PREG{TIREA

I NOC

ULI]I PENTRA |NSAMANTARI'

Industriile fermentative exploateazi la scard industrial5 potenfialul fermentativ al diverselor microorganis*e. in practica industriall, in anumite ramuri fermentative (vinificafe, braserie, etc.) inci se mai face apel la &UenhtietgAgta[a bazatd pe existenla microorganismelor din flora naturali.
Arrantaiele

l2-

de ordin etic (este

"dt pistrati tipicitatea produsului)

i" t*tt,

de ordin teluric: fermeatafia spontani se desfigoard lent gi la temperaturi medie de l5-230C ceea ce conduce la pistrarea ca ractere I or a romatice natura I e. Dezanantaiele fermenta giei spontane sult :

l-

este

fennentalie (exp.: fermentalia alcoolici nu are loc la o populafle de lOa levuri/ml); in aceasti situalie este favorizaG dezvoltarea al0or micrmrganisme nefolositoare ca mucegaiuri,

intirziati pomirea in

iewri oxidative, baaerii lactice gi acide

2- fermentalia este incompleti 3- in produsul finit pot apirea produgi de metabolism secundar cu efecte negative(dioxid de sulf, sulfurt, mercaptan, acFtat de etil, acetaldehida, *c.)

hidrogen

Majoritatea industriiJgt fermentative utilizeazi la ora actuali fermentatiile induse cu ajutorul nicaoorganisnrJorselectionalg. Din momentulin care un microorganism este introdus intr-rur mediu de culturi convenabil, acsta va dc4volta o activitate in relagie cu condilfile de mediu gi compozilia acestuia. inainte de a fi introdusain recipientul de fermentare microorganismele trebuie aduse la anumili parametrii (staciiu de dezvoltare, densitate, etc.) prin realizarea tmei preculturi. Aceasti preculturi cu care se va raliza insiminprea poarti denumirea de inocul. Necesitatea utilizirii inoculului in biotehnologiile fermentative rezidi din urmitoarele:

2- procesul fermentativ este mult mai regulat, iar fermenta$a h sine este mai pulin tumultoasi 3- asiguri o fennentalie completi 4- microorganisrnele din inocul pot inlocui eventualele microorganismele nefolositoare Pregitirea inoculului se baznazi pe faptul cI in 4ezvoltarea microorganismelor se deosebesc iimulte faze: l- .fan de indttcgie

l-

permite demararea imediatn a fermentafiei

mai

Daci se reprezinti grafic inmulfrea populaiei microbiene funcfe detimp 6e objine o curbi de urmitoarea fomrd:

2- -fom accelerantd 3- fan exponenliald geometrici, acrasta 4- fam stalionard 5- faa letald

frn care inmul$rea are log exponenfal: populafa microbiani

find'frra normal5
de cregtere a microorganismelor)

cregte

in

progresie

l.o2 ceil.ri.l*L

ti-g
in practica industrialS faza exponen$ald prezinti un interes deosebit, dmarece in aceasti randamente maxime in oblinerea masei microbiene.

frzi

se

obfn

Tehnica de lucru: Inoculul de microorganisme se obfne pornindu-se de la un anumit microorganism (suld) aflat in stare inactivd, sub diferite forme (in culturi liofilizatd sau pe mediu solid inclinat). in cazul culturii liofilizate, aceasta trebuie rehidratati 9i repicati pe mediu solid inclinat (de obicei gelozil). Rehidratarea este foarte importanti deoarece efectuatd incorect poate conduce la distrigerea microorganismelor irt totalitate. Din cultura aflati pe mediu inclinat (dupd 12-36 ore de cultivare) se realiznazA un preinocul intr-un mediu lichid sub agitare continui (de obicei se utilizeazi agitatoarele rotative). In acest preinocul se dezvolti o cantitate mare de microorganisme ce se vor trece intr-un vas de fermentare mai mare (300-500 litri), iar de aici intr-un gerrneinator (fermentator de 3000-5000 lrtri) ce va servi pentru urocularea mai multor fermentatoare ftioreactoare).
Schema de obfinere a inoculului

loo
50loonn?-

- lqoomt

Culhra liofilizhttr

Cultura pe mediu solid inclinat

Culturi pe medii lichide

La scard industriali inslmAnprea se realizeazi cu ajutorul unui recipient metalic mobil (Bazooka) cu ajutorul aerului comprimat steril.

!oesBnvnTrr
a- Toate etapele de lucru se efectueazi in condi;ii de sterilitate b- In fiecare etapi se aplici controale riguroase in ceea ce privegte aparilia urmitoarelor nereguli: l- Contaminirile-se detecleazA cu ajutorul examanului microscopic sau prin realizarea de subculturi 2- lrpaipa bacteriofagilor- acefgtia determini in mediul de culturi o incetinire sau oprire a cregterii
microorganismelor

3- Mutafiile- sunt foarte dificil de controlat; se vor observa. doar scideri de randament.De aceea trebuie si se lucreze , pe c0t posibil, cu mutante stabile ca suga-mami. c- Este necesari obginerea unei cantitlli importante de inocul :5-l0o/o din volumul mediu ce trebuie insim6nlat; de exemplu, la scari industriali trebuie si se obgini 5000-10.000 litri de inocul pentru un
fermentator de 10-20x mai mare.

tnsiminlarea cu inocul se realizeazd atunci cAnd populafia de microorganisme a atins o anumiti densitate, de aceea este necesard realizarca curbei dezvohirii populafiei microbiene pentru a se'prinde" faza optimi (exponenliali) pentru inoculare. Iati cAteva exemple: -in industria obfnerii alcoolului etilic inoculul trebuie si ajungi la 6-8 x 108 celule/ml -in vinificape trebuie si se ajungi la nivelul de 106 celule/ml
Lucrare praclicd l- Preparare de inocul din microorganisme liofilizate pe mediu lichid steril Wickerham. 2- Preparare de inocul de pe mediu inclinat in must steril.

3-

Preparare de inocul prin fermentare

liberi (din flora spontand)

Testarea viabilitatii tulpinilor de droidii la liofilizare

Medii de culturfl utilizate

YPG (Yeast Peptone Glucose) . Extract de drojdic - 0.5 %

'. o o

Peptona-IYo
NaCl -l% Agar -2%

pH7-7,5 jumitate din cantitatea de api distilati, dupi care

se

Sc dizolvi ingredientele la cald, pe baie de apd in adaugi qi rcstul apci.

Mediu pentru liofi lizare:

Sterilizarea acestui mediu s-a realizattimp de l?-18 minute la 12ffC.

. Z*tarcza-I0%" . Gelatina - I

Aparat de liofilizare utilizat

Liofilizator Labconco (freeze dryer) de capacitate 6 l.

Protocolul de lucru pentru liofilizare

Subculturd

pe mediu solid sau lichid stocat la +40C

Subculturi

pe mediu specific pentru

.rfffrffi:T"l"ffiffi
J

optimn pentru oblinerea de culturi pure

Prelucrarea culturii cu mediu protector pentru ob{inerea unei'concentraqii de loe lo" UFC/ml

J J

Agitare cu perle (pentu bacterii dc tip rough sau fungi, drojdii sau like-yeast)

r . . r '

inainte de liofilizare
control de puritate qi titru control de productivitate (preinocul inocul biosintezi)

J Liofilizare
repartizare in fiole congelarea materialuluibiologic imeisie in COz solid + alcool etilicc tehnic -700C; 30 uscare sub vid a fiolelor inchiderca fiolclor

45 min

+ Controlul liofiliz{rii suspendarea depozitului liofilizat sau api distilata

rehidratarea pe mediu de refrcere, etapi obligatorie numai

subcurtu"

.l"'ffi$lfi*r-

fftru

fungi, drojdii, liko'yeast

(preinocur-inocur-biosintezi)

.t
Stocarea liofilizatului in condifii de laborator +40C
.1,

Verificarea periodicl a plstrflrii viabilitifii ti nctivitdfii

Pregitirea probelor pentru liofilizare

Liofilizarea probelor de drojdie s-a efectuat in doui variante de lucru: a) Varianta de liofilizare a mediului de cultur6 lichid: Pentru aceaste variantl s-au cultivat tulpinile pe mediu YPG (lsrrtl, in eprubete, static) timp de 72 ore cAnd cultura a ajuns la inceputul fazei stalionare, s-au centrifugat cultufite iar biomasa reanltatd s-a amestecat cu cflte 5 ml mediu de protecfie, s-atransferat steril in fiole de sterilizare de 100 ml gi sau introdus in aparatul de liofilizare.
b) Pentru aceast6 varianta de lucru s-au dezvoltat rulpinile pe mediu YPG solid, timp de 4 zile qi apoi s-au efectuat experimentele de liofilizare. in sticluJe speciale de liofilizare s-au adiugat in mod steril cite 2OOpL mediu de liofilizare. Cu ajutorul unei anse sterile s-a recoltat toal6 biomasa dezvoltatl pe placa Petri gi s-a adlugat in sticlu{a de liofilizare pdnd s-a obJinut o pasta ca o smintdnE. Toate sticlutele au fost puse in aparatul de

liofilizare

Condifiile de liofilizare
Presiunea de 0,04 mbar; temperatura intre - 60 qi - 700C, timp de 6 ore.

Determin area

viabilitifii tulpinilor liofilizate

in cazul variantei b) din cei 200pL mediu de protec{ie conlin6nd cultura de drojdie, s-au luat 1OpL qi s-au fucut diluJii zecimalepdnl la l0-5- Din ultima dilutie s-au luat cate 100 pL gi s-au insamintat pe mediu YPG pentru a vedea viabilitatea microorganismelor.

cite

liofilizatelor astfel: in fiola cu liofilizat s-a ad[ugat 200 pl-,mediu de proteclie, s-a agitat pentru omogenizare gi apoi s-a determinat viabilitatea in acelagi mod ca cel descris mai sus.
s-a determinat viabilitatea

Dupl liofilizare