Metode de analiza ale secventelor

ADN si ARN

Electroforeza pe gel de
agaroza
 Structura acizilor nucleici
poate fi studiata in prezent
utilizand diverse metode
 Scopul analizarii secventelor
acizilor nucleici este
complex: in vederea
studierii, sintetizarii si
multiplicarii genelor, dar si
pentru detectarea mutatiilor
 Ingineria genetica reprezinta
un ansamblu de tehnici de
laborator folosite pentru
modificarea ADN-ului
organismelor vii
 ADN-ul poate fi extras din
sange total, dar si din
diferite celule sau tesuturi
 Pentru extragerea ADN-ului
se folosesc diverse metode
chimice
 Izolarea ADN-ului constituie
si ea o etapa importanta in
cadrul inginerie genetice
 Clonarea ADN-ului
semnifica amplificarea unei
molecule sau a unei catene;
o clona reprezentand un
numar mare de molecule
sau celule identice,
provenind dintr-o celula sau
molecula initiala
 Clonarea unui fragment de
ADN se realizeaza fie prin
insertia acestuia intr-un
vector care se va multiplica
intr-o celula gazda, fie prin
metoda PCR
 Vectorii frecvent utilizati
sunt: plasmidele, cosmidele
si bacteriofagii
 Metoda PCR are ca
finalitate obtinerea intr-un
timp scurt a unui numar
foarte mare de copii ale unei
gene sau a unui anumit
fragment de ADN
 Aceasta se realizeaza printr-
o amplificare enzimatica, ce
are loc in mod exponential
 PCR cuprinde 30-40 de
cicluri realizate cu un aparat
automat
 In vederea detectarii
mutatiilor se utilizeaza
metode diferite
 Pentru a detecta mutatiile
cunoscute se folosesc
urmatoarele metode: PCR si
separarea pe baza marimii
fragmentului de ADN; PCR
si digestia cu enzime de
restrictie sau metoda
amplificarii cu alele
specifice.
 Pentru detectarea mutatiilor
necunoscute se folosesc
metode precum: metoda
FISH, electroforeza in camp
pulsatil sau, in cazul
mutatiilor punctiforme,
metoda clivarii cu
ribonucleaze, metoda
proteinelor functionale ori
analiza polimorfismelor
conformationale
monocatenare.
 Secventializarea ADN-
ului uman permite:
finalizarea secventei
complete a genomului
uman(PGU), clonarea
genelelor localizate,
precum si punerea la
dispozitia publicului a
intregii secvente de
ADN in mod gratuit
Secventializarea ADN

 Secventializarea ADN
reprezinta identificarea
tipului, felului si succesiunii
nucleotidelor dintr-un
fragment ADN de analizat
 In momentul de fata s-au
dezvoltat tehnici de
secventiere automate: fie
chimic prin metoda Maxam-
Gilbert, fie enzimatic prin
metoda Sanger
 Metoda chimica presupune
marcarea ADN-ului supus
secventializarii la unul din
capetele sale, denaturarea,
urmata de de separarea prin
electroforeza in gel a celor
doua catene
 Are loc apoi taierea ADN-
ului monocatenar cu
obtinerea unor fragmente de
ADN cu lungime varibila ce
pot fi separate electroforetic
pe geluri de poliacrilamida
 Metoda enzimatica Sanger
consta din replicarea ADN-
ului monocatenar incepand
de la un punct precis de
initiere, replicarea fiind apoi
intrerupta in functie de baza
existenta in secventa de
analizatde catre
dideoxinucleotide
Metode de separare ale acizilor
nucleici
 In functie de scopul urmarit,
pentru separarea acizilor
nucleici se pot utiliza:
centrifugarea, cromatografia
sau electroforeza
 Metoda centrifugarii ofera
posibilitatea obtinerii de
ARN in cantitati
considerabile si de inalta
puritate
 Din cadrul metodelor
cromatografice, pentru
separarea acizilor nucleici
se utilizeaza cromatografia
de gel filtrare, cromatografia
de schimb ionic si metoda
dHPLC
 Cromatografia de gel filtrare
se foloseste pentru
purificarea produsilor PCR
 Cromatografia de  dHPLC este o metoda
schimb ionic se de screening a
utilizeaza pentru mutatiilor punctiforme
extractia rapida de ADN
si ARN din diverse
probe biologice, in
cantitati suficiente
Electroforeza fragmentelor ADN si
ARN
 Electroforeza fragmentelor de
ADN este o metoda analitica
folosita pentru separarea
acestor fragmente in functie de
marimea lor
 In solutie libera, la pH neutru
sau alcalin, acizii nucleici nu pot
fi separati
 Pentru separarea lor se se
folosesc matrici de gel de
agaroza sau poliacrilamida
 Gelurile de agaroza sunt
folosite pentru separarea
acizilor nucleici cu mase mari,
in timp ce diferentierea
moleculelor de acizi nucleici cu
mase moleculare mici se face in
geluri de poliacrilamida
 Un camp electric determina
migrarea lor prin gel
 Datorita numarului mare de
resturi fosfat, acizii nucleici au o
puternica incarcatura negativa,
migrand in campul electric spre
anod
 Fragmentele se separa
sub forma unor benzi
electroforetice
 Mobilitatea unui
fragment de ADN este
invers proportionala cu
masa moleculara, fiind
de asemenea
influentata de o serie
de factori
 In conditii ideale, viteza de
migrare a fragmentelor este
direct proportionala cu
tensiunea aplicata
 Vascozitatea gelului se
poate reduce in momentul
cresterii temperaturii ceea
ce produce distorsiuni ale
procesului de migrare
 Tampoanele de
electroforeza au rolul de a
mentine un pH si o putere
ionica constante, la valori
optime pentru separare
 Agentii denaturanti(ureea,
formamida, formaldehida)
indeplinesc functia de
combatere a fenomenelor
de agregare si adsorbtie a
moleculelor de acizi nucleici
pe matricea de gel, dar si
functia de inlaturare a
diferentelor conformationale
 Dupa ce separatia este
completa, fragmentele ADN
avand lungimi diferite sunt
adesea vizualizate prin
utilizarea unui colorant
fluorescent precum bromura
de etidiu
 Marimea fragmentelor este
exprimata in:”nucleotide”,
perechi de baze” sau “kb”-
pentru o mie de perechi de
baze
 Determinarea marimii
fragmentelor se face
uzual prin compararea
cu “DNA-ladders” ce
contin fragmente liniare
de ADN, de lungimi
cunoscute
 Electroforeza acizilor nucleici
este o etapa obligatorie in orice
protocol de analiza a acizilor
nucleici
 Prin ea se realizeaza:
separarea fragmentelor ADN
rezultate in urma digestiei cu
enzime de restrictie; verficarea
amplificarii PCR; identificarea
si/sau determinarea
semicantitativa a fragmentelor
ADN rezultate in urma
amplificarii PCR; detectia si
determinarea semicantitativa a
ADN-ului genomic obtinut in
urma extractiei din tesuturi
 Analizele ADN si ARN au
asadar roluri cruciale in
detectarea mutatiilor, in
diagnosticarea bolilor genetice,
a cancerelor, in diagnosticul
microbiologic
 Dar si in cadrul testelor de
paternitate si de identificare a
persoanelor
 In determinarea profilului
genetic al bolilor
 In teste de filogenie
 Toate aceste analize cuprind in
mod obligatoriu si etapa de
electroforeza
 De aici sesizam cu
usurinta importanta
functie a utilizarii
tehnologiei ADN in
prognosticare,
diagnosticare,
monitorizare si terapie
 Tehnologia ADN dispune de
un larg spectru de
aplicabilitate, in cele mai
diverse si complexe domenii
ale medicinii, atat in
cercetarea fundamentala ce
ne ofera permanent noi date
si informatii, cat si in
cercetarea aplicativa ce
ofera noi solutii terapeutice