuie s manifeste o
anumit stare specific numit stare de competen. Aceasta
presupune ca peretele celular i membrana celular ale celulei
bacteriene receptoare s fie permeabile pentru ADN exogen, iar celula
s se afle ntr-o anumit faz a ciclului de via care s permit
acceptarea acestuia. n cursul realizrii competenei are loc activarea
unor receptori specifici localizai la nivelul peretelui celular cu rol de
legare a ADN exoged la suprafaa celular. Numrul receptorilor
9

activi, variaz de la o specie bacterian la alta, de exemplu: la

Streptococcus au fost identificai 80 de receptori, la Bacillus subtilis
50, iar la Haemophilus doar 4 receptori.
La unele specii bacteriene, starea de competen este o stare
natural, fiziologic, aprnd ntr-o anumit etap a ciclului de via i
dureaz un anumit interval de timp. De exemplu, la Azotobacter,
Staphylococcus, Pneumococcus competena este maxim pe parcursul
fazei logaritmice, n timp ce la alte specii Bacillus, Pseudomonas,
Methylobacterium- competena este maxim la trecerea de la faza
logaritmic la cea staionar.
n cazul altor specii, starea de competen poate fi indus prin
tratamente specifice (oc de temperatur, adugarea unor ioni etc.).
ntr-o populaie bacterian, proporia celulelor capabile de a
prelua ADN exogen poate fi estimat pe baza frecvenei de
transformare, urmrind un anumit marker genetic. Pentru a se obine o
frecven ridicat de integrare/ transformare, este necesar ca ADN
transformant s provin de la o tulpin bacterian nrudit (ADN
omolog). n cazul utilizrii unor organisme nenrudite (ADN
heterolog), eficiena procesului de transformare este foarte sczut.
Multe bacterii se pot liza n mod natural, mai ales n timpul
etapelor finale ale ciclului celular. n aceste condiii, ADN este eliberat

10

n mediu extracelular de unde poate fi preluat de alte bacterii aflate n

aceeai populaie.
La bacterii, procesul natural de transformare genetic (cu
fragmente de ADN cromosomal eliberat prin metoda lizei celulelor
bacteriene) se realizeaz n mai multe etape:
1. legarea reversibil (adsorbia) a moleculelor de ADN dublu
catenar, la nivelul situsurilor receptoare aflate pe suprafaa
celular;
2. preluarea ADN exogen de ctre celulele competente;
3. convertirea ADN dublu catenar la forma monocatenar, prin
degradarea uneia dintre catenele moleculei iniiale;
4. integrarea segmentului de ADN monocatenar n cromosomul
celulei receptoare;
5. segregarea i exprimarea fenotipic a noii informaii genetice
integrate n genomul celulei gazd.
Procesul de transformare este destul de rspndit n natur, mai ales
n cazul tulpinilor bacteriene nrudite, el jucnd un rol important n
evoluia bacteriilor. Aceast concluzie este ntrit i de observaia c
transferul de gene prin transformare genetic are loc nu numai pe
orizontal (ntre bacterii nrudite) ci i ntre grupe de organisme
nenrudite (fenomen ce explic, de exemplu, rspndirea rezistenei la
antibiotice).
11

2. Conjugarea bacterian
Conjugarea bacterian reprezint un mod de transfer
unidirecional de ADN de la o celul

donatoare la o celul

receptoare prin intermediul unei legturi intercelulare directe (pil de

sex) i condionat de prezena n bacteria donatoare a unui element
genetoic specializat numit conjugon.
Fenomenul conjugrii a fost descoperit n 1946 (de ctre
Lederberg i Tatum) n urma experimentelor cu tulpini de
Escherichia coli ce conineau sau nu o plasmid specific notat F.
Din acest punct de vedere, celulele bacteriene care conin plasmida
F ( factorul F) sunt notate F +, iar cele care nu conin aceast
plasmid sunt notate F -. n cazul bacteriilor Gram negative, n afar
de plasmida F, funciile necesare procesului de conjugare se gsesc
la nivelul mai multor plasmide. De exemplu, n cazul plasmidelor
de rezisten la antibiotice (plasmida RP4) i plasmidele Col ce
conin determinani genetici pentru sinteza colicinelor.
Factorul F este alctuit din ADN dublu catenar circular cu o
lungime de 94,5 kb i n numr de 1-2 copii/celul. Transferul prin
conjugare al acestor plasmide se datoreaz prezenei unei regiuni
specifice, regiunea tra, ce reprezint cca 30 % din lungimea
plasmidei F. Cu excepia fectorului F, celelalte plasmide conjugative
12

pot include i alte tipuri de gene: pentru rezistena la antibiotice,

toleran la metale grele, virulen patogenitate etc.
Studiile asupra procesului de conjugare efectuate la E. coli ,
au permis stabilirea etapelor acestuia:
Formarea i stabilirea agregatelor de conjugare;
Pregtirea ADN pentru transfer
Transferul ADN conjugativ
Refacerea structurii circulare i dublu catenare a ADN
transferat.
n prima etap are loc sinteza de ctre celula donatoare a pililor de
sex structuri specializate, tubulare, localizate la suprafaa celular,
alctuite din molecule de pilin (protein a crei sintez este codificat
de gene plasmidiale).
A 2-a etap a conjugrii presupune intervenia unei proteine,
codificat de genele plasmidiale,

care are rolul de a realiza o

cresttur monocatenar la nivelul genei oriT (originea transferului).

La nivelul captului 5 al catenei de ADN crestat, se leag o protein
specific, codificat tot de gene plasmidiale de la nivelul regiunii tra.
Are loc apoi, transferul catenei crestate, ncepnd cu captul 5 ,
transferul fiind cuplat cu procesul de replicare al plasmidei, conform
modelului cercului rotativ. In acest fel, pe msur ce procesul de
13

replicare avanseaz, una dintre catenele vechi (cea crestat) se

deplaseaz prin pilul de sex n celula receptoare (Fig. 1).
In acelai timp, n celula donatoare are loc restabilirea structurii
factorului F. la nivel populaiei de bacterii, consecina transferului
factorului F este

masculinizarea acesteia, adic se produce

generalizarea caracterului F +al celulelor bacteriene.

Fig. 1. Reprezentarea schematic a procesului de conjugare

Un tip special de conjugare este cel realizat ntre celulele bacteriene
care conin factorul F integrat n cromosom (celule de tip Hfr) i
celulele de tip F (Fig. 2). Integrarea factorului F n cromosomul
bacterian nu se realizeaz la ntmplare , ci la nivelul unor situsuri ce
14

prezint omologie ntre cele dou tipuri de molecule. Celulele

rezultate n urma unui asemenea proces de integrare , au primit
denumirea de celule de tip Hfr (High frequency of recombination).

Modalitatea specific de integrare a plasmidei F n cromosomul

bacterian, face ca secvena oriT s fie localizat aproape de una dintre
marginile plasmidei linearizate i integrate la captul acesteia,
consecina fiind transferul specific al ADN monocatenar n celula
receptoare.
In a 3-a etap, n cazul transferului dintre bacteriile F + i F -, dup
crestarea monocatenar la nivelul secvenei OriT, ncepe transferul
AND monocatenar reprezentat de o scurt secven din plasmida F i
apoi de o copie a AND cromosomal al gazdei (Fig. 2). Cea mai mare
parte a plasmidei F rmne la nivelul celuilalt capt al cromosomului,
i doar foarte rar este transferat n celula acceptoare. Cantitatea de
informaie genetic transferat, proprie celulei donatoare, este direct
proporional cu timpul n care cele dou celule au stat n contact (cu
ct contactul este mai lung, cu att segmentul de ADN transferat va fi
mai mare). Astfel, pentru transferul complet al ADN cromosomal la E.
coli sunt necesare aproximativ 90-120 minute de contact ntre celule,
15

n timp ce transferul plasmidei F din bacteria F + ntr-o bacterie F

dureaz 2-3 min.
Procesul de transfer de segmente cromosomale din bacteria donor
Hfr n cea acceptoare F este urmat de cele mai multe ori de
transformare genetic (fenomen controlat de o serie de enzime
sintetizate de gazd) ceea ce nseamn c poriuni din respectivul
segment se integreaz n genomul noii gazde fiind meninut i
transmis constant n generaiile urmtoare.
Procesul de conjugare dintre celulele Hfr i celulele de tip F

servete la realizarea hrilor cromosomale la bacterii , distana dintre

gene (dispuse n ordine pe segmentul transferat) exprimndu-se n
uniti de timp (minute).
Transferul de gene cromosomale bacteriene mediat de plasmidele de
sex este numit sexducie. In urma conjugrii F + x F se obin doar
celule de tip F + , care sunt parial diploide , coninnd alturi de
genele proprii i gene similare provenite de la bacteria donatoare.
3. Transducia fagic
Transducia fagic este procesul prin care un fragment din
cromosomul bacterian este transferat de la o bacterie la alta prin
intermediul capsidei (nveliului proteic) anumitor bacteriofagi
temperai. Fenomenul a fost descris iniial la bacteriofagi specifici
16

unor tulpini de Salmonella typhimurium, iar ulterior el a fost mai bine

studiat n cazul fagului specific tulpinilor de E. Coli . In funcie de
structura genetic a fagilor transductori i de mecanismul de formare a
materialului genetic al particulri fagice, au fost descrise dou tipuri de
transducie fagic: transducie specializat i transducie generalizat.
Bacteiofagii ce realizeaz transducia generalizat produc
particule ce conin, n cea mai mare parte, ADN provenit din bacteria
gazd (din orice parte a cromosomului) i doar o foarte mic parte
genom fagic.
n cazul fagilor ce determin transducia specializat, ei produc
particule ce conin att gene fagice (majoritare) ct i gene
cromosomale bacteriene provenite dintr-o anumit regiune a
cromosomului bacterian. Cel mai cunoscut bacteriofag ce realizeaz
transducie specializat este fagul . n forma lui natural, fagul
poate prelua, ca fag transductor, doar scurte secvene de ADN din
genomul gazdei n care s-a multiplicat (dup ce a parcurs ciclul
lizogen), dimensiunea acestora fiind limitat de capsida fagic.
Secvenele pe care le poate prelua fagul sunt foarte precise.
Tranducia generalizat este mediat de fagi viruleni precum i
de anumii fagi temperai ai cror genom nu se integreaz la nivelul
unor situsuri specifice din cromosomul gazdei (de exemplu fagul P1).

17