Tehnologia ADN

recombinant
(Clonarea moleculară)

Adriana Costache
▪ Facultatea de Bioinginerie Medicala.
▪ Institutul National de Cercetare Medico Militara „Cantacuzino”.
 Scopul tehnologiei ADN
recombinat
Tehnologia ADN recombinat prezintă următoarele
aplicații:
 izolarea și secvențierea unor segmente de acid nucleic
(ex. gene);
 studiul mecanismelor de exprimare și reglare genică;
 obținerea de noi organisme modificate genetic,
producătoare de molecule de interes medical,
industrial sau alimentar;
 o cale alternativă pentru obținerea de proteine în
cantități mari, relativ ieftine etc.
 repararea unor defecte genetice prin terapie genică;
 Tehnologia ADN recombinat
(principiul)
 Primele gene clonate au fost cele codificatoare
pentru ARN ribozomal 18S și 28S din Xenopus
laevis, în 1973, de către Morrow și colaboratorii.
 Tehnologia presupune izolarea ADN, recombinarea
in vitro și reintroducerea acestuia în organismul
viu (celulă).
 Pentru a clona o genă este nevoie, în principal de:
vectorul, sursa de obținere a fragmentului (genei) de
interes, organismul gazdă folosit pentru
multiplicarea/expresia acestuia și metoda de
detecție/selecție a celor care au dobândit gena.
Tehnologia ADN recombinat
 Plasmid
Structura de baza a unui vector:
Situsul de clonare multipla
Originea (MCS = Multiple Cloning Site)
replicarii (Ori)

Gena pentru rezistenta la antibiotic

(Kanamicina, Ampicilina,
Tetraciclina, etc.)

Vectorul plasmidial = este o molecula de ADN circular

epizomal (are proprietatea de replicare autonoma fata de
cromozomul celular).
 Tipuri de vectori folosiți în
tehnologia ADN recombinant
In funcție de scopul urmărit se pot folosi vectori diferiți,
obtinuți prin inginerizarea unor plasmide/virusuri
naturale.
Astfel există trei tipuri:
 de clonare, utilizat pentru obținerea unei cantități
suficiente de ADN;
 de exprimare, cu ajutorul căreia se obține o expresie
eficientă a genei clonate:
pentru procariote;
pentru eucariote;
 de integrare (nonreplicativi), care conțin elemente
necesare integrării vectorului sau a unor porțiuni din
aceasta în genomul gazdei celulare eucariote.
Tehnologia ADN recombinat 1
 E. coli

Tehnologia
ADN
recombinat 2
 a.)

Rezultatul
transformării
b.) pentru
Adenilatciclaza
din
Pseudomonas
aeruginosa:
c.)
a) - N1,
b) - C1,
c) - C2.
Testarea coloniilor:

1-5 – N1 coloniile 1-5

6-11 – C1 coloniile 6-11
12-17 – C2 coloniile 12-17
18 – control negativ
100pb – 100pb GIBCO

Din 17 colonii testate, 12

au fost pozitive.
Exprimarea domeniilor N1, C1 si C2
1 – N1 neindus
1 2 3 4 5 6 Mw
2 – N1 indus
3 – C1 neindus
4 – C1 indus
5 – C2 neindus
C1
N1 6 – C2 indus
C2 Mw – Broad Range
(BIORAD)

N1 – Mw=43,7kDa
C1 – Mw=44,55kDa
C2 – Mw=39,2kDa