ACS Study Prep

Cunoașteți diferitele tehnici de tehnologie ADN (Capitolul 9)

 Gel blotting este o tehnică pentru vizualizarea unui anumit subset de macromolecule – proteine
sau fragmente de ADN sau ARN – prezente inițial într-un amestec complex
 Etapele implicate în blotting gel sunt,
1. Separarea moleculelor prin electroforeză. Acest lucru se face într-un gel care permite
moleculelor să migreze sub influența unui câmp electric
2. Electroforeza rezultată este apoi "ștearsă" cu un filtru de nitroceluloză. Moleculele se
lipesc strâns de filtru și își vor păstra pozițiile relative atunci când sunt inundate cu lichid
la pasul următor
3. Filtrul este apoi scăldat cu o soluție care conține o "sondă"
 Sonda se va combina în mod specific cu moleculele țintă, adică cele pe care le
căutați
 Sonda poartă un mijloc de vizualizare (fie un marker radioactiv, fie un marker
fluorescent)
 Procedura de detectare a fragmentelor de ADN care conțin o anumită secvență este
următoarea:
1. ADN-ul este extras din celulă
2. ADN-ul este parțial digerat de o endonuclează de restricție – numită și enzime de
restricție, recunoaște și scindează ADN-ul la secvențe specifice (secvențe de
recunoaștere sau locuri de restricție) pentru a genera un set de fragmente mai mici
3. Fragmentele de ADN rezultate sunt separate prin electroforeză și apoi denaturate
pentru a forma molecule monocatenară (ssDNA)
4. Fără a-și modifica pozițiile, benzile separate de ssDNA sunt transferate într-un filtru de
nitroceluloză și expuse la un ADNc sau ARN marcat radioactiv
5. Dacă sonda detectează secvențe ADN complementare, se va lega de ele
 Diferitele tipuri de pete sunt următoarele:
Molecule separate
Tipul de blot Sonda
prin electroforeză
Sudic ssDNA ADNc sau ARN
Nordic ARN denaturat ARN sau ADNc
Vestic Proteină Anticorpi
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/G/GelBlotting.html
 Northern Blot este o tehnică utilizată în cercetarea biologiei moleculare pentru a studia expresia
genelor prin detectarea ARN (sau ARNm izolat) într-o probă
 Electroforeza în gel este o tehnică utilizată pentru separarea moleculelor de ADN, ARN sau
proteine folosind un câmp electric aplicat unei matrice de gel
 Reacția în lanț a polimerazei (PCR) implică amplificarea secvențelor ADN specifice
o Procesul implică amplificarea numărului de copii ale unui anumit segment de ADN
o Este o tehnică în biologia moleculară de a amplifica una sau câteva copii ale unei bucăți
de ADN pe mai multe ordine de mărime, generând mii până la milioane de copii ale unei
anumite secvențe ADN
o Procesul implică și se bazează pe cicluri termice, constând în cicluri de încălzire și răcire
repetată a reacției pentru topirea ADN-ului și replicarea enzimatică a ADN-ului.
Grundurile (fragmente scurte de ADN) care conțin secvențe complementare regiunii
 țintă împreună cu o ADN polimerază sunt componente cheie pentru a permite
amplificarea selectivă și repetată
o Pe măsură ce PCR progresează, ADN-ul generat este el însuși utilizat ca șablon pentru
replicare, punând în mișcare o reacție în lanț în care șablonul ADN este amplificat
exponențial
1. Lanțurile ADN sunt separate prin încălzire
2. Lanțurile de ADN sunt recoapte într-un exces de primeri ADN sintetici scurți care
flanchează regiunea pentru a fi amplificată
3. ADN-ul nou este sintetizat prin polimerizare

Cunoașteți aspectul genetic al biochimiei

 Un codon triplet într-o secvență de acid nucleic specifică de obicei un singur aminoacid
 Codul genetic definește o cartografiere între secvențele tri-nucleotidice, numite codoni, și
aminoacizi
 ADN (acid dezoxiribonucleic) este un acid nucleic care conține instrucțiunile genetice utilizate în
dezvoltarea și funcționarea tuturor organismelor vii cunoscute și a unor viruși
o Principalul rol al moleculelor de ADN este stocarea pe termen lung a informațiilor
o ADN-ul constă din doi polimeri lungi de unități simple numite nucleotide, cu coloane
vertebrale formate din zaharuri și grupări fosfat unite prin legături esterice
o Cele două fire se desfășoară în direcții opuse unul față de celălalt și, prin urmare, sunt
anti-paralele
o Atașat fiecărui zahăr este unul dintre cele patru tipuri de molecule numite baze
o Este secvența acestor patru baze de-a lungul coloanei vertebrale care codifică
informațiile
o Aceste informații sunt citite folosind codul genetic, cu specificarea secvenței
aminoacizilor din proteine
 ARN (acid ribonucleic) este un tip de moleculă important din punct de vedere biologic care
constă dintr-un lanț lung de unități nucleotidice
o Fiecare unitate nucleotidică constă dintr-o bază azotată, un zahăr riboză și un fosfat
o ARN-ul este transcris din ADN de enzime numite ARN polimeraze și este, în general,
prelucrat ulterior de alte enzime
o ARN-ul este esențial pentru sinteza proteinelor
 Diferențele dintre ARN și ADN
o ARN-ul este de obicei monocatenar, în timp ce ADN-ul este de obicei dublu catenar
 ARN, un lanț mult mai scurt de nucleotide
o Nucleotidele ARN conțin riboză, în timp ce ADN-ul conține dezoxiriboză (un tip de riboză
care nu are un atom de oxigen)
 Aceste grupări hidroxil fac ARN-ul mai puțin stabil decât ADN-ul, deoarece este
mai predispus la hidroliză
o ARN are uracilul de bază, în timp ce ADN-ul are timina de bază
 Baza complementară adeninei nu este timina, deoarece este ADN-ul, ci mai
degrabă uracilul, care este o formă nemetilată de timină
 ARN-urile ribozomale (ARNr) sunt componente ale ribozomilor, complexele care realizează
sinteza proteinelor:
 ARN-urile mesager (ARNm) sunt intermediari, care transportă informații genetice de la una sau
câteva gene la un ribozom, unde pot fi sintetizate proteinele corespunzătoare
  ARN-urile de transfer (tRNA) sunt molecule adaptoare care traduc fidel informațiile din ARNm
într-o secvență specifică de aminoacizi

Aflați ce sunt fragmentele Okazaki

 Fragmentele Okazaki sunt fragmente relativ scurte de ADN (fără primer ARN la capătul 5')
create pe catena rămasă în urmă în timpul fragmentelor de ADN
o Atunci când catena rămasă în urmă este reprodusă pe toronul original, trebuie utilizat
modelul 5'-3'; astfel apare o mică discontinuitate și se formează un fragment Okazaki;
o Aceste fragmente sunt procesate de mașinăria de replicare pentru a produce o catenă
continuă de ADN și, prin urmare, o spirală ADN fiică completă
o În tratarea sintezei catenelor ADN complementare, catena principală emergentă citește
întotdeauna de la 3' la 5'. Catena complementului antiparalel, catena rămasă emergentă
se citește de la 5' la 3'
 Deoarece catenele originale ale ADN-ului sunt antiparalele și doar o catenă nouă
continuă poate fi sintetizată la capătul 3' al catenei principale datorită polarității
5'-3' a ADN-polimerazelor, cealaltă catenă trebuie să crească discontinuu în
direcția opusă
 În ceea ce privește catena rămasă în urmă, rezultatul replicării discontinue a
acestei catene este producerea unei serii de secțiuni scurte de ADN numite
fragmente Okazaki
 Fiecare fragment Okazaki este inițiat lângă furculița de replicare la un primer
ARN creat de o primată și extins de ADN polimeraza III

Conservator versus semiconservator

 Replicarea ADN-ului este semiconservatoare
o Fiecare catenă ADN servește ca șablon pentru sinteza unei noi catene, producând două
molecule noi de ADN, fiecare cu o catenă nouă și o catenă veche
o Replicarea semiconservatoare ar produce două copii care conțineau fiecare unul dintre
firele originale și un fir nou
o Replicarea conservatoare ar lăsa cele două catene originale de ADN șablon împreună
într-o spirală dublă și ar produce o copie compusă din două noi catene care conțin toate
noile perechi de baze ADN

Aflați despre enzime și enzime restrictive

 Enzimele sunt proteine care catalizează (cresc ratele) reacțiilor chimice
o În reacțiile enzimatice, moleculele de la începutul procesului se numesc substraturi, iar
enzima le transformă în molecule diferite, numite produse
o Enzimele acționează ca un catalizator și funcționează prin scăderea energiei de activare
pentru o reacție, crescând astfel rata reacției
o Activitatea enzimatică poate fi afectată de alte molecule
 Inhibitorii sunt molecule care scad activitatea enzimatică, activatorii sunt
molecule care cresc activitatea enzimatică
 Medicamentele și otrăvurile sunt inhibitori ai enzimelor
 Activitatea este afectată de temperatură, mediul chimic și concentrația
substratului
o Enzimele sunt foarte specifice în ceea ce privește reacțiile pe care le catalizează și
substraturile implicate în aceste reacții
  Dimensiunea complementară, sarcina și caracteristicile hidrofile/hidrofobe ale
enzimelor și substraturilor sunt responsabile pentru această specificitate
 Cofactorii sunt componente ale enzimelor pe care unele enzime le necesită. Aceste molecule
non-proteice sunt legate de unele enzime pentru activitate
 Coenzimele sunt molecule organice mici care transportă grupări chimice de la o enzimă la alta
 Enzimele de restricție sau endonucleaza de restricție este o enzimă care taie ADN-ul dublu
catenar sau unic la secvențe specifice de nucleotide de recunoaștere cunoscute sub numele de
situsuri de restricție

Aflați despre hibridizare

 Hibridizarea ADN-ului ia două probe ADN pentru a fi comparate. Ele sunt complet denaturate
prin încălzire. Apoi, când două soluții s-au amestecat și s-au răcit lent, catenele de ADN ale
fiecărei probe se asociază cu partenerul lor complementar normal și se anexează pentru a forma
duplexuri. Dacă cele două ADN-uri au o similitudine semnificativă a secvențelor, ele tind să
formeze duplexuri parțiale sau hibrizi unul cu celălalt. Cu cât este mai mare similitudinea
secvenței dintre cele două ADN-uri, cu atât este mai mare numărul de hibrizi formați

Cunoașteți proteinele și interacțiunile lor

 Proteinele sunt compuși organici făcuți din aminoacizi aranjați într-un lanț liniar și pliați într-o
formă globulară
  Aminoacizii dintr-un polimer sunt uniți prin legăturile peptidice dintre grupările carboxil și amino
ale reziduurilor de aminoacizi adiacente
 Secvența de aminoacizi dintr-o proteină este definită de secvența unei gene, care este codificată
în codul genetic
 Interacțiunile proteină-proteină implică nu numai asocierea prin contact direct a moleculelor de
proteine, ci și interacțiuni pe distanțe lungi prin mediul electrolitic, soluție apoasă care
înconjoară proteinele hidratate vecine
o Interacțiunile dintre proteine sunt importante pentru majoritatea funcțiilor biologice

Cunoașteți pH-ul, pI, pK

 pH-ul (potențialul pentru concentrația ionilor de hidrogen) este o măsură a acidității sau
bazicității unei soluții
 pI (punct izoelectric, pH izoelectric) este pH-ul caracteristic la care sarcina electrică netă este 0
 pK (constanta de disociere acidă) este o măsură cantitativă a concentrației unui acid în soluție.
Este constanta de echilibru pentru o reacție chimică cunoscută sub numele de disociere în
contextul reacțiilor acido-bazice

Hemoglobină versus mioglobină

 Hemoglobina este proteina purtătoare de oxigen a eritrocitelor (celule roșii din sânge)
o Capacitatea de transport a oxigenului depinde de patru ioni de fier
 Mioglobina este o proteină care leagă oxigenul găsită în țesutul muscular
 Este porțiunea hemă a fierului care conferă atât celulelor roșii din sânge, cât și mușchilor roșii
culoarea lor
 În sânge, hemoglobina conține fier, iar în celulele musculare, mioglobina conține fierul
 Celulele roșii din sânge conțin hemoglobină, nu mioglobină, și astfel hemoglobina este cea care
dă culoarea celulelor roșii din sânge

Cunoașteți forțele intermoleculare

 Forțele intermoleculare sunt forțe care acționează între molecule stabile sau între grupuri
funcționale de macromolecule
o include atracții momentane între molecule, elemente libere diatomice și atomi
individuali
o aceste forțe, în special forțele de dispersie London, interacțiunile dipol-dipol și legăturile
de hidrogen, sunt semnificativ mai slabe decât legăturile ionice sau covalente, dar au
totuși un efect chimic vizibil
o Forțele intermoleculare se datorează diferențelor de densitate a sarcinii în molecule

Aflați despre lanțurile laterale de aminoacizi

 Aminoacizii sunt molecule care conțin o grupare amină, o grupare acid carboxilic și un lanț
lateral care variază între diferiți aminoacizi
o Aceste lanțuri laterale pot varia în mărime de la doar un atom de hidrogen în glicină, la o
grupare metil în alanină, până la o grupare heterociclică mare în triptofan
o Aminoacizii sunt de obicei clasificați după proprietățile lanțurilor lor laterale în patru
grupe
 Lanțul lateral poate face un aminoacid un acid slab sau o bază slabă și un hidrofil
dacă lanțul lateral este polar sau un hidrofob dacă este nepolar
Aflați despre tehnicile de separare a proteinelor
 Cromatografia în coloană profită de diferențele de încărcătură proteică, dimensiune, afinitate
de legare și alte proprietăți
 Cromatografia cu schimb de cationi, matricea solidă are grupuri încărcate negativ. În faza
mobilă, proteinele cu sarcină pozitivă netă migrează încet prin matrice decât cele cu sarcină
negativă netă, deoarece migrarea primelor este întârziată mai mult prin interacțiunea cu faza
staționară
 Cromatografia cu excludere a mărimii separă proteinele în funcție de dimensiune. În această
metodă, proteinele mari ies din coloană mai devreme decât cele mici – un rezultat oarecum
contraintuitiv
o Faza solidă constă din mărgele cu pori proiectați sau cavități de o anumită dimensiune
o Proteinele mari nu pot intra în cavități, așa că urmează o cale scurtă și rapidă prin
coloană, în jurul mărgelelor
o Proteinele mici intră în cavități și migrează mai lent prin coloană
 Cromatografia de afinitate se bazează pe afinitatea de legare a unei proteine. Mărgelele din
coloană au un grup chimic atașat covalent. O proteină cu afinitate pentru acest grup chimic
special se va lega de mărgelele din coloană, iar migrarea sa va fi întârziată ca rezultat
 HLPC (cromatografie lichidă de înaltă performanță) utilizează pompe de înaltă presiune care
accelerează mișcarea moleculelor de proteine în jos pe coloană în jos pe coloană, precum și
materiale cromatografice de calitate superioară care pot rezista forței de strivire a fluxului sub
presiune
o HLPC poate limita răspândirea difuzională a benzilor de proteine și, astfel, poate
îmbunătăți considerabil rezoluția

Aflați mai multe despre RMN

 Rezonanța magnetică nucleară (RMN) este o metodă pentru determinarea structurilor
tridimensionale ale macromoleculelor
o Este proprietatea pe care nucleele magnetice o au într-un câmp magnetic care a aplicat
impulsuri electromagnetice sau impulsuri, care determină nucleele să absoarbă energia
din impulsul EM și să radieze această energie înapoi
o Energia radiată înapoi este la o frecvență de rezonanță specifică, care depinde de
puterea câmpului magnetic și de alți factori

Aflați despre spectrometrul de masă

 Spectrometria de masă este o tehnică analitică pentru determinarea compoziției elementare a
unei probe sau a unei molecule
o Principiul SM constă în compuși chimici ionizanți pentru a genera molecule încărcate sau
fragmente de molecule și măsurarea raportului lor masă-sarcină

Cunoașteți cristalografia cu raze X

 Cristalografia cu raze X este o metodă de determinare a aranjamentului atomilor într-un cristal,
în care un fascicul de raze X lovește un cristal și difractă în mai multe direcții specifice
o Din unghiurile și intensitățile acestor fascicule difractate, un cristalograf poate produce
o imagine tridimensională a densității electronilor din cristal
o Din această densitate electronică, pot fi determinate pozițiile medii ale atomilor din
cristal, precum și legăturile lor chimice, tulburarea lor și diverse alte informații
Soarta piruvatului
 Piruvatul este o moleculă care este o intersecție cheie în mai multe căi metabolice
o Acesta poate fi obținut din glucoză prin glicoliză, furnizează energie celulelor vii în ciclul
acidului citric și poate fi, de asemenea, transformat în carbohidrați prin gluconeogeneză,
în acizi grași sau energie prin acetil-CoA, în aminoacidul alanină și în etanol

Aflați ce sunt condițiile anaerobe și aerobe

 Condițiile anaerobe sunt practic lipsite de oxigen, iar microorganismele adaptate acestor medii
obțin energie prin transferul electronilor în nitrat (formând N2), sulfat (formând H2S) sau CO2
(formând CH4)
 Condițiile aerobe au o cantitate abundentă de oxigen, iar unele organisme rezidente obțin
energie din transferul de electroni de la moleculele de combustibil la oxigen

Cunoașteți reglarea gluconeogenezei

 În timp ce majoritatea etapelor gluconeogenezei sunt inverse celor găsite în glicoliză, trei reacții
reglate și puternic exergonice sunt înlocuite cu reacții mai favorabile din punct de vedere cinetic
o Enzimele de glicoliză ale hexokinazei / glucokinazei, fosfofructokinazei și piruvat kinazei
sunt înlocuite cu glucoză-6-fosfat, fructoză 1,6-bifosfatază și PEP carboxikinază
o Majoritatea enzimelor responsabile de gluconeogeneză se găsesc în citoplasmă
o Rata gluconeogenezei este controlată în cele din urmă de acțiunea unei enzime cheie,
fructoza 1,6-bifosfatază, care este, de asemenea, reglată prin transducția semnalului
prin cAMP și fosforilarea acesteia
o Acetil CoA și citratul activează enzimele gluconeogenezei (piruvat carboxilază și,
respectiv, fructoză 1,6-bifosfatază)
 Datorită controlului reciproc al ciclului, acetil-CoA și citratul au, de asemenea,
roluri inhibitoare în activitatea piruvat kinazei
Cunoașteți reglarea ciclului acidului citric
 Reglarea ciclului TCA este determinată în mare măsură de disponibilitatea substratului și de
inhibarea produsului
 NADH, un produs al tuturor dehidrogenasees din ciclul TCA (excepție: succinat dehidrogenază)
inhibă piruvat dehidrogenaza, izocitrat dehidrogenaza, α-ketoglutaratul dehidrogenaza și, de
asemenea, citrat sintaza
 Acetil CoA inhibă piruvat dehidrogenaza
 Succinil-CoA inhibă succinil CoAsynthease și citrat sintază
  ATP inhibă citrat sintaza și a-ketoglutarat-dehidrogenaza
 Calciul este utilizat ca regulator și activează piruvat dehidrogenaza, izocitrat dehidrogenaza și a-
ketoglutaratul dehidrogenaza
 Citratul este utilizat pentru inhibarea feedback-ului, deoarece inhibă fosspofructokinaza, o
enzimă implicată în glicoliză, care catalizează formarea fructozei 1,6-bifosfat, un precursor al
piruvatului

Cunoașteți reglarea glicolizei

 Glicoliza este reglată prin încetinirea sau accelerarea anumitor pași în calea glicolizei
o Acest lucru se realizează prin inhibarea sau activarea enzimelor implicate
 o Orice pas cu o energie liberă aproape de 0 nu este reglementat
o Se presupune că un pas cu o schimbare negativă mare a energiei libere este reglementat

Cunoașteți complexul piruvat dehidrogenază

 Complexul piruvat dehidrogenază este un complex de trei enzime care transformă piruvatul în
acetil-CoA printr-un proces numit decarboxilare piruvat
o Acetil-CoA poate fi apoi utilizat în ciclul acidului citric pentru a efectua respirația
celulară, iar acest complex leagă calea metabolică a glicolizei de ciclul acidului citric
 Decarboxilarea piruvatului este, de asemenea, cunoscută sub numele de "reacția piruvat
dehidrogenază", deoarece implică și oxidarea piruvatului

Cunoașteți transducția semnalului

 Transducția semnalului este conversia informațiilor într-o schimbare chimică
o Semnalul reprezintă informații care sunt detectate de receptori specifici și convertite
într-un răspuns celular, care implică întotdeauna un proces chimic

Cunoașteți mesagerii secundari

 În al doilea rând, mesagerii sunt molecule care transmit semnale de la receptorii de pe
suprafața celulei pentru a viza moleculele din interiorul celulei, din citoplasmă sau din nucleu
o Acestea transmit semnalele hormonilor, factorilor de creștere și altele și provoacă un fel
de schimbare în activitatea celulei
o Ele amplifică foarte mult puterea semnalului
o Mesagerii secundari sunt o componentă a cascadelor de transducție a semnalului

Cunoașteți funcția receptorului tirozin kinază (RTK)

 Tirozin kinazele receptorilor (RTK) sunt receptorii de suprafață celulară cu afinitate ridicată
pentru mulți factori de creștere polipeptidică, citokine și hormoni
o S-a demonstrat nu numai că sunt regulatori cheie ai proceselor celulare normale, dar au
și un rol critic în dezvoltarea și progresia multor tipuri de cancer

Cunoașteți calea fosfatului de pentoză

 Calea fosfatului de pentoză duce la oxidarea glucozei 6-fosfat la fosfati de pentoză
o Este un proces care generează NADPH și pentoze
o Există două faze distincte în cale
 Prima este faza oxidativă, în care se generează NADPH, iar a doua este sinteza
neoxidativă a zaharurilor cu 5 atomi de carbon
 Această cale este o alternativă la glicoliză
Recunoașteți enzimele ciclului acidului citric
 Vedeți diagrama de mai sus

Cunoașteți diferența dintre căile catabolice și anabolice

 Căile catabolice degradează nutrienții organici în produse finale simple pentru a extrage energia
chimică și a o transforma într-o formă utilă celulei
 Căile anabolice încep cu molecule precursoare mici și le transformă în progresiv mai mari și mai
complexe

Cunoașteți analogii stării de tranziție

 Analogii stării de tranziție sunt compuși chimici cu o structură chimică care seamănă cu starea
de tranziție a unei molecule de substrat într-o reacție chimică catalizată de enzime
o Analogii stării de tranziție nu suferă o reacție chimică și pot acționa ca inhibitori ai
enzimei prin blocarea situsului lor activ

Aflați despre proteazele serine

 Proteazele serinice sunt proteaze (enzime care taie legăturile peptidice în proteine) în care unul
dintre aminoacizii de la locul activ este serina

Aflați ce este chimotripsina

 Chimotripsina este o enzimă digestivă care poate efectua proteoliza (degradarea / digestia
direcționată a proteinelor de către enzimele celulare numite proteaze sau prin digestie
intramoleculară)
 o De preferință, scindează legăturile peptidice amidice în care partea carboxil a legăturii
amidice este o tirozină, triptofan sau fenilalanină
 Acestea conțin un inel aromatic în lanțul lor lateral care se potrivește într-un
buzunar hidrofob al enzimei

Ce este o soluție tampon?

 O soluție tampon este o soluție apoasă constând dintr-un amestec de acid slab și baza sa
conjugată sau o bază slabă și acidul conjugat

Ce este echilibrul?
 Când un sistem este în echilibru, viteza de formare a produsului este exact egală cu viteza la
care produsul este transformat în reactant
o Nu există nici o modificare netă a concentrației reactanților și a produșilor; se atinge o
stare de echilibru

Ce este fosforilarea?
 Fosforilarea implică transferul de grupări fosforil
 Scopul acestui lucru are de-a face cu schimbarea conformațională
 Fosforilarea este adăugarea unei grupări fosfat la o proteină sau altă moleculă organică
o Fosforilarea activează sau dezactivează multe enzime proteice

Care este lanțul de transport al electronilor?

 Un lanț de transport de electroni cuplează o reacție chimică între un donator de electroni (cum
ar fi NADH) și un acceptor de electroni (cum ar fi O2) la transferul ionilor H printr-o membrană,
printr-un set de reacții biochimice mediatoare
o Ionii H sunt utilizați pentru a produce adenozin trifosfat (ATP), principalul intermediar în
organismele vii pe măsură ce se deplasează înapoi prin membrană
o ETC sunt utilizate pentru extragerea energiei din lumina soarelui (fotosinteză) și din
reacții redox, cum ar fi oxidarea zaharurilor (respirație)