Laborator - Izolare ARN - RTQPCR

TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULARĂ
IZOLAREA MATERIALULUI GENETIC – ARN total
https://open.oregonstate.education/aandp/chapter/3-4-protein-synthesis/
Pregătirea probelor în hota cu flux laminar vertical

https://mdimembrane.com/biotech/nucleic-acid-purification-kits/kits-for-life-science-research/rna-isolation-kits
https://www.eppendorf.com/SP-en/
Tripsină - EDTA
5-10 minute
Vas de cultură cu celule aderate la substrat

Solutie de liza
β mercaptoetanol
Etanol 70 %
Solutii de spalare
DNaza I
Solutie de elutie
https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/1/rtn70bul.pdf
(1) Lizarea celulelor și inactivarea RNazelor folosind

soluţia de liză (250 µl) și 2-mercapto-etanol (2,5 µl).
Etapa este critică şi trebuie realizată rapid si complet.
(2) Filtrarea lizatului. Această etapă se realizează
pentru a îndepărta debriurile celulare şi ADN-ul
contaminant, folosind coloana de filtrare a kitului.
a. Filtratul se leagă de o coloană prin adăugarea
unei soluţii de etanol 70%.
b. Se centrifughează timp de 30 secunde la
14500 rpm.
(3) Spălare cu Soluţiile 1 si 2 (după prima

spălare a coloanei cu jumătate din cantitatea de
soluţie 1 se adaugă 10 microl DNază tip I și 70
microl buffer, timp de 15 minute la temperatura
camerei, pentru îndepărtarea ADN genomic). Se
continuă cu etapele de spălare.
a. Se centrifughează timp de 30 secunde,
respectiv 2 minute pentru a îndepărta complet
etanolul din soluţia de spălare 2.
(4) Eluarea ARN-ului total în 50 µl Buffer de Eluție.

a. În coloana de legare se adaugă bufferul de eluţie şi se
centrifughează timp de 1 minut la viteză maximă.
b. ARN-ul total izolat poate fi păstrat la -80°C sau poate fi folosit
imediat pentru revers transcrierea în ADN complementar.
c. Concentraţia şi puritatea ARN-ului total izolat s-a determinat prin
folosirea spectrofotometrului UV/VIS. Absorbanța se determină la 260 nm,
280 nm și 230 nm. Raportul absorbanței la 260 și 280 nm (A260/A280)
respectiv 260 și 230 nm indică gradul de contaminare al probelor cu
proteine, fenoli, carbohidrați. Dacă acest raport este între 1.8 – 2.1, proba de
ARNtotal se consideră necontaminată.
REVERS TRANSCRIERE real-time PCR
 Revers transcrierea ARN total in AND complementar
Tabel 1
Componente revers-transcriere 1X
10 X RT Buffer 4
25 X dNTP mix 1.6
10 X Random primers 2  Amestecul se menține pe gheață și se
Multiscribe RT 2 adaugă proba de ARN total (20 µl)
RNase inhibitor 1
 Volumul final de reacţie este de 40 µl
H2 O 9.4
Volum total (µl) 20
Mix RT (20 µl)

+
ARN total (20 µl)
ETAPE SINTEZA ADN

COMPLEMENTAR
a. Pasul 1 – 25 0C/10 minute
b. Pasul 2 – 37 0C/120 minute
c. Pasul 3 – 85 0C/5 secunde
d. Pasul 4 – 4 0C/∞
Identificati:
 Kituri pentru izolarea ARN total

 Kituri pentru sinteza ADN complementar
https://www.qiagen.com/us/search/products/?query=RNA%20isolation%20kit
https://www.thermofisher.com/ro/en/home.html
https://www.youtube.com/watch?v=h6NvCd94eng
https://www.youtube.com/watch?v=qmACKSvFZpM
Izolarea ARN:
http://genet.univ-tours.fr/gen001300_fichiers/CHAP5D/GEN05D1ANNEXE1.HTM
https://www.biotray.fr/fr/produits/microarray/extraction-amplification-et-marquage/kit-dextractio
n.html
Revers-transcriere
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4374967?SID=srch-srp-4374967
 real-time PCR
 Se monitorizează în timp real procesul de amplificare al materialului genetic

 Datele sunt colectate pe parcursul desfășurării reacției PCR și nu la sfârșitul reacției
(asa cum se întamplă în PCR-ul clasic)
 Sunt 2 tipuri de real-time PCR cantitativ: absolut și relativ
 Cuantificarea absolută reprezintă procesul care determină cantitatea absolută a
unei secvențe țintă de acid nucleic dintr-o probă necunoscută
 Cuantificarea relativă determină modificarea expresiei unei gene țintă într-o
probă de testat în raport cu aceeași gena dintr-o probă de calibrare. Proba de
calibrare poate fi un control netratat sau o probă la momentul zero
 real-time PCR
 Pentru evidentierea nivelului relativ de expresie al genelor ce codifică pentru

proteinele țintă se utilizează primeri și sonde TaqMan MGB (TaqMan minor groove
binder) marcate cu fluoroforul FAM, (6-carboxyfluorescein), VIC etc. sau
compusul SYBR green I (se leagă de secvențele de ADN dublucatenare)
 real-time PCR
 Sonda TaqMan
 Reporter (R) și Quencher (Q) (stinge fluorescența dată de Reporter)
 Enzima ADN polimeraza are capacitatea de a adăuga pe bază de
complementaritate nucleotide la primerii specifici (flanchează gena țintă)
 Enzima clivează Reporterul care se îndepărtează de Quencer și fluorescența
crește
 real-time PCR
 ARN-ul mesager pentru genele investigate se
analizează în triplicat/condiție experimentală,
normalizat față de gena de referință și exprimat în
funcție de calibrator (control) folosind metoda
comparativă Ct (Livak si Schmittgen 2001)
 Metoda 2 (-delta-delta Ct)

 se determină Cq (punctul la care fluorescenta trece
peste prag);
 se calculează ΔCq calibrator (media gena ținta – media
gena de referinta);
 se calculează ΔCq proba (media gena ținta – media
gena de referinta);
 se calculează ΔΔCq (ΔCq proba - ΔCq calibrator);
 2 -ΔΔCq
real-time PCR-qPCR
REALIZAREA AMESTECULUI DE REACŢIE
 TaqMan Gene Expression PCR master mix

 Primeri si probe TaqMan pentru fiecare genă de interes
 Apă fără RN-aze
 ADN-ul complementar
Tabel 2. Mixul pentru Real Time PCR

Componente 1x
Mastermix 10 Sistem real-time PCR
Primeri și sonde TaqMan (Assay on demand) 1
ADN complementar A
Apă B
Volum total (µL) 20
real-time PCR-qPCR
Pașii de temperatură necesari evaluării real-time PCR Monitorizarea în timp real a reacției rt PCR
Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative
PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001 Dec;25(4):402-8. doi:
10.1006/meth.2001.1262.
https://www.youtube.com/watch?v=xMUEx8mDhZY
https://www.youtube.com/watch?v=WLTV2groOxY
https://www.thermofisher.com/order/genome-database/?
pearUXVerSuffix=pearUX2&elcanoForm=true#!/ge/assays/ge_all/?
keyword=asic1&searchMethod=keyword
 https://mdimembrane.com/biotech/nucleic-acid-purification-kits/kits-for-life-science-research/rn
a-isolation-kits
https://www.eppendorf.com/SP-en/
https://open.oregonstate.education/aandp/chapter/3-4-protein-synthesis/
https://www.youtube.com/watch?v=Y-UzJvCeIbQ

Laborator - Izolare ARN - RTQPCR

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Laborator - Izolare ARN - RTQPCR

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULARĂ

IZOLAREA MATERIALULUI GENETIC – ARN total

Pregătirea probelor în hota cu flux laminar vertical

Vas de cultură cu celule aderate la substrat

(1) Lizarea celulelor și inactivarea RNazelor folosind

(3) Spălare cu Soluţiile 1 si 2 (după prima

(4) Eluarea ARN-ului total în 50 µl Buffer de Eluție.

Mix RT (20 µl)

ETAPE SINTEZA ADN

 Kituri pentru izolarea ARN total

 Se monitorizează în timp real procesul de amplificare al materialului genetic

 Pentru evidentierea nivelului relativ de expresie al genelor ce codifică pentru

 Metoda 2 (-delta-delta Ct)

 TaqMan Gene Expression PCR master mix

Tabel 2. Mixul pentru Real Time PCR

S-ar putea să vă placă și