Separarea celulelor

Metode de separare a celulelor

Cele mai cunoscute metode de separare si
purificare a unor celule/culturi celulare sunt:
• prin clonare;
• prin utilizarea unor conditii de cultura selective
(medii de cultura, factori de crestere etc).

Cand nu sunt aplicabile aceste tehnici:

• separare in gradient de densitate;
• separare bazata pe anticorpi:
 sortare magnetica;
 sortare prin citometrie in flux.
 Separarea celulelor mononucleate din
sânge integral în gradient de densitate

Principiul metodei: se bazeaza pe separarea

celulelor prin centrifugare, utilizand forta
centrifuga joasa, avand ca rezultat asezarea lor
intr-un gradient de densitate, pana la o stare
de echilibru, echivalenta cu densitatea lor
proprie (sedimentare izopicnica).
 Materiale necesare
• Mediu de densitate - non-toxic, non-vascos, cu densitate
mare (1,10 g/ml), sa exercite presiune osmotica mica in
solutie. Ex. albumina serica, dextran, Ficoll, Percoll,
Histopaque, metrizamida;
• Tampon fosfat salin (phosphate buffer saline - PBS);
• Sange recoltat pe Li Heparina;
• Tuburi de centrifuga;
• Centrifuga cu rotor batant;
• Camere de numarat celule (Bürker-Türck);
• Mediu de cultură pentru limfocite (RPMI-1640,
suplimentat cu 10% ser fetal bovin - FCS, 1%
Streptomicină + Penicilină, 1% Glutamină);
• Solutie pentru spălarea celulelor (Hank’s Balanced Salt
Solution - HBSS);
 Rotor batant

Rotor fix
Tuburi de centrifuga simple

Tub de centrifuga cu frit

 Tehnica propriu-zisa
• Se recoltează sânge prin
puncţie venoasă, pe Li
Heparină;
• Se omogenizează sângele
cu Heparina si se
transvazează într-un tub
de centrifugă sterilă;
• Se diluează sângele cu
PBS 1:1.

Vacutainere cu Li Heparina
• Se introduce solutie
Histopaque în tuburi de
centrifugă de 15 ml sau 50
ml, peste care se prelinge
amestecul de sânge cu
PBS, astfel încât raportul
dintre Histopaque şi sânge
diluat să fie de 1:3, iar
sângele să nu se amestece
cu Histopaque-ul.
• Se centrifughează proba
cu centrifuga cu rotorul
batant, 20 de minute la
2000 rpm, la 20˚ C, cu
sistemul de franare
decuplat.
• Se aruncă supernatantul
(plasma sanguină) şi se
adună inelul de celule
mononucleare (limfocite +
monocite) într-un tub,
pregătit în prealabil cu HBSS
(raport dintre suspensie
celulară şi mediu ~ 1: 4);
• Se omogenizează şi se
centrifughează 10 minute la
1200 rpm, la 20˚ C, cu
sistemul de franare cuplat;
• Se repeta 1x spalarea cu
HBSS.
• Se resuspendă
sedimentul de celule
mononucleare în 1 ml
RPMI-1640 şi se numără
cu ajutorul camerei de
numărat Bürker-Türck.
Separarea celulelor bazata pe anticorpi
– sortare magnetica (Miltenyi) -
• Technologia MACS: se bazeaza pe utilizarea unor
asa-numite microbeads-uri cu feritina, in
combinatie cu separatori si coloane magnetice
pentru marcarea si separarea unor celule dintr-o
suspensie unicelulara;
• Coloanele sunt plasate in separatoare, iar matricea
confera un camp magnetic suficient de puternic ca
sa retina celulele marcate, cu o cantitate minima de
substanta magnetica;
• Celulele marcate magnetic sunt retinute pe masura
ce suspensia celulara traverseaza coloana din
separator;
• Celulele nemarcate trec prin coloana si pot fi
colectate separat – fractiunea nemarcata;
• Celulele marcate si retinute pe coloana vor fi
colectate dupa indepartarea magnetului –
fractiunea marcata ;
Aplicatii parctice: separarea unui tip de celule dintr-o
suspensie mixta, heterogena (ex. limfocitele B vs T,
limfocite vs monocite, celule activate vs celule in
repaus etc.)
 Separarea celulelor bazata pe anticorpi
- sortare activata prin fluorescenta
(citometrie in flux/flow-cytometry) -
• Se bazeaza pe fortarea trecerii unui flux
unicelular in fata unui fascicul laser, astfel
incat lumina imprastiata de celule este
detectata de unul sau mai multi
fotomultiplicatori si inregistrata;
• Daca celulele sunt marcate in prealabil cu
o substanta fluorescenta (ex. iodura de
propidiu pentru ADN) sau cu un anticorp
fluorescent, fluorescenta emisa, excitata
de fasciculul laser este detectat de
fotomultiplicatori si inregistrat;
• Informatia este procesata si redata sub
forma unui grafic bi- sau tridimensional
pe monitorul citometrului in flux;

Aplicatii parctice: determinarea unei

proportii de celule in diferite faze ale
ciclului celular; separarea celulelor pe
baza diferentelor de marime, molecule de
suprafata sau intracelulare.
 Depleţia monocitelor din suspensia de celule
mononucleare
Monocitele se pot separa din suspensia de celule mononucleate pe baza proprietatii
acestora de-a se adera de suprafete netede de plastic sau sticla (spre deosebire de
limfocitele neaderente);
Monocitele astfel separate pot fi utilizate pentru testarea imunitatii nespecifice a
persoanei in cauza (ex. capacitatea de fagocitoza)

Tehnica propriu-zisa:
• Celulele mononucleate se separa din sângele integral prin tehnica separarii in
gradient de densitate;
• Se numara celulele si se efectueaza testul de viabilitate cu trypan-blue;
• Se fixează numărul de celule la 1x107 celule/ml şi se adaugă pe plăci Petri cu
diametrul de 3 cm: 2 ml RPMI-1640 (cu 10% FCS + Penicilina + Streptimicina +
Glutamină) şi 0,5 ml suspensie celulară (1x107 celule/ ml);
• Incubare 1 oră la 37˚C cu 5% CO2;
• Se aruncă supernatantul şi se spală de 5x monocitele aderate cu mediu rece
pentru îndepărtarea limfocitelor (aflate în suspensie).
• Se adaugă 2 ml mediu proaspăt: RPMI-1640 cu 10% FCS + Penicilna +
Streptomicina + Glutamină.
 Monocite fixate

Monocite vii in cultura

 Transformarea blastica a limfocitelor
• Limfocitele pot fi stimulate cu antigene
(stimulare specifică) sau cu mitogene (stimulare
nespecifică), în condiţii in vitro rezultând
activarea limfocitelor B sau T de repaus şi
transformarea blastică a acestora;
Plasmocite
• Limfoblaştii sunt celule mari, imature, cu
diametrul de aproximativ 15 μm, care se divid
rapid şi evoluează fie în direcţia plasmocitului (în
cazul celulei B) sau a limfocitului T activat (Th
sau Tc), fie a celulelor cu memorie;

Limfocite T activate
• În cazul stimulării antigenice are loc
proliferarea clonală a celulelor, iar
celulele-fiice arată specificitate
pentru antigen;
• Mitogenii, în schimb, activează
majoritatea limfocitelor, diviziunea
fiind policlonală şi fără specificitate
de antigen;
• Cele mai cunoscute mitogene sunt lectinele de
origine vegetală (fitohemaglutinina – PHA
extras din Phaseolus vulgaris; concavalina A -
ConA extras din Canavalia ensiformis şi
pokeweed mitogenul – PwM extras din
Phytolacca americana) sau extractele
bacteriene (lipopolizaharidul bacterian- LPS şi
derivatul purificat de proteine - PPD);
• PHA şi ConA stimulează limfocitele T, PwM-ul Phaseolus vulgaris
atât limfocitele B cât şi cele T, iar LPS limfocitele
B murine;
• Mitogenii, ca şi antigenele se leagă de receptorii
de suprafaţă celulară, determinând o serie de
modificări morfologice şi metabolice în celulă
(creşterea volumului celular şi a conţinutului de
ARN, intensificarea sintezei de ADN etc.), Canavalia ensiformis
culminând după 24 de ore de la administrarea
lor, cu diviziunea celulară;
• Aceste raspunsuri ale limfocitelor la stimularile
antigenice si mitogenice pot fi utilizate la
cuantificarea imunocompetentei lor, iar cea de
stimulare cu PHA la inducerea mitozei cu scopul
analizei cromozomiale ale celulelor sanguine
periferice.

Phytolacca americana
Tehnica propriu-zisa:

• Limfocitele de separa din sângele integral prin tehnica separarii in

gradient de densitate;
• Se numara celulele si se efectueaza testul de viabilitate cu trypan-blue;
• Se repartizează celulele în tuburi de 15 ml, sterile, astfel încât numărul
celular să fie de 1 x 106celule/ml;
• Se adaugă PHA: 100 μl (20 μg /100 μl )/1000 μl suspensie celulară;
• După 44 de ore se adaugă citochalazina B (40 μl/probă din soluţia 150
μg/ml), o micotoxina, care opreşte diviziunea citoplasmei;
• După 48 de ore se citocentrifughează probele la 600 rpm, 5 minute;
• Se usucă lamele la aer şi se fixează 10 minute cu metanol absolut;
• Se colorează lamele cu colorant Giemsa 10% preparat proaspăt cu
tampoane de KH2 PO4 şi Na2HPO4;
• Se numără la microscop, cu obiectivul de imersie 500 de celule,
determinând procentual celulele aflate în diviziune (celulele binucleate,
eventual cu micronuclei - fragmente mici, desprinse din nucleu). Gradul de
binucleere reprezintă intensitatea stimulării limfocitelor T cu PHA.
Citocentrifugarea celulelor

• Se pregatesc lamele de microscop;

• Pentru o mai buna aderenta lama de
microscopie se poate imersa in ser
sau se efectueaza un frotiu cu ser;
• Se usuca lama;
• Se plaseaza si se fixeaza lama in
suportul special pentru lame;
• Se introduce suportul in cuva, iar
aceasta se plaseaza in rotorul
centrifugii;
• Se introduce aprox. 200 μl suspensie
celulara cu cel putin 2-5x100 000
celule/ml;
• Se porneste centrifuga la 100 g, 5
minute;
• Se usuca lama si se procedeaza
identic cu examinarea directa pe
lama sau pe frotiu.
 Limfocit tetranucleat

Micronuclei

Limfocite stimulate cu PHA

Limfocit binucleat