Sunteți pe pagina 1din 22

Metode de analiza ale secventelor

ADN si ARN

Electroforeza pe gel de
agaroza
 Structura acizilor nucleici
poate fi studiata in prezent
utilizand diverse metode
 Scopul analizarii secventelor
acizilor nucleici este
complex: in vederea
studierii, sintetizarii si
multiplicarii genelor, dar si
pentru detectarea mutatiilor
 Ingineria genetica reprezinta  Izolarea ADN-ului constituie
un ansamblu de tehnici de si ea o etapa importanta in
laborator folosite pentru cadrul inginerie genetice
modificarea ADN-ului  Clonarea ADN-ului
organismelor vii semnifica amplificarea unei
 ADN-ul poate fi extras din molecule sau a unei catene;
sange total, dar si din o clona reprezentand un
diferite celule sau tesuturi numar mare de molecule
 Pentru extragerea ADN-ului sau celule identice,
se folosesc diverse metode provenind dintr-o celula sau
chimice molecula initiala
 Clonarea unui fragment de  Metoda PCR are ca
ADN se realizeaza fie prin finalitate obtinerea intr-un
insertia acestuia intr-un timp scurt a unui numar
vector care se va multiplica foarte mare de copii ale unei
intr-o celula gazda, fie prin gene sau a unui anumit
metoda PCR fragment de ADN
 Vectorii frecvent utilizati  Aceasta se realizeaza printr-
sunt: plasmidele, cosmidele o amplificare enzimatica, ce
si bacteriofagii are loc in mod exponential
 PCR cuprinde 30-40 de
cicluri realizate cu un aparat
automat
 In vederea detectarii  Pentru detectarea mutatiilor
mutatiilor se utilizeaza necunoscute se folosesc
metode diferite metode precum: metoda
 Pentru a detecta mutatiile FISH, electroforeza in camp
cunoscute se folosesc pulsatil sau, in cazul
urmatoarele metode: PCR si mutatiilor punctiforme,
separarea pe baza marimii metoda clivarii cu
fragmentului de ADN; PCR ribonucleaze, metoda
si digestia cu enzime de proteinelor functionale ori
restrictie sau metoda analiza polimorfismelor
amplificarii cu alele conformationale
specifice. monocatenare.
 Secventializarea ADN-
ului uman permite:
finalizarea secventei
complete a genomului
uman(PGU), clonarea
genelelor localizate,
precum si punerea la
dispozitia publicului a
intregii secvente de
ADN in mod gratuit
Secventializarea ADN

 Secventializarea ADN
reprezinta identificarea
tipului, felului si succesiunii
nucleotidelor dintr-un
fragment ADN de analizat
 In momentul de fata s-au
dezvoltat tehnici de
secventiere automate: fie
chimic prin metoda Maxam-
Gilbert, fie enzimatic prin
metoda Sanger
 Metoda chimica presupune  Metoda enzimatica Sanger
marcarea ADN-ului supus consta din replicarea ADN-
secventializarii la unul din ului monocatenar incepand
capetele sale, denaturarea, de la un punct precis de
urmata de de separarea prin initiere, replicarea fiind apoi
electroforeza in gel a celor intrerupta in functie de baza
doua catene existenta in secventa de
 Are loc apoi taierea ADN- analizatde catre
ului monocatenar cu dideoxinucleotide
obtinerea unor fragmente de
ADN cu lungime varibila ce
pot fi separate electroforetic
pe geluri de poliacrilamida
Metode de separare ale acizilor
nucleici

 In functie de scopul urmarit,  Din cadrul metodelor


pentru separarea acizilor cromatografice, pentru
nucleici se pot utiliza: separarea acizilor nucleici
centrifugarea, cromatografia se utilizeaza cromatografia
sau electroforeza de gel filtrare, cromatografia
 Metoda centrifugarii ofera de schimb ionic si metoda
posibilitatea obtinerii de dHPLC
ARN in cantitati  Cromatografia de gel filtrare
considerabile si de inalta se foloseste pentru
puritate purificarea produsilor PCR
 Cromatografia de  dHPLC este o metoda
schimb ionic se de screening a
utilizeaza pentru mutatiilor punctiforme
extractia rapida de ADN
si ARN din diverse
probe biologice, in
cantitati suficiente
Electroforeza fragmentelor ADN si
ARN

 Electroforeza fragmentelor de  Gelurile de agaroza sunt


ADN este o metoda analitica folosite pentru separarea
folosita pentru separarea acizilor nucleici cu mase mari,
acestor fragmente in functie de in timp ce diferentierea
marimea lor moleculelor de acizi nucleici cu
 In solutie libera, la pH neutru mase moleculare mici se face in
sau alcalin, acizii nucleici nu pot geluri de poliacrilamida
fi separati  Un camp electric determina
 Pentru separarea lor se se migrarea lor prin gel
folosesc matrici de gel de  Datorita numarului mare de
agaroza sau poliacrilamida resturi fosfat, acizii nucleici au o
puternica incarcatura negativa,
migrand in campul electric spre
anod
 Fragmentele se separa
sub forma unor benzi
electroforetice
 Mobilitatea unui
fragment de ADN este
invers proportionala cu
masa moleculara, fiind
de asemenea
influentata de o serie
de factori
 In conditii ideale, viteza de  Tampoanele de
migrare a fragmentelor este electroforeza au rolul de a
direct proportionala cu mentine un pH si o putere
tensiunea aplicata ionica constante, la valori
 Vascozitatea gelului se optime pentru separare
poate reduce in momentul  Agentii denaturanti(ureea,
cresterii temperaturii ceea formamida, formaldehida)
ce produce distorsiuni ale indeplinesc functia de
procesului de migrare combatere a fenomenelor
de agregare si adsorbtie a
moleculelor de acizi nucleici
pe matricea de gel, dar si
functia de inlaturare a
diferentelor conformationale
 Dupa ce separatia este
completa, fragmentele ADN
avand lungimi diferite sunt
adesea vizualizate prin
utilizarea unui colorant
fluorescent precum bromura
de etidiu
 Marimea fragmentelor este
exprimata in:”nucleotide”,
perechi de baze” sau “kb”-
pentru o mie de perechi de
baze
 Determinarea marimii
fragmentelor se face
uzual prin compararea
cu “DNA-ladders” ce
contin fragmente liniare
de ADN, de lungimi
cunoscute
 Electroforeza acizilor nucleici
este o etapa obligatorie in orice
protocol de analiza a acizilor
nucleici
 Prin ea se realizeaza:
separarea fragmentelor ADN
rezultate in urma digestiei cu
enzime de restrictie; verficarea
amplificarii PCR; identificarea
si/sau determinarea
semicantitativa a fragmentelor
ADN rezultate in urma
amplificarii PCR; detectia si
determinarea semicantitativa a
ADN-ului genomic obtinut in
urma extractiei din tesuturi
 Analizele ADN si ARN au
asadar roluri cruciale in
detectarea mutatiilor, in
diagnosticarea bolilor genetice,
a cancerelor, in diagnosticul
microbiologic
 Dar si in cadrul testelor de
paternitate si de identificare a
persoanelor
 In determinarea profilului
genetic al bolilor
 In teste de filogenie
 Toate aceste analize cuprind in
mod obligatoriu si etapa de
electroforeza
 De aici sesizam cu
usurinta importanta
functie a utilizarii
tehnologiei ADN in
prognosticare,
diagnosticare,
monitorizare si terapie
 Tehnologia ADN dispune de
un larg spectru de
aplicabilitate, in cele mai
diverse si complexe domenii
ale medicinii, atat in
cercetarea fundamentala ce
ne ofera permanent noi date
si informatii, cat si in
cercetarea aplicativa ce
ofera noi solutii terapeutice