Purificarea plasmidelor

Adriana Costache
▪Facultatea de Bioinginerie Medicala.
▪ Institutul National de Cercetare Medico Militara „Cantacuzino”.
 Extracția ADN
• Marea majoritate a experimentelor de clonare moleculară
implica obținerea moleculei de interes (ADN sau ARN) din
organismul de origine (țesut sau celule procariote sau
eucariote), un vector de clonare bazat pe un plasmid
(plasmidă) și o tulpină de laborator a bacteriei E. coli.
• Extracția acizilor nucleici se realizează prin spargerea
țesuturilor / celulelor (bacteriene, drojdii sau eucariote)
folosind tehnici specifice mecanice, chimice (ex.
detergenți) si/sau enzimatice (ex. lizozim pentru bacterii,
zimolaza, liticaza pentru drojdii, proteinaza K pentru celule
eucariote etc.).
• ADN-ul este apoi purificat pentru a elimina proteinele
contaminante.
 ADN plasmidial
• Plasmida este o macromoleculă de ADN circulară,
dublucatenară prezentă de obicei în unele bacterii.
• Are replicare autonomă față de genomul celulei gazdă
• Într-o singură bacterie pot exista de la una până la câteva mii
de copii ale aceleiași plasmide, în celulă fiind un amestec de
ADN cromozomal si plasmidial.
 Extracția ADN

• În cazul purificarii ADN-ului plasmidial

din bacterie, celulele se resuspendă
și apoi se lizează cu SDS/NaOH.
• Din această etapă, lizatul trebuie
agitat foarte blând pentru evitarea
fragmentării ADN-ului genomic.
• Prin adaugarea de acetat de
potasiu la pH scăzut ADN-ul genomic
și proteinele precipită, în supernatant
rămânând ADN-ul palsmidial.
Structura unei plasmide
 Centrifugare
Centrifugarea este un proces care
implică utilizarea forței
centrifuge pentru sedimentarea
amestecurilor. Componentele
dense ale amestecului
migrează mai departe de axa
de centrifugare, în timp ce
componentele mai puțin dense
ale amestecului ramân mai
aproape de axă. În final, în
partea de jos a tubului se
adună sedimentul iar soluția,
numită supernatant rămâne
deasupra.
 Purificare cu solvenți organici.
Extracția cu fenol-cloroform:
• Este o tehnică de extracție bazată pe partiția lichid-lichid în
funcție de solubilitatea componentelor în diferiți solvenți.
• Este utilizată pe scară largă în biologie moleculară pentru izolarea
ADN-ului, ARN-ului și proteinelor, formând un amestec bifazic.

http://www.slideshare.net/Geet_singh/dna-extraction-12082102
 Cromatografie de adsobție

Aceasta metodă se bazează pe

capacitatea acidului nucleic
de a se lega (adsorbție) la o
fază solidă (dioxid de siliciu sau
de altă natură), în funcție de
pH-ul și conținutul de sare din
tampon și de a elua în condiții
de molaritate redusă.
 Metode de analiză –
determinarea cantitativă

Analiza spectrofotometrică

• Se bazează pe capacitatea acizilor nucleici de a absorbi

lumina ultravioletă.
• Absorbanța maximă a acizilor nucleici: 260nm
• Calcul:
• 1 A260 ADN dublu-catenar = 50 µg/ml;
• 1 A260 ADN mono-catenar = 33 µg/ml;
• 1 A260 ARN = 40 µg/ml;
 Metode de analiză –
determinarea calitativă
Analiza spectrofotometrică

• Prin măsurarea spectrofotometrică se poate estima gradul de

puritate al acidului nucleic obținut:
• Raportul A260/A280 : 1,8 indică o puritate mare a ADN-ului (2,0
pentru ARN);
• Raportul A260/A280 : < 1,8 indică o contaminare cu proteine sau
substanțe aromatice;
• Raportul A260/A280 : > 1,8 indică o posibilă contaminare cu ARN;
• Raportul A260/A230 : 2,0 – 2,2 indică o puritate mare a ADN-ului;
• Raportul A260/A230 : < 2,0 indică o contaminare cu săruri sau
solvenți;
• Raportul A260/A230 : > 2,2 indică o determinare incorectă.
 Metode de analiză –
Analiza spectrofotometrică

• Avantaje
● Este rapidă

● Este non-distructivă

● Nu necesită reactivi speciali

• Dezavantaje
● Este dependentă de pH și tărie ionică

● Pot exista interferențe cauzate de alte componente

ale soluției
 Metode de analiză –
determinarea cantitativă

Analiza în fluorescență

• Folosește coloranți fluorecenți (ex. Bromură de

etidiu, SYBR Green, Qubit, bisBenzimidă) cu
afinitate în special pentru moleculele de ADN
dublu catenar.

• Exită și fluorocromi care leagă ARN (ex.

Bromură de etidiu, Qubit).
 Metode de analiză –
determinarea cantitativă

Analiza în fluorescență

• Excitația/Emisia (în funcție de colorantul folosit):

• Bromură de etidiu – 546 nm/590 nm;
• SYBR Green - 485 nm/535 nm;
• Qubit - 485 nm/530 nm;
• bisBenzimidă - 360 nm/460 nm.
 Metode de analiză –
determinarea cantitativă

Analiza în fluorescență

• Avantaje:
● Este o metodă foarte sensibilă
● Nu este afectată de prezența proteinelor în soluție
sau de nucleotidele libere în soluție
• Dezavantaje:
● Proba nu mai poate fi folosită pentru aplicații
ulterioare
● Necesită reactivi speciali
 Metode de analiză -
electroforeza în gel de agaroză
Electroforeza în gel de agaroză
este o metodă utilizată în
biochimie și biologie
moleculară pentru a separa o
populație mixtă de fragmente
de ADN sau ARN de lungime
diferită și pentru a estima
dimensiunea ADN-ului sau a
fragmentelor de ARN. Acestea
sunt separate în funcție de
mărime, prin aplicarea unui
câmp electric.
Metode de analiză - electroforeza
în gel de agaroză