5/19/2015

Definiie

Polymerase Chain Reaction reacia n lan a polimerazei

Polymerase Chain Reaction reacia de polimerizare n lan

Biotehnologii
PCR

Definiie

PCR Xeroxing DNA

PCR Molecular Photocopier

Reacia PCR este o tehnic in vitro

prin care se realizeaz
amplificarea (replicarea, multiplicarea)
enzimatic
selectiv
a unei anumite regiuni de ADN
localizat ntre dou secvene ADN cunoscute.

Principiu

Este un proces de multiplicare a

ADN-ului in vitro bazat pe replicarea
ADN ului in vivo.
ADN-ului
vivo
Kary Mullis et al.
(1983/1985)
Premiul Nobel pentru chimie
(1993)
Principiul replicrii unui segment de
ADN utiliznd doi primeri a fost descris
de Gobind Khorana, nc din 1971.

Importan

nainte de apariia acestei tehnici puteau fi obinute doar

cantiti infime de copii ale unei anumite secvene.

Aplicaii

Poate
fi utilizat
ca tehnic
pregtitoare

Invenia lui Mullis a revoluionat acest domeniu oferind

posibilitatea multiplicrii unui fragment de ADN de interes.

sau
analitic

Tehnicile PCR sunt eseniale pentru multe

procedee utilizate astzi:
clonarea unor fragmente specifice de ADN,
secvenierea fragmentlor de interes
detecia i identificarea genelor pentru
diagnosticare sau investigaie
medical sau criminalistic,
investigarea modelelor de expresie genic
etc.
n ultimii ani, au fost iniiate cercetri n
domenii noi precum:
controlul autenticitii produselor
alimentare,
detecia ADN-ului modificat genetic,
detecia microbiologic.

5/19/2015

Aplicaii
Markerii moleculari

Aplicaii
Markerii moleculari

Markerul molecular este reprezentat de un fragment (regiune) din

molecula de ADN care permite deosebirea/identificarea
unui individ (separarea de ali indivizi sau apartenena la un anumit
grup sau categorie)
unui caracter fenotipic (anatomic, morfologic)
unui caracter biochimic
unui caracter molecular (alt fragment/regiune de ADN).
Practic, se poate afirma c markerul molecular este asociat individului/
caracterului.
Fragmentul de ADN poate avea
mrime (numr de nucleotide)
structur (secven nucleotidic)
rol genetic (codificator sau ne-)
localizare la nivelul genomului (poziie/locus)
foarte variabile.
Poziia markerului la nivelul genomului poate sau nu s fie cunoscut.
Metodele de studiu/analiz bazate pe markeri moleculari sunt de
asemenea foarte variate.

Aplicaii
Markerii moleculari

Aplicaii
Markerii moleculari

Aplicaii
Markerii moleculari

Aplicaii
Markerii

5/19/2015

Aplicaii

Aplicaii
Markeri moleculari

Tehnic

Ciclul PCR

Multiplicarea fragmentului de interes se realizeaz prin

repetarea unui ciclu de amplificare/PCR, de 30-50 ori.

Ciclul PCR este compus dintr-o succesiune de 3 etape:

1 denaturare (denaturation)
2 alipire (annealing)
3 extensie (extension)

Ciclul PCR

Ciclul PCR

denaturarea ADN-ului temperaturi nalte

pentru transformarea ADN-ului dublu
catenar n ADN monocatenar
alipirea (hibridarea molecular) a dou
secvene oligonucleotidice folosite ca
primeri, la regiunea de ADN int
extensia lanului ADN prin adiie de
nucleotide la primeri

~ 95 C

~ 50-60 C

~ 72 C
x

Aceste etape constituie un ciclu

... de diferite niveluri
de temperatur

... repetitiv

30-45
(n general)

Denaturarea iniial

95 C

cteva minute (2-5-10)

Denaturarea
Alipirea
Extensia

94-95 C
50-65 C
72 (60) C

30
30
60

Extensia final

72 (60) C

cteva minute (5-10)

30-45

5/19/2015

Reactivi

Ciclul 1
Denaturarea

> 90 C

Secvena/segmentul int de ADN

MgCl2
+

Cele dou catene complementare se separ odat

cu creterea temperaturii - ruperea legturilor de
hidrogen existente ntre bazele azotate.

Reacia este complet atunci cnd ntreg ADN-ul

dublu catenar devine monocatenar.

ADN polimeraz
termostabil
(frecvent Taq DNA
polymerase)

Temperatura de renaturare/alipire este

influenat de lungimea segmentului, tipul de
solvent, concentraia srurilor i pH-ul,
proporia C/G i T/A .
Primeri
Nucleotide libere (dNTPs)

Ciclul 1
Alipirea

Ciclul 1
Alipirea

Cei doi primeri au secvene relativ

scurte, diferite ntre ele i
complementare unor situri de
recunoatere ce flancheaz segmentul
de ADN int care trebuie amplificat.

Cu ct aceste legturi sunt mai stabile,

cu att vor rezista mai mult (este cazul
primerilor care se potrivesc perfect pe
secvena matri de ADN). Dup
hibridare ADN polimeraza ncepe
ataarea nucleotidelor n continuarea
primerilor. Dup ataarea ctorva
nucleotide, legturile devin foarte stabile.

!!! Temperatura de alipire

hibridare molecular prin formarea legturilor de hidrogen

Ciclul 1
Extensia

hibridare molecular prin formarea legturilor de hidrogen

Ciclul 1
Extensia

Etapa presupune extinderea primerilor de-a

lungul secvenei int.
Extinderea este realizat de ADN polimeraz n
prezena nucleotidelor libere.
Are loc duplicarea materialului int iniial.
Temperatura ideal pentru activitatea Taq ADN
polimerazei este de 72 C.

5/19/2015

Ciclul 2

Ciclul 3
Denaturarea

Extensia
Extensia

Alipirea

Ciclul 4

Ciclurile
ulterioare

vs.

Elementele
principale ale PCR

Laborator

Aparatur
Secvena int de ADN/Extractul de ADN
Primerii
ADN polimeraza
Soluia tampon
MgCl2
dNTPs
Numrul de cicluri i efectul de plafonare

5/19/2015

Aparatur
Dou mari inovaii au
permis automatizarea
procesului PCR:
crearea (1986) unor bi
termice, a cror
temperatur poate fi rapid
crescut sau cobort n
mod automat i programat;
aceste instrumente se
numesc thermal cyclers
sau maini PCR i pot avea
la baz principii de
funcionare diferite
introducerea (1988) ADN polimerazelor termostabile; astfel,
cantitatea de ADN polimeraz repartizat iniial poate aciona de-a
lungul mai multor cicluri PCR ale unui protocol; de asemenea,
nivelurile de temperatur utilizate sunt mai mari favoriznd
specificitatea reaciei de amplificare

Secvena int/matri
(template)
n principiu, amplificarea PCR se poate desfura dac exist
cel puin o copie intact a secvenei int.

Orice defect al moleculei int va bloca amplificarea.

Mrimea secvenei int poate fi cuprins ntre 0,1 pn la

cteva kilobaze.

Dei o prob nu trebuie s fie nalt purificat, eliminarea unor

contaminani ca formalin, ageni de chelatizare cu Mg2+ i
detergeni este esenial pentru desfurarea procesului de
amplificare.

Primerii
Definiie i rol
Sunt construcii oligonucleotidice (16-30 nucleotide)
cu secven complementar unor situri de recunoatere
ce flancheaz fragmentul de ADN int (capetele 5)
care prezint un capt 3OH liber, necesar pentru iniierea
activitii ADN polimerazei

Primerii
Specificitate

Primerii
Design
Primerii reprezint una dintre componentele ce ofer
specificitate reaciei PCR.
Secvena primerilor determin:
poziia i lungimea produsului de amplificare
temperatura de hibridare/alipire
cantitatea de produs obinut (Innis i Gelfand, 1994)
Un design necorespunztor al primerilor poate duce la:
obinerea unor cantiti reduse de produs
amplificare nespecific
lipsa produsului ateptat
obinerea unor rezultate fals pozitive/negative
Concentraiile de 1 M n reaciile PCR sunt suficient pentru
30 cicluri de amplificare.

5/19/2015

Primerii
Design
Lungimea primerilor
Secvena de la captul 3
Temperatura de denaturare (Tm)
Selecia primerilor
Specificitatea
Primeri cu secvene complementare
Coninutul G/C i secvenele polipirimidinice (T,
(T C) sau polipurinice (A,
(A G)

Primerii
Design
!!! Temperatura de alipire trebuie s fie suficient de ridicat astfel
nct hibridarea (primeri ADN int) s se realizeze doar ntre
secvene perfect complementare.*
Temperatura de alipire a primerilor,
calculat n momentul proiectrii acestora,
trebuie confirmat n mod practic (prin
amplificri).
Utilizarea:
unei temperaturi de alipire prea mici
determin apariia produilor nespecifici
unei temperaturi de alipire prea mari are
ca rezultat imposibilitatea alipirii
primerilor i deci lipsa amplificrii

La proiectarea primerilor trebuie evitat:

utilizarea secvenelor polibazice (ex. poli G)
secvenelor complementare n cadrul aceluiai primer
motivelor repetitive
secvenele invers repetate
utilizarea secvenelor complementare altor primeri
utilizarea primerilor cu secvene complementare (determin
formarea primer-dimerilor)

Optimizarea acestui parametru se face

empiric reacii cu niveluri ale
temperaturii de alipire care cresc/scad cu
2 C.

Captul 3 al primerilor trebuie s conin baze G/C.

ADN polimeraza
Iniial a fost folosit o polimeraz izolt din E. coli. Nivelul redus de
temperatur (37 C) favoriza hibridarea nespecific a primerilor i
obinerea produilor nedorii.
Utilizarea ADN polimerazei rezistent la temperaturi ridicate uureaz
mult desfurarea reaciei PCR deoarece adugarea enzimei dup
fiecare ciclu nu mai este necesar.
Prima ADN polimeraz termostabil utilizat a fost Taq ADN
polimeraza (descris pentru prima dat n 1988).

izolat din bacteria Thermus aquaticus

ADN polimeraza

ADN polimerazele comerciale sunt

recombinate
ex. AmpliTaq DNA Polymerase gena Taq
DNA polimerazei introdus n E. coli
AmpliTaq Gold DNA
Polymerase (Hot Start
PCR)
Pyrococcus furiosus
- Pfu polimeraza

Yellowstone National Park (SUA) la temp. ~ 85 C

temperatura optim de lucru pentru aceast
enzim este de 70-80 C

Soluia tampon
(reaction buffer)
Pe lng reactivii direct implicai n reacia PCR, este necesar
prezena unei soluii tampon n mediul de reacie.
Compoziia acestei soluii variaz n funcie de caracteristicile
enzimei utilizate, majoritatea productorilor de enzime
comercializnd i soluia tampon optim pentru acestea.
Soluia
l i tampon se comercializeaz
i li
sub
b fform concentrat (10x
(
sau
5x).
Cele mai utilizate soluii tampon pentru ADN polimeraza conin:
10 mM Tris, pH 8,3; ioni de amonui i/sau potasiu (ex. 50 mM KCl);
ioni de magneziu (1,5-2,5 mM MgCl2); bovine serum albumine (BSA).
Se mai pot aduga i alte substane (ex. PVP, DMSO, PEG 6000,
formamid, glicerol, detergeni neionici) care au rolul de a crete
specificitatea (doar produsul dorit) i eficiena reaciei (cantitate mai
mare de produs PCR).
BSA ofer rezultate mai bune dect ali adjuvani (DMSO sau
glicerol) i nu prezint efecte inhibitoare.

MgCl2
Prezena cationilor divaleni este critic. Concentraia de MgCl2 n
amestecul final de reacie este cuprins de obicei ntre 0,5 i 5,0 mM,
concentraia optim determinndu-se empiric pentru fiecare caz n
parte.
Ionii de Mg2+:
formeaz un complex solubil cu nucleotidele, care este esenial
pentru ncorporarea acestora
stimuleaz activitatea polimerazei.
n general, o concentraie redus de Mg2+ are ca rezultat acumularea
n cantiti reduse a produsului de reacie n timp ce concentraia
ridicat de Mg2+ favorizeaz acumularea produilor nespecifici
(datorit alipirii greite a primerilor) sau poate inhiba activitatea
polimerazei.
Este important evitarea concentraiilor ridicate de ageni de
chelatizare (ex. EDTA) sau gupri ionice ncrcate negativ (ex. fosfai
n soluia ADN) blocheaz ionii de Mg2+.

5/19/2015

dNTPs

Nr. de cicluri
Efectul de plafonare

Nucleotidele constituie elementele de baz ale moleculei de ADN-ului.

Concentraia acestora trebuie s fie cuprins ntre 20 i 200 M pentru
fiecare din cele patru tipuri (A, T, C, G), iar concentraiile acestora
trebuie s fie echivalente pentru a reduce erorile de incorporare.

Numrul de cicluri necesar pentru producerea unei cantiti

detectabile dintr-o secven int de ADN depinde, n principal, de
concentraia iniial a secvenei respective.
Teoretic, numrul de copii ale unei secvene int se dubleaz la
fiecare ciclu de amplificare. Astfel, dup n cicluri vom avea 2n copii
ale moleculei iniiale. n practic, eficiena amplificrii este de peste
90%.
Teoretic, pentru amplificarea a 50 de molecule int sunt
recomandate 40-45 cicluri PCR, n timp ce doar 25-30 cicluri sunt
suficieante pentru amplificarea a 3x105 molecule.
Un alt fenomen caracteristic amplificrii PCR este efectul de
plafonare (plateau effect) modificarea ratei exponeniale de
acumulare a produsului PCR.

Nr. de cicluri
Efectul de plafonare

Nr. de cicluri
Efectul de plafonare

Cauzele plafonrii:
degradarea reactivilor (ex. polimeraz, nucleotide),
consumarea acestora (ex. primeri - n cazul produilor scuri,
nucleotide - n cadrul produilor lungi),
concurena produilor nespecifici
etc.
n practic, chiar i mai puin de 10 copii ale secvenei int pot fi
amplificate, necesitnd ns mai multe cicluri de amplificare pentru
detectarea unui semnal n urma electroforezei n gel.
n cazul n care concentraia secvenei int este redus
reamplificarea poate da rezultate mai bune dect adugarea unor
cicluri suplimentare.

Contaminarea
Good laboratory practice
Contminri foarte reduse cu ADN pot determina amplificarea unor secvene
nedorite care determin apariia erorilor (rezultate fals pozitive).
De aceea, este esenial desfurarea activitilor ntr-un mediu (laborator)
lipsit de ADN.
Surse poteniale de contaminare pot fi uor ntlnite n laborator: probele,
personalul, instalaia de aer condiionat, echipamentele i reactivii.
Agenii contaminani pot fi reprezentai de:
produi de amplificare rezultai din reaciile PCR anterioare (carry-over
contamination)
contaminare ntre probe nainte de analiz (cross-contamination)
ADN rezultat din pregtirea probelor anterioare
diferite substane (reactivi) specifice unor activiti desfurate n cadrul
laboratorului, dar care constituie inhibitori pentru reacia PCR
produi degradai rezultai n urma proceselor de decontaminare
etc.
Primele trei tipuri de ageni contaminani produc rezultate fals pozitive, n
timp ce ultimele dou cauzeaz rezultate fals negative.

Contaminarea
Good laboratory practice
Msuri de prevenire a contaminrilor:
existena spaiilor de lucru separate fizic, dotate cu echipament dedicat,
reduce riscul contaminrii;
respectarea strict a normelor de decontaminare (decontaminare cu UV,
curarea suprafeelor cu hipoclorit/etanol, prevenirea aerosolilor
etc.) este o condiie esenial pentru reducerea ratei de apariie a
rezultatelor fals pozitive; utilizarea metodelor biochimice de
prevenire
i
(
(ex.
Uracil-DNA
U
il DNA glycosydase,
l
d
DNaza
DN
I).
I)
utilizarea corespunztoare a mnuilor i halaltelor de laborator,
utilizarea soluiilor, reactivilor, materialelor, echipamentelor i
consumabilelor libere de contaminani;
protocoalele de lucru trebuie s includ ntodeauna probe de control.
Probele de control corespunztoare permit validarea rezultatelor analitice
obinute:
probe de control pozitive eficiena extraciei i amplificrii ADN-ului;
probe de control negative contaminarea poate avea loc n timpul izolrii i
purificrii ADN-ului int, precum i n timpul pregtirii amestecului
de reacie. Introducerea probelor de control negative pentru
amestecul de reacie este necesar pentru a indica tipurile de
contaminare menionate anterior.

5/19/2015

Pregtirea amestecului
de reacie (master mixul)

Pregtirea amestecului
de reacie (master mixul)

Reactivii eseniali sunt: ap, soluie tampon de reacie, ADN polimeraz

termostabil, primeri oligonucleotidici, nucleotide, secven int i ioni de
magneziu.
n general, toi reactivii cu excepia ADN-ului, sunt amestecai separat,
obinndu-se un volum total suficient pentru toate reaciile. Acest amestec se
numete master mix.
Master mixul este apoi distribuit n medii de reacie seperate, pentru fiecare
prob n parte.
Activitile specifice trebuie s se desfoare n spaii (ct mai) curate i
sterile, iar temperatura la nivelul reactivilor trebuie s fie redus.
PROs:
se poate asigura uniformitatea calitativ i canttativ pentru fiecare reacie
dintr-o serie de analize;
se reduce riscul contaminrii volumului iniial i implicit a celor distribuite;
se utilizeaz volume mai mari;
scade numrul operaiunilor scade, economisindu-se timp i materiale.
Utilizarea unei soluii mastermix reduce riscul de contaminare i
mbuntete performanele.

Produii de reacie/produii
PCR/ampliconii

Produii specifici i
nespecifici

Produii de amplificare sunt

copii ale secvenei/
segmentului int.

Produii nespecifici

g
p
produsului de
Lungimea
amplificare este dat de
distana dintre cei doi
primeri.
Principalii produi ai acestei
reacii - copiile secvenei
int - sunt segmente dublu
catenare de ADN a cror
terminaii corespund
capetelor 5 ale primerilor
oligonucleotidici.

Produii specifici

Primer-dimeri

Electroforeza n gel i
marcarea cu EtBr

Biotehnologii
Electroforeza n
gel i marcarea cu
EtBr

5/19/2015

Separarea electroforetic
Definiie
Electroforeza n gel este o metod de separare a (macro)moleculelor
(ex. ADN, proteine) n funcie de mrime, structur, ncrctur
electric (precum i alte proprieti fizice).
se realizeaz ntr
ntr-o
o
matrice poroas (gel),
sub influena curentului electric
electrophoresis (lb. englez)
electro electricitate

phoros (lb. greac) to carry across

Mrimea (macro)moleculelor separate se determin prin

comparare cu molecule de mrimi cunoscute.

Separarea electroforetic
Definiie
Electroforeza n gel este o tehnic n cadrul creia
(macro)moleculele sunt forate s strbat o matrice poroas (i.e.
gelul), sub influena curentului electric.
Micarea este determinat de curentul electric (V, mA) aplicat
electrozilor poziionai la ambele capete ale gelului.
Separarea/distana strbtut n unitatea de timp
i implicit viteza de deplasare depind de:
(macro)moleculelor ce trebuie separate mobilitatea electroforetic
determinat n principal de ncrctura electric i
mrime, dar i de configuraia spaial etc.
mediului de electroforez tipul i concentraia gelului i a soluiei
tampon
intensitatea/tensiunea c.e. aplicat.

Electroforeza n gel
Principiu

Electroforeza n gel
Principiu

... proces similar trecerii particulelor printr-o sit

(molecular)

O gam larg de macromolecule biologice importante (ex.

aminoacizi, peptide, proteine, nucleotide i acizi nucleici) posed
grupri ionizate care, la orice valoare a pH-ului, sunt prezente n
soluii sub form de cationi (+) sau anioni (-).
Sub influena curentului electric particulele vor migra nspre catod
(-) sau nspre anod (+), n funcie de natura ncrcturii.

Viteza de deplasare a moleculelor n interiorul aceleiai matrici

poroase (i.e. gelul de agaroz) este determinat proprietile
molecululelor respective.
Matricea poroas (gelul) are rolul de a ncetini micarea
(macro)moleculelor apare fora de frecare. ncetinirea micrii
determin separarea particulelor n funcie de mrime, moleculele
de ADN de dimensiuni mici strbtnd mai uor matricea (gelul)
comparativ cu cele de dimensiuni mari.
Tehnica este relativ simpl i rapid.

Sarcina electronegativ a ADN-ului este dat de moleculele de

zahar i radicalii fosfai din cadrul nucleotidelor.

Electroforeza n gel
Principiu
Particulele ncrcate electric (ionii) se
deplaseaz ntre doi electrozi n funcie de
ncrctura electric:
cationii (ionii +) spre catod (electrodul -)
p anod ((electrodul +).
)
anionii ((ionii -)) spre

Electrof. n gel de agaroz

Materiale i metod
Proba analizat (produsul PCR etc.)
Agaroz
Soluie tampon (buffer) de electroforez
Soluie tampon de ncrcare (loading
buffer)
ADN standard (marker/ladder)
l
de
d EtBr
Soluie
+

Moleculele se deplaseaz prin mediul

poros (reprezentat de gel).

Viteza (rata) de migrare depinde n

principal de mrimea moleculelor
(fragmentele de ADN).

Flacon
Cuptor cu microunde
Tava pentru gel (rack, gel casting tray)
Matri pentru godeuri (comb)
Pipete micrometrice i vrfuri sterile
Cuva (tancul) de electroforez
Sursa de c.e.
Mnui
Recipient pentru vopsire
Aparat de vizualizare (transiluminator) i
nregistrare (fotografiere)

Pregtirea gelului
ncrcarea probelor
Migrarea (electroforeza ppz.)
Marcarea
Vizualizarea

10

5/19/2015

Electrof. n gel de agaroz

Materiale i metod

ncrcarea probelor

Separarea

Marcarea (staining)

Separarea se poate desfura la tensiuni diferite, n funcie de gradul

de separare dorit i de timpul disponibil.

Pentru vizualizarea/identificarea moleculelor separate prin

electroforez este necesar marcarea acestora.

Orientativ, valoarea voltajului aplicat este de ~5-10 V/cm, raportat la

distana dintre cei doi electrozi). Odat cu creterea voltajului aplicat,
rata de migrare crete. Rata de migrare a fragmentelor mari crete mai
mult comparativ cu cea a fragmentelor mai mici.
n cazul produilor PCR mici, separarea este mai bun i benzile sunt mai
clare dac migrarea se face rapid. Migrarea la tensiuni mici determin
difuzarea macromoleculelor n gel, iar separarea este mai slab.

Marcarea (staining)

EtBr are proprietatea de a se intercala n cadrul unei molecule de

ADNdc. Odat cu intercalarea, fluorescena moleculeor de EtBr
crete semnificativ.

Marcarea

Substane de intercalare bromur de etidiu (EtBr), GelRed,

GelGreen, SYBR Safe etc.
silver
il
staining
t i i
Sonde de hibridare izotopi radioactivi (32P)
antigeni/anticorpi (digoxigenina)
fluorocromi

Marcarea (staining)
Cuv i soluie
de marcare
cu EtBr

EtBr este o substan mutagen/teratogen, deci trebuie

manipulat cu foarte mare atenie. Utilizare:
se poate aduga la pregtirea gelului
dup migrare gelul este introdus ntr-o soluie de EtBr.

Soluie stoc 10 mg/ml

concentraie final:
0,5 g/ml
1 g/ml
etc.

11

5/19/2015

Vizualizarea

Documentarea
rezultatelor
Sisteme digitale
Camere foto speciale

Moleculele de EtBr devin florescente n

prezena luminii (radiaiei) UV.
Cantitatea minim de ADN care poate fi
detectat prin fotografierea gelurilor marcate cu
EtBr este de aproximativ 2 ng dispuse ntr-o
band de 0,5 cm lime. Dac ntr-o band de
aceast dimensiune sunt mai mult de 500 ng
ADN, banda este suprancrcat iar rezultatul
vizualizrii este o pat (smearing).

Interpretarea
rezultatelor

Benzile corespunztoare unor

probe diferite care parcurg aceeai
distan conin molecule care au
strbtut gelul cu aceeai vitez.
Aceasta nseamn c moleculele
au auproximativ aceeai mrime.

12