Autoradiografia, tehnici de

diagnostic molecular
de Anca Acasandrei
Raluca Aftodor

AUTORADIOGRAFIA
Reprezinta o metoda care foloseste o emulsie
fotografica intinsa pe o sectiune de tesut, pentru a localiza
materialul radioactiv tisular.
Realizarea practica: consta in injectarea unor molecule
precursoare, de care celulele au nevoie in sinteza
moleculelor mari, cum sunt AND-ul sau COLAGENUL.
Spre exemplu, celulele care sintetizeaza ANDul,utilizeaza timidina tritiata, devenind radioactive.

Tesutul este prelucrat in mod obisnuit, pana la

operatiunea de intindere a sectiunii pe emulsia
fotografica. Aceasta este tinuta un timp, pentru ca radiatia
izotopului folosit,timidina tritiata si mai concret particule
beta de joasa energie emise de aceasta sa impresioneze
emulsia fotografica.
Ulterior, emulsia fotografica este developata si
granulele negre de argint indica localizarea
componentului tisular radioactiv.
Autoradiografia se poate realiza folosind sectiuni
subtiri de masa plastica, pentru examinarea la
microscopul electronic de transmisie.

HISTORADIOGRAFIA
Reprezinta o microradiografie cu raze X,a unui
preparat intins pe lama.
Aceasta metoda evidentiaza diferentele de densitate,
ca si o radiografie obisnuita,fiind utilizata frecvent la
examinarea sectiunilor de os stefuite sau a altor tesuturi
mineralizate.
Sectiunea slefuita de os este pusa in contact cu o
emulsie fotografica iar apoi este developata si privita la
microscop.

TEHNICI DE DIAGNOSTIC
MOLECULAR

Enzimele de restrictie
Sunt endonucleaze bacteriene,care scindeaza
moleculele de AND,la nivelul unor zone strict
specifice,generand
fragmente
de
lungimi
variabile,numite fragmente de restrictie(FR).
Enzimele de restrictie isi exercita activitatea
endonucleazica doar in prezenta unei anumite secvente
nucleotidice,cu lungime intre 4-8 perechi de baze
denumita SITUS DE RECUNOASTERE sau DE
RESTRICTIE(SR).

Reactia polimerizarii in lant

Polymerase chain reaction(PCR)
Este o metoda cu un principiu ce se bazeaza pe
procesul replicarii semiconservative si care permite
realizarea amplificarii selective si rapide a ADN sau
ARN.
Este o tehnica:- simpla
-economica
-total automatizata

Esantionul ADN este introdus intr-un tub ce contine

ca reactivi o ADN-polimeraza termostabila,cele 4
dezoxiribonucleotide trifosfat si 2 oligonucleotide
sintetice numite amorse sau primeri.
Punctele la care se initiaza activitatea ADN-polimerazei
sunt reprezentate de amorse,a caror secventa nucleotidica
trebuie sa fie complementara cu secventele ADN ce
flancheaza capetele segmentului care va fi amplificat.
Proba este denaturata termic,amorsele hibridizeaza cu
secventele complementare si,pornind de la amorse,ADNpolimeraza incepe sa adauge dezoxiribonucleotide in
sensul 5-3,pe matritele reprezentate de monocatenele
segmentului tinta.

Racirea,in prezenta excesului de amorse,duce la

hibridizarea acestora cu secventele nou sintetizate iar
incalzirea mediului determina initierea unei noi reactii de
polimerizare.
Cantitatea optima este obtinuta dupa mai putin de 30
de cicluri de reactie,cand in tub vor exista cate 10 la 9
copii ale tintei pentru fiecare din secventele ramase
neamplificate.
PCR este o metoda preparativa nu numai pentru
analiza secventei nucleotidice ci si pentru toate celelalte
proceduri utilizate in analiza ADN,datorita puritatii si
cantitatii materialului pe care il produce.

Tehnicile SOUTHERN
BLOTTING,NORTHERN
BLOTTING,WESTERN BLOTTING
Metoda marcarii radioactive a ADN,numita
SOUTHERN BLOTTING permite analiza structurii si
continutului genic al fragmentelor rezultate prin digestia cu
enzime de restrictie.
Tehnica conduce la denaturarea chimica a fragmentelor
de ADN incluse in gel,dupa care monocatenele sunt
transferate prin capilaritate pe o membrana de naylon sau
de nitroceluloza.Se obtine o replica a modelului de benzi
din gelul de agaroza.

Moleculele ADN de pe membrana sunt expuse unor

probe de ADN sau ARN ,marcate radioactiv, complementare
cu secventa urmarita.
Probele vor forma complexe dublu catenare stabile in
zonele membranei in care se afla secventele omoloage.
Sediul hibridizarii este detectat autoradiografic.
Importanta medicala: capacitatea de a detecta polimorfismele
lungimii fragmentelor de restrictie si, prin aceasta, de a
functiona ca metoda de diagnostic ADN direct.
Procedura se poate repeta in aceesi maniera si pentru
ARN, purtand numele de NORTHERN BLOTTING,iar
pentru proteine WESTERN BLOTTING.

Hibridizarea in situ
Aceasta tehnica permite ca,dupa hibridizare cu secvente
specifice din moleculele ADN sau ARN, probele marcate
izotopic sau chimic sa poata fi vizualizate direct pe
preparatele celulare sau cromozomiale.

Tehnicile care folosesc probe marcate radioactiv tind

sa fie abandonate, datorita rezolutiei insuficiente si
perioadei lungi de timp necesara obtinerii rezultatelor.
Locul acestora este luat de tehnica numita
FLUORESCENCE

IN

SITU

HIBRIDIZATION

(FISH),care este relativ simpla si nu foarte costisitoare.

Autoradiografia

Northern blotting

Reactia polimerizarii in
lant

Southern blotting

Western blotting