Sunteți pe pagina 1din 54

Subiecte rezolvate genetica 1. Structura primar a ADN.

ADN este un polimer de dezoxiribonucleotide. Unitatea structural a ADN este dezoxiribonucleotidul, avnd n componen trei elemente distincte: o pentoz, o baz azotat i grupul fosfat a) Pentoza este un glucid cu 5 atomi de carbon, reprezentat de dezoxiriboz, care prezint o grupare OH n poziia 3'. b) Baza azotat poate fi purinic - adenina (A) i guanina (G)- sau pirimidinic citozina (C) i timina (T). Baza azotat se leag printr-o legtur N-glicozi-dic de carbonul 1' al dezoxiribozei, formnd un nucleozid. c) Grupul fosfat (P) se ataeaz la carbonul 5' al pentozei, formnd un nucleotid. Radicalul de acid fosforic confer moleculei un caracter acid. n ADN exist patru tipuri de dezoxiribonucleotide: acid dezoxiadenilic (dAMP), dezoxicitidilic (dCMP), dezoxiguanilic (dGMP) i dezoxtimidilic (dTMP), deosebite numai prin baza azotat. Nucleotidele din ADN se leag ntre ele prin legturi covalente 3'-5' fosfodiester, stabilite ntre OH 5' al dezoxi-ribozei unui nucleotid i OH 3' al dezoxiribozei nucleotidului urmtor. Se constituie, astfel, un lan polinucleotidic continuu, liniar, lung, care repre-zint structura primar a ADN. n structura polinucleotidului (catenei), complexul fosfat-dezoxiriboz este constant, iar baza azotat este variabil. n catena de ADN, nu exist o restricie cu privire la aezarea nucleotidelor, acestea putnd ocupa orice poziie a catenei. Succesiunea nucleotidelor n lungul moleculei de ADN reprezint informaia genetic codificat, pe baza creia este stabilit ordinea aminoacizilor n proteine. Aceast informaie este citit n sensul 5' - 3', deoarece capetele polinucleotidului (n poziia 5' un radical fosfat, iar n poziia 3' un radical OH) sunt libere.

2. Structura secundar a ADN Molecula de ADN este constituit din dou catene polinucleotidice care formeaz un dublu helix. Catenele sunt conectate ntre ele prin intermediul legturilor de hidrogen: dou ntre A i T i trei ntre G i C. Formarea legturilor de hidrogen este posibil numai ntre o baz purinic de pe o caten i o baz pirimidinic de pe catena opus, din cauza dimensiunii moleculare a bazelor. Astfel, cele dou catene ale ADN nu sunt identice, ci complementare. Legea complementaritii bazelor azotate st la baza realizrii funciilor genetice ale ADN: replicarea, transcrierea, repararea, etc. n ADN numrul de adenine este egal cu numrul de timine, iar numrul de guanine egal cu numrul de citozine, respectiv raportul lor este ntotdeauna unitar (A/T = 1; G/C = 1); iar raportul sumelor bazelor purinice i pirimidinice este ntotdeauna unitar (A+G/T+C=1), indiferent de specie. n schimb, raportul A+T/G+C nu este unitar, fiind o caracteris-tic de specie (la om, raportul A+T/G+C = 1,7). Cele dou catene din structura dublului helix au o orientare antiparalel (n sensurile 5' - 3', respectiv 3' - 5'), ca urmare a legturilor dintre bazele complementare. Catenele, asemntoare cu dou panglici, sunt rsucite dextrogir una n jurul alteia, i ambele n jurul unui ax imaginar, de la stnga la dreapta Se formeaz, astfel, o dubl spiral helicoidal, asemntoare unei scri n spiral, n care axele glucidofosforice reprezint marginile, iar perechile de baze treptele scrii. Bazele azotate sunt dispuse n interiorul helixului, perpendicular pe axul glucidofosforic; fiecare pereche de baze (pb) este deviat cu aproximativ 36 fa de pb vecine. Fiecrui tur complet al spirei i corespund 10 pb. Distana dintre bazele suprapuse este de 0,34 nm, astfel c unui tur de helix (10 pb) (pasul elicei) i corespunde o lungime de 3,4 nm. Diametrul dublului helix este de 2 nm. La exteriorul helixului sunt vizibile dou anuri: un an mare, important pentru fixarea pe molecula de ADN a proteinelor reglatoare, i un an mic, necesar fixrii histonelor. Modelul descris corespunde formei B a ADN care, n condiii fiziologice, este forma predominant. Dintre celelalte variante structurale ale ADN celular, cele mai bine cunoscute sunt formele A i Z, care pot fi prezente pe distane scurte. Forma A este mai compact dect forma B i este adoptat la concentraii saline mari. Forma Z este un helix levogir, mai lax ca forma B, cu pasul de rsucire n zig-zag. Formele C, D, E, dextrogire, par s nu existe in vivo. Modelul dublu catenar al ADN asigur stabilitatea informaiei genetice.

3. Tipuri de ADN nuclear Sunt descrise mai multe clase de ADN, diferite prin repetiia secvenelor nucleotidice: ADN nerepetitiv reprezint circa 60% din lungimea total a genomului uman i este alctuit din secvene unice per genom sau n numr foarte mic de exemplare (familii multigenice). Este dispus printre secvenele repetitive, n regiunile eucromatice. Sub 10% (circa 2%) din secvenele nerepetitive reprezint regiunile codante ale genelor care codific proteine (exonii); aceste gene sunt transcrise de ARN-polimeraza II (gene de clas II). Restul ADN-ului nerepetitiv (peste 90%) este necodant, prezent n interiorul genelor (introni) i n regiunile dintre gene, iar funcia sa este nc necunoscut (unii autori consider c aceste secvene reprezint gene represate). ADN moderat repetitiv (ADN repetitiv dispersat) ADN moderat repetitiv reprezint circa 30% din genomul uman i este alctuit din secvene scurte, de 300-1000 pb, repetate de zeci i sute de mii de ori i dispersate n genom. Majoritatea acestor secvene sunt transcrise n ARN i cuprind: genele repetate n tandem care codific ARNr i ARNt, secvenele LINEs i SINEs. Genele pentru ARNr sunt secvene repetate n tandem (150-200 copii), localizate pe braele scurte ale cromozomilor acrocentrici, n regiunile organizatorilor nucleolari (NORnucleolar organizer regions), care formeaz nucleolii n nucleul interfazic (genele pentru ARNr 28S, 18S i 5,8S); genele pentru ARNr 5S sunt situate n vecintatea telomerului, pe braul lung al cromozomului 1. Genele ribozomale sunt transcrise de ARN-polimeraza I (gene de clas I). Genele pentru ARNt (i alte molecule mici de ARN) Genele pentru ARNt sunt gene repetate n tandem, localizate mai ales la nivelul cromozomilor 1 i 6. Aceste gene sunt transcrise de ARN-polimeraza III (gene de clas III). Secvenele LINEs (long interspersed nuclear elements) au lungimea de 1-6 Kb i sunt dispersate n ntregul genom, numrul de copii fiind de circa 500.000 (3-5% din genom). Pn acum, sunt cunoscute dou familii: L1 i The 1. Rolul probabil al acestor secvene este de a asigura mperecherea corect a cromozomilor omologi n meioz, esenial pentru schimbul egal de segmente cromozomiale. Secvenele SINEs (short interspersed nuclear elements) sunt secvene scurte de 150300 pb, dispersate n cromozomi n circa 100.000 de copii. Sunt reprezentate de familia Alu;

funciile acestei familii sunt necunoscute, dar se presupune c ar avea rol n iniierea replicrii n diferite puncte ale ADN. Secvemele Alu pot fi transpozate. Cele mai multe secvene repetitive sunt rezultatul transpoziiei, majoritatea avnd originea ntr-un ARN viral care, sub aciunea unei revers-transcriptaze, va forma o copie ADN ce va fi integrat n alt loc din genom. ADN nalt repetitiv ADN nalt repetitiv reprezint 10% din genom i este alctuit din secvene foarte scurte (2-200 pb), repetate de n tandem de milioane de ori. Secvenele nalt repetitive, care nu sunt transcrise, sunt reprezentate de: - satelii (ADN satelit), prezeni n heterocromatina constitutiv din anumite regiuni cromozomiale - centromer (banda C), telomere (secvena TTAGGG), constricii secundare, benzi G, precum i din cromozomul Y (corpusculul fluorescent); ADN satelit are deci rol structural. - minisateliii sunt secvene foarte scurte, de circa 15 pb, repetate n tandem i dispersate n toi cromozomii (cu excepia cromozomilor X i Y), unde ocup situsuri specifice. Minisateliii sunt alctuii dintr-o regiune central, cu o secven identic, i regiuni periferice variabile. Numrul de copii ale secvenei unui minisatelit, precum i variantele secvenelor acestuia variaz de la o persoan la alta; minisateliii sunt denumii i regiuni hipervariabile (VNTR - variable number of tandem repeats) i reprezint markeri genetici ai individului: amprenta ADN (DNA fingerprinting) sau profilul ADN; probabilitatea de a ntlni doi indivizi nenrudii identici este mai mic de 10-20. - microsateliii sunt secvene de 1-13 pb, cel mai frecvent dinucleotidice (STR - short tandem repeats sau VNDR - variable number of dinucleotides repeats), distribuite neuniform la nivelul genomului. Mini- i microsateliii sunt localizai n regiunile de eucromatin, i anume n ADN extragenic i introni. Aceste secvene repetitive sunt, cel mai probabil, rezultatul unor defecte ale mperecherii (slippage = alunecare) n timpul procesului de replicare a ADN.

4. ADN mitocontrial(Genomul mitocondrial) Genomul mitocondrial are o lungime de 16,6 Kb. Conine un singur tip de ADN circular, dublu catenar. Cele dou catene ale ADN mitocondrial (ADNmt) se deosebesc prin coninutul lor n baze azotate: una este bogat n guanin (catena grea - H), iar catena complementar bogat n citozin (catena uoar - L). Exist o regiune mic, numit bucla D (displace-ment loop), n care ADN este format din trei catene. n fiecare celul uman exist cteva mii de copii ale ADN mitocondrial (ADNmt). Genomul mitocondrial al zigotului provine exclusiv de la ovul, deci este motenit numai de la mam. ADNmt difer de cel nuclear i prin urmtoarele: 1) nu formeaz complexe cu proteine; 2) procentul de ADN codant este mare circa 97%; 3) conine foarte puin ADN repetitiv; 4) este lipsit de introni; 5) replicarea este unidirecional i ncepe n puncte de origine diferite pentru cele dou catene; 6) transcrierea este continu, fr ntrerupere, n direcii diferite pe cele dou catene, rezultnd un transcript multigenic de dimensiune mare; 7) lipsesc unele mecanisme de reparare a leziunilor ADN, astfel c mutaiile se acumuleaz rapid; 8) conine 37 de gene, care codific ARNr de dimensiuni reduse, polipeptide; 9) are 4 codoni stop, din care doi sunt codoni sens n ADN nuclear, iar codonul stop UGA din ADN nuclear este codon sens n ADNmt. ARNt i

5. Cromatina Cromatina reprezint complexul format din ADN nuclear i proteine. Ea se prezint microscopic sub dou aspecte, diferite ca structur i funcie: eucromatina i heterocromatina. Eucromatina este mai puin condensat i slab colorat cu colorani bazici; reprezint cromatina activ genetic (transcripional); se replic precoce n faza S a ciclului celular; conine mai mult ADN nerepetitiv (n care predomin perechile de baze G-C) i proteine nehistonice. Eucromatina poate fi evideniat n cromozomii metafazici sub forma benzilor R. Heterocromatina este puternic condensat sub form de cromocentri i colorat mai intens cu colorani bazici; este cromatina inactiv genetic; se replic tardiv n faza S; conine mai mult ADN repetitiv (n care predomin perechile de baze A-T) i histone. Heterocromatina este de dou tipuri: constitutiv i facultativ. - Heterocromatina constitutiv rmne sub form condensat pe tot parcursul ciclului celular. Nu conine gene funcionale i este format din ADN nalt repetitiv. La nivel cromozomial, heterocromatina constitutiv se gsete n la nivelul centromerului, a telomerelor, la nivelul constriciilor secundare, pe braul lung al cromozomului Y i pe braele scurte ale cromozomilor acrocentrici. Ea ocup poziii identice pe cromozomii omologi i poate fi evideniat n cromozomii metafazici sub forma benzilor C. Se presupune c heterocromatina constitutiv are rol n stabilizarea centromerelor i telomerelor, precum i n sinapsa dintre cromozomii omologi meiotici. - Heterocromatina facultativ este o form de cromatin care a fost sau va fi activ ntr-un stadiu al dezvoltrii ontogenetice i care intervine probabil n reglarea genelor; conine secvene de ADN nerepetitiv. Exemplul cel mai caracteristic l constituie cromatina sexual X, unul dintre cei doi cromozomi X inactivai n celulele somatice feminine. Cromatina sexual Cromatina sexual reprezint un cromocentru distinct, care permite stabilirea sexului genetic (XX sau XY) i a anomaliilor numerice ale cromozomilor sexuali. Cromatina sexual difer la sexul feminin i masculin, deoarece rezult prin mecanisme diferite. Cromatina X La femei (XX), cromatina sexual rezult n urma inactivrii unuia din cei doi cromozomi X. Cromozomul X condensat (heterocromatinizat) este vizibil sub form de corpuscul Barr n majoritatea esuturilor (figura 1.8) sau sub form de apendice nuclear (drumstick - b de tob) pe frotiuri de snge, n polimorfonuclearele neutrofile (figura 1.9). Astfel, att la femeie ct i la brbat, un singur cromozom X rmne activ, iar cromozomii X suplimentari sunt inactivai prin heterocromatinizare. Conform principiului Lyon, inactivarea cromozomului X este total, se produce precoce n perioada embrionar i este definitiv; inactivarea cromozomului X se produce la ntmplare, n unele celule fiind inactivat cromozomul X de origine patern, iar n altele cel de origine matern. Numrul de corpusculi Barr este egal cu suma cromozomilor X 1.

Cromatina Y La brbai (XY), cromatina sexual este reprezentat de heterocromatina de la nivelul celor 2/3 distale ale braului lung al cromozomului Y; poate fi vizualizat, prin coloraia cu quinacrin i examinare microscopic n lumin ultraviolet, sub forma unui corpuscul intens fluorescent, denumit i cromatin Y sau corpuscul F. Numrul de corpusculi F este egal cu numrul cromozomilor Y. 6. Structura supramoleculara a cromatinei(ADN) mpachetarea succesiv a ADN, care realizeaz o scurtare de circa 10.000 de ori a moleculei de ADN, permite att adaptarea materialului genetic la volumul mic al nucleului, ct i controlul exprimrii genelor de pe cromozomi. 1. Primul nivel de organizare supramolecular a cromatinei este filamentul nucleozomic (figura 1.11b) cu un diametru de 10 nm, denumit i fibra de 10 nm. Nucleozomul (figura 1.10) este un complex ADN histone: un segment de ADN se nfoar de 1 ori n jurul unui octamer histonic, de form cilindric, alctuit din cte dou molecule din histonele H2A, H2B, H3, H4. Nucleozomii sunt legai ntre ei printr-un segment de ADN numit ADN de legtur (ADN linker), care este asociat cu histona H1. Se constituie astfel filamentul nucleozomic, asemntor cu un irag de mrgele. Aceast structur reduce lungimea dublului helix ADN (2 nm) de circa 10 ori. 2. Al doilea nivel de organizare a cromatinei este fibra de cromatin de 30 nm (figura 1.11c), care rezult din spiralizarea sub form de solenoid a fibrei de 10 nm. Aceast structur, care reduce lungimea dublului helix de 40 de ori, este stabilizat de histona H1 i conine 6 nucleozomi per tur de helix. Cromatina din nucleul interfazic are ca unitate de organizare fibra de cromatin de 30 nm. 3. Al treilea nivel de organizare a cromatinei este reprezentat de buclele de cromatin (fibra pliat n bucle laterale) cu un diametru de 300 nm, care rezult prin plierea fibrei de cromatin de 30 nm. Fiecare bucl este ataat prin anumite regiuni din structura fibrei de ADN (bogate n AT) la un schelet proteic central. Scheletul proteic central este format din proteine nehistonice. Fixarea buclelor la scheletul central este neregulat, ele formnd, din loc n loc, mici aglomerri de bucle, denumite cromomere. n cromozomii condensai, cromomerele formeaz grmezi, vizibile sub forma benzilor G intens colorate. Buclele de cromatin se spiralizeaz i condenseaz puternic la nceputul diviziunii, alctuind cromatida unui cromozom (figura 1.11e) care, n metafaz, are un diametru de 700 nm i care atinge cel mai nalt grad de condensare a fibrei elementare de cromatin de 30 nm. Fiecare cromatid a unui cromozom conine deci o singur molecul de ADN cu grade succesive de mpachetare. La sfritul diviziunii, cromozomii se despiralizeaz.

Histonele sunt proteine mici bazice, bogate n arginin i lizin, care se fixeaz de ADN la nivelul anului mic. Sunt codificate de gene lipsite de introni, situate pe cromozomii 1, 6 i 12. Se deosebesc cinci tipuri de histone: H1, H2A, H2B, H3, H4, cu rol important n organizarea supramolecular a ADN. Histonele H2A, H2B, i mai ales H3 i H4, au o structur conservat n evoluie. n diferite stadii ale ciclului celular, histonele sunt supuse unor transformri chimice care le confer importante proprieti funcionale: acetilarea lor determin activarea unor gene, metilarea produce represia genelor, iar fosforilarea histonei H1 este urmat de condensarea fibrelor de cromatin n cromozomi i declanarea mitozei. Proteinele nehistonice sunt proteine acide i neutre, de diferite tipuri, prezente n numr redus n structura cromatinei. Ele se fixeaz de ADN la nivelul anului major. Majoritatea proteinelor nehistonice au diferite roluri funcionale, reglnd activitatea genelor. Unele proteine nehistonice formeaz scheletul cromozomilor, avnd deci rol structural. 7.Clasificarea cromozomilor umani Cromozomii sunt identificai pe baza morfologiei lor. Ei sunt clasificai conform Sistemului internaional de nomenclatur citogenetic uman (International System of Human Cytogenetic Nomenclature - ISCN), adoptat n 1995. Pe baza taliei i poziiei centromerului, cromozomii au fost clasificai n 7 grupe, notate de la A la G; fiecare cromozom somatic este desemnat printr-un numr de la 1 la 22. Se obine astfel o aranjare sistematizat a cromozomilor unei celule numit cariotip . Cromozomi mari sunt cromozomii grupei A (perechile 1-3), metacentrici (cromozomul 2 este mai submetacentric) i cromozomii grupei B (perechile 4-5), submetacentrici; Cromozomi mijlocii sunt cromozomii grupei C (perechile 6-12 i cromozomul X), submetacentrici, cromozomii grupei D (perechile 13-15), acrocentrici i cromozomul 16 (aparine grupei E ), metacentric; Cromozomi mici sunt cromozomii grupei F (perechile 19-20), metacentrici, perechile 17-18 (aparin grupei E), submetacentrici i cromozomii grupei G (perechile 21-22 i cromozomul Y), acrocentrici. Conform ISCN, pentru a desemna un cariotip normal sau anormal, se menioneaz n urmtoarea ordine i separai prin virgule: numrul de cromozomi, constituia cromozomilor sexuali i anomaliile numerice sau structurale ale cromozomilor somatici (atunci cnd sunt prezente). Prezena unui mozaic cromozomial se noteaz menionnd cariotipurile liniilor celulare componente, separate printr-o diagonal (/) (pentru detalii vezi Caiet lucrri practice).

8.Heteromorfismul cromozomilor Termenul de heteromorfism cromozomial definete variaiile n morfologia cromozomilor omologi la un individ sau la persoane diferite, iar cromozomul deosebit morfologic de omologul su este considerat a fi cromozom marker. Fiecare individ are cel puin un cromozom marker pe care l transmite, de obicei, neschimbat la descendenii si (poate fi folosit n stabilirea paternitii). Regiunile cromozomiale heteromorfice sunt regiuni de heterocromatin alctuite din ADN repetitiv inactiv genetic, astfel nct nu determin modificri fenotipice i sunt considerate variante morfologice normale. Cele mai cunoscute tipuri de heteromorfism cromozomial sunt: dimensiunea braului scurt al cromozomului Y dimensiunea heterocromatinei centromerice (banda C) dimensiunea sateliilor situsurile fragile induse de inhibitori ai acidului folic

9.Principiul tehnicii de clonare in vivo Clonarea ADN const n producerea unui numr mare de copii ale unei secvene de ADN pe baza procesului de replicare a ADN. Clonarea se poate efectua in vivo (clonare celular), cnd este utilizat procesul natural de replicare, sau in vitro (clonare acelular), prin reacia de polimerizare n lan (PCR). Clonarea ADN in vivo se realizeaz n mai multe etape. 1) Obinerea fragmentelor de ADN Fragmentele de ADN care vor fi amplificate i analizate ulterior pot fi obinute prin secionarea ADN cu ajutorul enzimelor de restricie. Enzimele de restricie (ER) sunt endonucleaze bacteriene care scindeaz moleculele ADN (prin hidroliza legturilor fosfodiester dintre nucleotide) la nivelul unor zone strict specifice genernd fragmente de lungimi variabile, denumite fragmente de restricie (FR). O caracteristic esenial a enzimelor de restricie o constituie specificitatea aciunii lor: o ER i exercit activitatea endonucleazic numai asupra unei anumite secvene nucleotidice (cu lungime de cteva perechi de baze), denumit situs de restricie (SR) sau situs de recunoatere i clivare.

Pentru fiecare ER exist n genom numeroase SR, iar distana care separ aceste situsuri este foarte diferit. In urma aciunii unei anumite ER vor rezulta, deci, o multitudine de FR de lungimi variate, ce pot fi separate electroforetic. Seciunile pe care le efectueaz cele mai multe dintre ER nu sunt situate, de obicei, la acelai nivel pe cele dou catene ale moleculei de ADN; ca urmare, pe o poriune de cteva nucleotide cape-tele fragmentelor vor fi monocatenare: la unul dintre capete vor fi desperecheate nucleo-tidele unei catene, iar la cellalt - nucleotidele catenei opuse. Acest mod de aciune are o importan practic deosebit, deoarece fragmentele ADN generate de o aceeai ER, avnd capete coezive, pot fi fcute s se sudeze ntre ele, pe baz de complementaritate, chiar dac au origini complet diferite, rezultnd o molecul hibrid de ADN recombinant. O alt metod de a obine fragmente de ADN sau gene utilizeaz ARN mesager, produsul de transcripie al genei. Molecula monocatenar de ARNm, extras dintr-o celul care l sintetizeaz n cantiti mari, servete ca matri pentru sinteza unei catene de ADN complementar (ADNc) sub aciunea enzimei transcriptaza invers; prin complementaritate, se sintetizeaz i cea de-a doua caten, obinndu-se astfel o molecul de ADNc bicatenar care corespunde exonilor genei. 2) Formarea moleculelor de ADN recombinant Dup obinerea fragmentelor de ADN uman, este necesar multiplicarea fragmentului. n acest scop, fragmentele sunt inserate n vectori de clonare i cu ajutorul lor sunt introduse ntr-o celul-gazd (bacterie etc.), unde se vor multiplica. Unirea a dou fragmente de ADN de origini diferite produce o molecul de ADN recombinant. Pentru aceasta, moleculele de ADN din cele dou surse sunt secionate cu aceeai ER, producnd capete identice, care se unesc pe baz de complementaritate, iar fragmentele sunt unite cu ajutorul unei ADN-ligaze. a. Vectorii sunt molecule naturale de ADN utilizate pentru a transporta sevenele de ADN de analizat i care au capacitatea de a se replica independent de genomul gazdei. Principalele tipuri de vectori utilizai sunt plasmidele, bacteriofagii i cosmidele. Plasmidele sunt componente ale bacteriilor, fcndu-le rezistente la diferite antibiotice. Sunt alctuite dintr-o molecul mic de ADN circular, dublu catenar extracromozomial, a crei replicare se produce independent de cromozomul bacterian. Bacteriofagii sunt virusuri care infecteaz i distrug bacteriile, replicndu-se de asemenea, independent i rapid; sunt alctuii din ADN dublu catenar liniar. n tehnicicle de clonare cel mai frecvent se utilizeaz bacteriofagul lambda () care atac E. coli.

Cosmidele sunt vectori artificiali - hibrizi formai dintr-un plasmid i situs cos al bacteriofagului . Vectorii n care s-a introdus un fragment de ADN exogen se numesc vectori recombinani. 3) Transformarea i amplificarea Moleculele de ADN recombinant sunt transferate n celule-gazd (cel mai frecvent bacterii nepatogene modificate) n care vectorii recombinani se vor multiplica independent de cromozomul bacterian, producnd mai multe copii identice. Introducerea unui vector ntr-o celul bacterian se numete transformare. Bacteriile transformate sunt multiplicate. In cazul utilizrii vectorilor plasmidici, celulele bacteriene sunt nsmnate pe o plac de agar, n care se plaseaz i o gen de rezisten la antibiotic, precum i antibioticul fa de care s-a indus rezistena. Bacteriile transformate devin rezistente i i continu multiplicarea, fiecare dintre ele formnd o colonie sau clon (populaie de celule identice, provenite dintr-o singur celul). Totalitatea coloniilor, respectiv a fragmentelor de restricie clonate, care conin i ADN de analizat, formeaz o aa-numit banc sau bibliotec de clone ADN (DNA library). In funcie de colecia de FR pe care o conin, acestea sunt biblioteci de ADNc (care cuprind numai secvenele nucleotidice ale genelor active transcripional) i biblioteci genomice. Intruct clona conintoare a FR de interes nu are nici un caracter distinctiv (bibliotecile sunt fr catalog), se procedeaz la screening-ul sistematic al tuturor coloniilor sau plcilor de liz. Secvena cutat poate fi identificat direct (prin hibridizare cu sonde complementare) sau indirect (prin purificarea proteinelor produse de clonele bacteriene i recunoaterea lor cu anticorpi monoclonali). Amplificarea prin clonare rmne ns o procedur laborioas, complicat i mare consumatoare de timp.

10. Clonarea ADN in vitro (metoda PCR) Clonarea ADN const n producerea unui numr mare de copii ale unei secvene de ADN pe baza procesului de replicare a ADN. Clonarea se poate efectua in vivo (clonare celular), cnd este utilizat procesul natural de replicare, sau in vitro (clonare acelular), prin reacia de polimerizare n lan (PCR). Clonarea ADN prin reacia polimerizrii n lan (PCR - polymerase chain reaction) este o metod al crei principiu se bazeaz pe procesul replicrii semiconservative in vitro i prin care se realizeaz amplificarea selectiv i rapid a unei secvene scurte de ADN sau ARN (a crei structur nucleotidic este parial cunoscut). Procedura este extrem de simpl, economic i n ntregime automatizat. Eantionul ADN, ntr-o cantitate foarte mic (care poate proveni dintr-o singur celul), este introdus ntr-un tub coninnd urmtorii reactivi: o ADN - polimeraz termostabil Taq (extras din bacteria termofil Thermus aquaticus), cele patru dezoxiribonucleotide trifosfat i dou oligonucleotide sintetice denumite amorse sau primeri. Amorsele, a cror secven nucleotidic trebuie s fie complementar cu secvenele ADN care flancheaz capetele segmentului ce urmeaz s fie amplificat, constituie punctele la nivelul crora se iniiaz activitatea ADN polimerazei. ntr-o prim etap, segmentul de ADN de amplificat este denaturat termic (la 95C), rezultnd un amestec de fragmente monocatenare. n al doilea timp, prin rcire uoar, amorsele se poziioneaz i hibridizeaz cu secvenele complementare (situate la captul 3) de pe fiecare caten. n a treia etap, pornind de la amorse, ADN-polimeraza ncepe s adauge dezoxiribonucleotide n sensul 5-3 pe matriele reprezentate de monocatenele segmentului int. Renclzirea mediului determin iniierea unei noi reacii de polimerizare. Procesul se desfoar ciclic: la sfritul a n cicluri, n mediul de reacie vor exista 2n molecule de ADN dublu catenar, copii ale seciunii ADN aflat ntre amorse. Cantitatea optim este obinut dup mai puin de 30 cicluri de reacie, cnd n tub vor exista cte 109 copii ale secvenei iniiale. Durata unui ciclu fiind de 5 minute, rezult c aceast cantitate va fi obinut n aproximativ 3 ore. Metoda accept ADN provenit din cele mai variate surse (celule din frotiuri, pete de snge, sperm sau foliculi piloi etc.). Dezavantajele majore ale metodei sunt necesitatea cunoaterii secvenelor capetelor ADN-int (pentru fabricarea amorselor), cantitatea foarte mic de produs i frecvena destul de mare a erorilor de mperechere.

Metoda PCR este aplicat i pentru molecule de ADN complementar: RT-PCR (reverse transcriptase PCR). 11. Analiza ADN genomic uman prin tehnica Southern blot Cele cteva sute de mii de fragmente de restricie care rezult din digestia genomului uman cu enzime de restricie (ER) pot fi separate prin metoda electroforezei n gel. Moleculele ADN au o ncrctur electric negativ, migrnd astfel ctre anod, cu o vitez invers proporional cu greutatea lor molecular. Fragmentele de restricie separate electroforetic se dispun ntr-un ansamblu reproductibil de benzi ADN care sunt invizibile n gelul de agaroz; evidenierea lor se realizeaz prin impregnarea gelului cu un colorant specific pentru ADN (bromura de etidiu) care n lumina ultraviolet devine fluorescent. Analiza structurii fragmentelor rezultate prin digestie cu ER se realizeaz prin metoda marcrii radioactive a ADN, cunoscut sub numele de Southern blot. Ea se desfoar n mai multe etape (figura 2.4): 1) fragmentarea ADN genomic extras din celule, prin clivarea cu o enzim de restricie corespunztoare; 2) separarea fragmentelor de restricie prin electroforez, pe baza dimensiunii lor; 3) denaturarea chimic a fragmentelor ADN bicatenare incluse n gel; 4) transferarea prin capilaritate (blotting) a monocatenelor de pe gelul de agaroz pe o membran de nailon sau de nitroceluloz; se obine, astfel, o replic a modelului de benzi din gelul de agaroz; 5) hibridizarea moleculelor ADN de pe membran cu o sond ADN sau ARN marcat radioactiv, complementar cu secvena urmrit; se vor forma complexe dublu catenare stabile n zonele membranei n care se afl secvenele complementare; 6) detectarea autoradiografic a complexelor dublu catenare (dup contactul membranei cu un film foto). Prin aceast tehnic se poate evidenia prezena sau absena unui fragment de ADNint, obinut din ADN genomic. Importana major pentru medicin a analizei Southern blotting const n capacitatea ei de a detecta polimorfismele lungimii fragmentelor de restricie (restriction fragment length polymorphisms - RFLPs) i, prin aceasta, de a funciona ca instrument de diagnostic ADN indirect. Aceeai procedur poate fi aplicat i pentru ARN, purtnd denumirea de Northern Blot, iar pentru proteine - Western Blot.

12. Analiza cu sonde oligonucleotidice specifice alelelor (allele specific oligonucleotides - ASO). ASO reprezint o metod important de diagnostic a bolilor monogenice produse de mutaii a cror baz molecular este cunoscut. Metoda utilizeaz ca sonde dou sau mai multe oligonucleotide sintetice (15-20 pb), dintre care unul corespunde (n sensul complementaritii bazelor) secvenei genice normale, iar celelalte secvenelor modificate prin mutaie. Metoda ASO este larg utilizat n diagnosticul prenatal al unor afeciuni produse de mutaii punctiforme. Un exemplu de boal genetic al crei diagnostic poate fi stabilit n primul trimestru al sarcinii prin analiza ASO este cel al anemiei drepanocitare. Boala are drept cauz o mutaie punctiform interesnd codonul 6 GAG al genei care codific lanurile -globinice ale hemoglobinei. In urma mutaiei, codonul GAG se transform n GTG, consecina fiind substituirea acidului glutamic cu valina n poziia 6 a lanului aminoacidic al -globinei. Diagnosticul presupune utilizarea unei sonde complementare cu secvena specific genei normale (sonda conine n poriunea central tripleta CTC) i a unei sonde n a crei secven se afl tripleta CAC (aceasta va interaciona specific cu codonul alterat al genei patologice). Dac ADN extras din celulele lichidului amniotic hibridizeaz numai cu sonda specific mutaiei, afectarea ftului este cert; hibridizarea cu ambele sonde relev starea de heterozigot, iar reacia negativ cu sonda pentru gena patologic exclude prezena bolii.

13.Hibridizarea in situ Hibridizarea in situ reprezint o tehnic n care, dup hibridizare cu secvenele specifice din moleculele ADN sau ARN, sondele marcate izotopic sau chimic sunt vizualizate direct pe preparatele celulare sau cromozomiale. Datorit rezoluiei insuficiente i perioadei lungi de timp necesar obinerii rezultatelor, tehnicile care folosesc probe marcate radioactiv tind s fie complet abandonate, n locul lor fiind utilizat tehnica denumit FISH (fluorescence in situ hibridization) sau hibridizare in situ prin marcare fluorescent, relativ simpl i nu foarte costisitoare. Fluorocromii utilizai sunt acidul 7-amino-4-metilcumarin-3 acetic (AMCA) (fluorescen albastr), fluoresceina (fluorescen verde) sau Texas red (fluorescen roie).

Tehnica FISH este aplicat n citogenetica molecular pentru: analiza cromozomilor metafazici sau a nucleilor interfazici cu sonde ADN; pictarea cromozomilor (chromosome painting), care detecteaz cromozomi singulari sau numai pri componente (centromer, telomere); detectarea ntregului genom de exemplu M-FISH (Multicolor-FISH: 24 culori)

14. Fenomenul de nlnuire genic (linkage) i ncruciare cromozomial (crossing-over) Fiecare cromozom este alctuit din mai multe gene nealele, care ocup fiecare un locus distinct. Ele au o dispoziie liniar n cromozom, una dup alta. nlnuirea fizic a locilor aflai pe acelai cromozom se numete sintenie. Genele situate pe acelai cromozom au tendina de a se transmite grupat (odat cu cromozomul respectiv) de la prini la descendeni, prin gamei. Fenomenul n care genele nealele situate aproape una de alta pe acelai cromozom nu segreg n meioz i au tendina de a se transmite mpreun n succesiunea generaiilor se numete nlnuire genic (linkage) (fenomenul se refer la loci, nu i la alele). Genele dintr-o regiune cromozomial transmise mpreun formeaz un grup de nlnuire (linkage group) sau haplotip. Numai genele situate foarte aproape una de alta se transmit totdeauna mpreun, nlnuite. De exemplu, genele C, D i E care determin grupul sanguin Rhesus (Rh), localizate pe cromozomul 1, se transmit nlnuite. Genele situate mai la distan una de alta pe acelai cromozom pot fi separate prin crossing-over. n profaza primei diviziuni meiotice, cromozomii omologi se mperecheaz (sinaps) pe ntreaga lor lungime, formnd uniti alctuite din patru cromatide denumite tetrade (excepie fac cromozomii sexuali X i Y, care se altur prin capetele braelor scurte). La locul de contact (chiasm) dintre cromatidele dispuse central ale unei tetrade (una aparinnd cromozomului patern, iar cealalt cromozomului matern) se produc apoi fenomene de crossing-over, constnd n schimburi reciproce (ncruciate) i egale de gene. Pentru c o gen trece astfel de pe un cromozom pe omologul su, producnd o schimbare a poziiei genelor parentale, fenomenul este numit recombinare genetic. Recombinarea genic intracromozomial produs prin crossing-over este ntmpltoare i nu poate fi prevzut. Probabilitatea de producere a crossing-over-ului ntre

dou gene este direct proporional cu distana fizic dintre ele: cu ct genele sunt mai apropiate, ansa de recombinare este mai mic i invers. Distana dintre dou gene de pe acelai cromozom se exprim n centiMorgan (1cM = 1Mb = 106 pb) sau procent de recombinare.

15. Cadrul de citire Cadrul de citire, aflat n regiunea central a genei, reprezint regiunea transcris, sub aciunea ARN-polimerazei II, n ARN mesager precursor (ARN premesager). El este alctuit din secvene codante numite exoni i secvene necodante numite introni. Exonii sunt secvenele codante ale genei, care codific anumite regiuni ale proteinei numite domenii. Regiunea central a genelor ncepe i se termin cu exoni, ceea ce nseamn c orice gen are n exoni i n-1 introni. Numrul exonilor variaz de la o gen la alta, fiind cuprins ntre 2 i cteva zeci. Exist gene mici cu un singur exon - genele ADN mitocondrial, genele histonelor, genele interferonilor, gena SRY, gena receptorului angiotensinei II, etc.. Lungimea exonilor variaz n limte largi (lungimea medie este de 150 pb) (de exemplu genele insulinei 150 pb, gena distrofinei 180 pb). Intronii sunt secvenele care, n general, nu codific nici un produs specific i care sunt transcrise iniial n ARNm precursor, dar nu se regsesc n ARNm matur. Numrul intronilor variaz de la 2 la genele insulinei, la 79 la genele distrofinei. Lungimea intronilor este variabil (ntre cteva sute i cteva mii de pb), de obicei mult mai mare ca a exonilor. Majoritatea intronilor ncep cu dinucleotidul 5'GT (situs donor) i se termin cu dinucleotidul 3'AG (situs acceptor). Aceste secvene dinucleotidice au rolul de semnale pentru decuparea corect a intronilor n timpul procesului de matisare (splicing). Rolul intronilor nu este nc bine cunoscut. Iniial se considera c funcia intronilor ar consta n separarea exonilor, dar mai recent se accept c ei au rol n autoclivarea ARN, respectiv n reglarea expresiei genelor, iar n unele cazuri au chiar funcii codificatoare. Cadrul de citire al genei ncepe cu situsul de iniiere (start) al transcrierii. Situsul de iniiere este urmat de o regiune netradus numit 5'UTR (untranslated region), care conine o secven consens (prezent la toate genele) i codonul start ATG (locul de iniiere a translaiei, corespunztor primului aminoacid din lanul polipeptidic). Urmeaz primul exon. Dup ultimul exon din cadrul de citire exist o secven netradus 3'UTR, care ncepe cu unul dintre codonii stop (TGA, TAG, TAA); codonii stop reprezint semnalul de oprire a translaiei. Regiunea 3'UTR se continu cu secvena AATAAA care reprezint situsul de

terminare al transcripiei. La circa 20 de nucleotide n aval de situsul terminator se afl situsul de poliadenilare, denumit astfel, deoarece la acest nivel la ARNm se adaug circa 200 de nucleotide cu adenozin; tot la acest nivel se produce i desprinderea ARN-polimerazi i eliberarea moleculei ARN sintetizate. 16. Secvenele de reglare a genei Secvenele de reglare a genelor sunt secvene netranscrise, dispuse de o parte i de alta a cadrului de citire. Majoritatea se afl la captul 5 al genei. a) Promotorul reprezint o succesiune de secvene situat n amonte de cadrul de citire, ntinse pe o distan de circa 150 pb fa de situsului de iniiere a transcrierii. Promotorul conine mai multe secvene nucleotidice scurte, pe care se fixeaz nite proteine reglatoare numite factori de transcripie (TF II transcription factors). Factorii de transcripie au rolul a lega ARN-polimeraza II astfel ca transcripia s nceap exact la situsul de iniiere (cu primul nucleotid) i de a activa enzima, deoarece ARN-polimeraza nu poate recunoate direct promotorul i nu poate iniia singur transcripia. Promotorul cuprinde mai multe secvene: (1) Boxa (cutia) TATA (Hogness) este secvena TATAAA, situat la 25-35 pb n amonte fa de situsul de iniiere a transcrieii. Boxa TATA reprezint locul la care se fixeaz ARN-polimeraza II prin intermediul factorului de transcripie TFIID. Aceast secven este necesar pentru iniierea corect a procesului de transcriere (n punctul de start) i asigur expresia genei la un nivel bazal. Mutaia secvenei permite iniierea transcripiei, dar deplaseaz punctul de start fa de normal. Boxa TATA este prezent la majoritatea genelor specifice unui anumit tip de esut (specific tisulare). La genele comune (housekeeping genes) este prezent, n locul boxei TATA, secvena GC (insulele CG). (2) Boxa CAAT (secvena GGCCAATCT) i boxa GC (secvena GGGCGG) sunt secvene situate n amonte de boxa TATA, la circa 70-80 pb, respectiv 90 pb fa de situsul de iniiere, de care se fixeaz ali factori de transcripie i avnd rolul de a crete eficiena transcrierii. n regiunea proximal a promotorului se mai afl o serie de secvene ADN care, dup fixarea anumitor FT, stimuleaz intens sau, dimpotriv, blocheaz transcripia. Ele determin astfel specificitatea expresiei unei gene n funcie de esut i de stadiul dezvoltrii:

(3) Secvenele octamerice (ATTTGCAT) sunt secvene care determin expresia specific a anumitor gene n funcie de tipul de celul sau de stadiul dezvoltrii ontogenetice. (4) Secvenele (elementele) de rspuns (response elements) sunt secvene care determin transcripia temporar a anumitor gene n funcie de anumite semnale extracelulare (temperatur, concentraia unor ioni, substane nutritive, hormoni, morfogeni); aceste semnale activeaz anumii FT care se fixeaz pe secvenele de rspuns. b) Intensificatorii (activatorii) (enhancers) sunt secvene ADN care cresc nivelul bazal al transcripiei, amplificnd activitatea promotorului (de zeci-mii ce ori). Activatorii sunt situai n amonte fa de promotor, adesea la sute sau mii de pb fa de situsul de iniiere. O serie de intensificatori funcioneaz predominant sau exclusiv n anumite esuturi, ceea ce sugereaz rolul lor n diferenierea celular. c) Atenuatorii (silencers) sunt secvene ADN situate, de asemenea, n amonte de promotor i care reduc sau uneori chiar reprim (blocheaz) transcripia unor gene. 17. ELEMENTE GENETICE MOBILE n general, genele au o poziie fix n genom. Unele secvene de ADN se pot deplasa uneori dintr-o poziie cromozomial n alta, fenomen numit transpoziie; secvenele respective se numesc elemente transpozabile sau transpozoni. n funcie de mecanismele realizare a transpoziiei, elementele transpozabile se mpart n transpozoni i retrotranspozoni. (1) Transpozonii sunt elemente care se deplaseaz ca atare, adic sub forma de secvene ADN. Transpozonii conin n structura lor i genele care codific enzimele (transpozaze) necesare exciziei i inseriei lor. Elementul transpozabil de origine i pstreaz de cele mai multe ori poziia neschimbat i doar copiile acestuia, realizate prin replicare, se deplaseaz i se integreaz n alt poziie din genom. La om, fenomenul de transpoziie este nc discutabil. (2) Retrotranspozonii sunt elemente transpozabile a cror migrare se realizeaz prin intermediul transcriptelor ARN. Denumirea provine de la faptul c mecanismele transpoziiei sunt asemntoare celor prin care se realizeaz deplasarea retrovirusurilor. ARN este copiat, sub aciunea reverstranscriptazei, ntr-o molecul de ADN care va fi integrat, la ntmplare, ntr-o alt regiune a genomului. Retrotranspozonii au originea n elemente retrovirale, care se integreaz n genomul celulelor germinale i se transmit n stare latent n succesiunea generaiilor.

Retrotranspozonii reprezint marea majoritate a elementelor transpozabile la om, ocup circa 10% din genom i sunt reprezentate de dou familii - LINEs i SINEs, diferite prin lungimea i originea lor: LINEs sunt produii transcripiei efectuat de ARN-polimeraza II, n timp ce SINEs deriv din transcriptele primare ale ARN-polimerazei III. Existena elementelor genetice mobile demonstreaz plasticitatea genomului.

18.TRANSCRIPIA Transcripia este procesul prin care informaia genetic a unei gene este copiat ntr-o molecul de ARN complementar i antiparalel, numit ARN mesager (ARNm). Acest proces are loc n nucleu. Acidul ribonucleic (ARN) prezint o serie de particulariti structurale. ARN este alctuit din ribonucleotide. Fiecare ribonucleotid este format din riboz (o pentoz care prezint cte o grupare OH n poziiile 2 i 3), o baz azotat (adenin A, guanin G, citozin C sau uracil U) i un grup fosfat. Prin polimerizarea n sensul 53 a ribonucleotidelor rezult o monocaten, de obicei scurt, de ARN. Se deosebesc mai multe tipuri de ARN, cu funcii diferite: ARNm sau mesager este codant, deoarece prin translaie determin sinteza unui polipeptid; ARNr sau ribozomal particip la formarea ribozomilor; ARNt sau de transfer are rolul de a transporta aminoacizii la ribozomi; ARNsn (mic nuclear) i ARNsno (mic nucleolar) intervin n procesarea intronilor,

respectiv a ARNr. n cele ce urmeaz, este prezentat sinteza ARNm catalizat de ARN-polimeraza II. Elemente implicate n transcripie. Pentru a se realiza sinteza unui ARN mesager sunt necesare:

(1) Ribonucleotide activate. Prin ruperea legturilor fosfat macroergice dintre fosfaii i ai ribonucleozid-trifosfailor (adenozintrifosfat - ATP, guanozintrifosfat - GTP, citidintrifosfat - CTP i uridintrifosfat - UTP) se elibereaz ribonucleotidele (ribonucleozidmonofosfaii) i energia necesar polimerizrii acestora. (2) Matria este reprezentat de o singur caten de ADN. Numai una dintre cele dou catene ale ADN (35) este transcris i servete ca matri pentru sinteza moleculei

complementare i antiparalele de ARNm (53); catena transcris este denumit i caten antisens. Catena ADN netranscris, ale crei secvene nucleotidice sunt identice cu cele ale ARNm, este numit i caten sens . Cele dou catene ale ADN se vor separa astfel temporar i pe lungimi scurte, pentru ca una din ele s serveasc drept matri pentru ribonucleotidele complementare. Alegerea catenei transcrise depinde n mare parte de localizarea i orientarea promotorului. (3) Enzima care catalizeaz tanscrierea ADN genic n ARNm este ARN-polimeraza II (transcriptaz, ARN-polimeraza ADN-dependent). Etapele procesului de transcripie Pentru realizarea transcrierii, este necesar relaxarea (decondensarea) cromatinei, acetilarea histonelor i intervenia elementelor reglatoare din regiunea 5 a genei (asupra crora acioneaz factorii de transripie). Procesul transcripiei se desfoar n dou mari etape: formarea ARN mesager precursor (pre-ARNm sau transcript primar); procesarea (maturarea) ARN mesager precursor.

19. Formarea ARNm precursor Formarea ARN mesager precursor (ARN premesager, transcript primar, ARN heterogen nuclear) ncepe prin decondensarea zonei din ADN care conine gena sau genele ce vor fi transcrise. Acest proces intervin factori de transcripie de clasa I (TF I), acetilarea histonelor i deplasarea histonei H1. ARNm precursor se formeaz n trei etape: iniiere elongare terminare. (1) Iniierea transcripiei. Deoarece ARN-polimeraza nu poate recunoate direct promotorul i nu poate iniia singur transcripia, sunt necesari o serie de factori de transcripie de clas II (TFII), care se fixeaz pe secvenele promotorului, dirijnd i activnd astfel enzima. Primul factor de transcripie care se leag de promotor - TFIID - are o subunitate numit proteina de legare a TATA (TATA binding proteinTBP) care recunoate i se fixeaz de boxa TATA. TFIID atrage dup sine i ali FT (n ordinea TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE i TFIIH), care permit fixarea ARN-polimerazei n regiunea promotor i activarea enzimei (fig. 4.2). Transcripia ncepe (este iniiat) la nivelul situsului de iniiere a transcripiei; primul nucleotid transcris este numerotat convenional +1.

(2) Transcripia propriu-zis (elongarea). Dup fixarea ARN-polimerazei pe regiunea promotor, cele dou catene ale ADN sunt separate prin aciunea TFIIF, care are aciune de helicaz, eliberndu-se catena antisens, 35; catena antisens servete ca matri pentru ataarea complementar, n sensul 5- 3, a ribonucleotidelor activate (fig. 4.3); prin polimerizarea ribonucleotidelor sub aciunea ARN-polimerazei se formeaz ARNpre-m. ARNm se desprinde treptat de pe catena transcris, iar cele dou catene refac treptat dublul helix. (3) Terminarea transcripiei se produce atunci cnd ARN-polimeraza ntlnete situsul de terminare a transcripiei, unde pe catena antisens se afl secvena AATAAA. La 15-30 pb n aval de aceast secven, n dreptul situsului de poliadenilare, se va produce secionarea (sub aciunea unei nucleaze) a ARNm. ARN-polimeraza i factorii de transcripie se detaeaz de matria ADN i se elibereaz molecula de ARNm precursor sau transcriptul primar care conine att exonii, ct i intronii genei copiate. O gen poate fi transcris simultan de mai multe molecule de ARN-polimeraz, formndu-se astfel mai multe copii de ARNm ce conin aceeai informaie genetic. 20 Procesarea (maturarea) ARNm precursor Maturarea ARNm precursor are loc la nivel nuclear i se realizeaz prin dou procese: (1) inseria de secvene nucleotidice la extremitile moleculei i (2) matisarea ARN precursor (fig. 4.4). (1) Inseria de secvene nucleotidice la cele dou capete ale moleculei de ARNm precursor faciliteaz creterea stabilitii moleculei, transportul spre citoplasm, recunoaterea i fixarea sa la subunitatea mic (40S) a ribozomilor. La primul nucleotid al captului 5 al transcriptului primar se adaug o molecul de 7metil-guanozin, formnd o structur denumit bonet (cap). La captul 3 se adaug ntre 50-200 nucleotide cu adenin, formnd o coad poliadenilic. (2) Matisarea ARN precursor. ARNm precursor conine secvenele compementare ntregului cadru de citire, deci att exonii ct i intronii. Matisarea (splicing) const n decuparea i eliminarea intronilor, urmat de reunirea (legarea cap la cap) a exonilor, cu formarea ARNm matur.

Att decuparea, ct i reunirea sunt procese care trebuie s fie foarte precise i care depind de existena secvenelor nucleotidice-semnal situate la limita dintre introni i exoni (situsuri de clivare) - 5GU (situs donor) i 3AG (situs acceptor). Matisarea (splicing) implic urmtoarele procese: (1) clivarea jonciunii 5GU; (2) ataarea nucleotidului G la nucleotidul A al situsului de legtur i formarea unei bucle; (3) secionarea intronului la jonciunea 3AG; (4) ndeprtarea intronului i sudarea secvenelor exonice . Procesul de matisare este mediat de un complex format din ARN nuclear mic (ARNsn) i proteine numit spliceosome sau particule mici ribonucleoproteice (small ribonucleotide particles - snurps). n cadrul procesului de matisare exonii sunt sudai, de cele mai multe ori, n ordinea n care acetia sunt dispui n interiorul genelor - matisare constitutiv (constitutive splicing) (vezi Reglarea expresiei genelor). 21. TRANSLAIA Translaia (traducerea) reprezint a doua etap a expresiei genice i const n decodificarea informaiei genetice din ARNm care permite aranjarea specific a aminoacizilor i polimerizarea lor ntr-un lan polipeptidic. Procesul de translaie necesit un dicionar reprezentat de codul genetic i un aparat de translaie, care cuprinde un traductor, reprezentat de moleculele de ARN de transfer (ARNt), ribozomi, enzime i cofactori proteici. Codul genetic Conform dogmei centrale a geneticii moleculare informaia din structura unei gene, stocat sub forma unei anumite secvene a celor patru tipuri de nucleotide (A, T, G, C) este copiat (transcris) complementar (U, A, C, G) n ARNm i apoi tradus ntr-o anumit secven de aminoacizi, care vor forma un lan polipeptidic. Translaia este efectuat cu ajutorul codului genetic. Codul genetic reprezint relaia de coresponden ntre o anumit secven de trei nucleotide numit codon i un anumit aminoacid. Cele patru litere (nucleotide) pot forma cuvinte alctuie din trei litere, iar gena este un mesaj coerent format dintr-o niruire de codoni (tabel 4.1). Caracteristicile codului genetic. (1) Cuvintele codului sunt reprezentate de grupuri de cte trei nucleotide, numite codoni. Codul genetic este triplet.

Combinaiile celor patru baze luate cte trei (43) realizeaz 64 de triplete de baze sau codoni, dintre care 61 codific un aminoacid (codoni sens). (2) Codul genetic are un codon iniiator (start) (AUG) i trei codoni stop (UAA, UAG, UGA) (codoni nonsens). (3) Deoarece exist 61 de codoni sens i numai 20 de aminoacizi, nseamn c unii aminoacizi pot fi specificai de mai muli codoni; codonii diferii ce codific acelai aminoacid se numesc codoni sinonimi (diferii, de obicei, prin a treia baz), iar codul genetic este degenerat (redundant). Cu excepia metioninei i a triptofanului, codificai fiecare de un singur codon, ceilali 18 aminoacizi sunt codificai de doi sau mai muli codoni. Caracterul degenerat al codului genetic constituie un avantaj pentru celul, oferind protecie mpotriva efectelor mutaiilor (mutaiile genice care produc codoni sinonimi nu afecteaz structura proteinei codificate). (4) Codul genetic este nesuperpozabil: codonii vecini nu au nici un nucleotid comun. (5) Codul genetic prezint continuitate (fr pauze): ntre codonii adiaceni nu exist nucleotide cu rol de virgul. (6) Codul genetic este lipsit de ambiguitate: un codon specific ntotdeauna un aminoacid, totdeauna acelai. (7) Codul genetic este universal, acelai la toate organismele (bacterii, plante, animale i om). Cu toate acestea, codul genetic mitocondrial are cteva mici diferene fa de cel nuclear. 22. Aparatul de translaie Aparatul de translaie este alctuit din ARNm, ARNt, ribozomi, aminoacizi, factori de iniiere, factori de elongare, enzime, surse de energie (GTP, etc) a) ARN de transfer (ARNt) transport aminoacizii din citoplasm la ribozomi, sediul sintezei proteice, unde i poziioneaz n ordinea dictat de codonii din ARNm; ARNt are deci rolul de translator. ARNt este un poliribonucleo-tid monocatenar de dimensiuni mici (75-100 nucleotide), cu structur secundar n trifoi: prezint trei regiuni scurte, dublu catenare numite tulpini, care se termin cu bucle monocatenare (fig. 4.6), structur care este identic la toate tipurile de ARN. ARNt conine dou secvene importante: (1) secvena CCA de la captul 3OH de care se leag aminoacidul cu ajutorul enzimei aminoacil-ARNt-sintetaza; (2) anti-codonul, o secven de trei nucleotide situat n bucla opus captului 3; anticodonul recunoate, prin complementaritate, codonul din ARNm corespunztor aminoacidului.

(b) Ribozomii sunt organite citoplasmatice n care are loc asamblarea aminoacizilor n proteine pe baza informaiei din ARNm. Sunt alctuii din dou subuniti deosebite prin constanta de sedimentare (S). n perioada n care nu sunt implicate n sintez proteic, cele dou subuniti sunt disociate i libere n citoplasm; ele se asociaz la nceputul translaiei formnd ribozomul activ. Fiecare subunitate este alctuit din ARN ribozomal (ARNr) i proteine. Subunitatea mic (40S) prezint un situs de legare a captului 5 a ARNm. Subunitatea mare (60S) prezint dou situsuri nvecinate: situsul A (aminoacil) i situsul P (peptidil) unde se fixeaz moleculele de ARNt cuplate cu aminoacizi (fig. 4.7). (c) Enzimele implicate n procesul translaiei sunt aminoacil-ARNt-sintetaza i peptidil-transferaza. Aminoacil-ARNt-sintetazele sunt 20 de enzime care recunosc i leag fiecare att un aminoacid, ct i ARNt corespunztor. Peptidil-transferaza cata-lizeaz formarea de legturi peptidice ntre aminoacizi. (d) Cofactorii proteici, reprezentai de factorii de iniiere (IF), factorii de elongaie (EF) i factorul de terminare, intervin n diferite etape ale translaiei.

23. Procesul de translaie Translaia se desfoar n trei faze succesive: iniierea, elongarea i terminarea translaiei. (1) Iniierea translaiei este etapa n care primul aminoacid al proteinei (de la captul NH2-terminal) este poziionat n dreptul codonului start AUG din ARNm (ce corespunde metioninei) i sunt asamblate cele dou subuniti. Iniial, ARNm se fixeaz cu boneta (cap) i secvena 5-AUG-3 pe subunitatea mic (40S) a ribozomului; apoi ARNm i primul ARNt ncrcat cu primul aminoacid metionina (ARNt iniiator) formeaz complexul de iniiere; anticodonul ARNt-1 este n contact cu codonul AUG al ARNm. Urmeaz fixarea subunitii mari (60S), iar ribozomul devine activ. ARNt-iniiator ocup situsul P al subunitii mari, situsul A fiind liber (fig. 4.8). (2) Elongarea este etapa n cursul creia se formeaz legturi peptidice ntre aminoacizii aranjai pe baza ordinii codonilor din ARNm. Dup pozionarea ARNt iniiator n situsul P al ribozomului, pe situsul A liber se plaseaz al doilea ARNt ncrcat cu aminoacidul codificat de al doilea codon din ARNm. Sub aciunea peptidil-transferazei, se formeaz o legtur peptidic ntre primii doi aminoacizi; rezult astfel un dipeptid care este legat la cel de-al doilea ARNt. Apoi, sub aciunea unui factor de elongare, GTP i a unei translocaze, ribozomul se deplaseaz cu trei nucleotide n

lungul ARNm, n direcia 53. Astfel, ARNt iniiator prsete situsul P, care va fi ocupat de cel de-al doilea ARNt ce conine dipeptidul. n situsul A eliberat se fixeaz a treilea ARNt cu aminoacidul corespunztor, iar acest al treilea aminoacid se leag de dipeptid (fig. 4.9). Cele trei faze ataarea aminoacid-ARNt la ribozom, formarea legturii peptidice i translocarea ribozomului se repet ciclic, determinnd creterea lanului polipeptidic. Pe msur ce un ribozom avanseaz n lungul moleculei de ARNm, i ali ribozomi pot ncepe citirea moleculei, formndu-se astfel sute sau mii de polipeptide identice (amplificare). (3) Terminarea traducerii are loc n momentul cnd n situsul A ajunge un codon stop (UAA, UAG sau UGA) (fig. 4.10). Deoarece nu exist un ARNt corespunztor codonilor stop, pe situsul A se ataeaz factorii de terminare care leag o molecul de ap la nivelul peptidului. Polipeptidul eliberat astfel din ribozom va suferi o serie de modificri i va dobndi forma tridimensional specific. 24. PROCESAREA POSTTRANSLAIONAL A PROTEINELOR (1) Fiecare protein sintetizat va funciona ntr-un anumit compartiment al celulei sau n spaiul extracelular. Astfel proteinele sunt dirijate (targeting) spre o anumit destinaie cu ajutorul unor secvene semnal, prezente n structura acestora . ntr-o prim etap sunt separate proteinele destinate celulei de cele care vor fi eliminate la exteriorul acesteia. Astfel, proteinele care urmeaz a fi excretate prezint la captul N-terminal o secven de 10-30 de aminoacizi denumit peptid-semnal (signal peptide), absent la proteinele destinate celulei. n momentul n care secvena semnal devine vizibil la suprafaa ribozomului, de ea se leag o particul de recunoatere a semnalului (SRP-signal recognition particle), care oprete procesul de translaie (SRP este o particul ribonucleoproteic, alctuit din ase proteine diferite i ARN 7S). Complexul ribozom-peptid semnal-SRP recunoate i se fixeaz de un receptor al particulei de recunoatere a semnalului (docking protein sau signal recognition particle receptor) aflat pe faa citosolic a membranei reticulului endoplasmic (RE). Odat fixat la RE, translaia se reia, iar polipeptidul traverseaz membrana RE printr-un canal de translocare (translocon); ajuns n lumenul RE, peptidul-semnal se desprinde de protein sub aciune enzimatic (signal peptidase). Mecanismul dirijrii este asemntor pentru proteinele destinate nucleului, complexului Golgi sau mitocondriilor.

Proteinele destinate lizozomilor proteaze conin o secven aminoacidic ce determin ataarea posttrans-laional de manoz-6-fosfat. (2) Pe msura sintezei unui polipeptid, acesta se pliaz n anumite regiuni realiznd structuri secundare (-helix sau -pliere) prin interaciuni ntre diferii aminoacizi. Aceast pliere este posibil numai n prezena unor proteine numite chaperones. Astfel, la sfritul sintezei, polipeptidul are o configuraie tridimensional specific funciei sale. Polipeptidele sufer, de asemenea, diferite modificri permanente sau reversibile, care fac proteina s devin activ. Fosforilarea serinei (kinaze), acetilarea lizinei (histone) sunt exemple de modificri chimice reversibile. Modificrile permanente sunt reprezentate de: a) Clivarea proteolitic a lanului polipeptidic Dup sintez are loc frecvent clivarea i ndeprtarea metioninei iniiale sau, la unele proteine, a peptidului semnal de la extremitatea NH2. Numeroase proteine sunt sintetizate sub form de precursori inactivi (pro-hormoni, pro-enzime); aceti precursori sunt clivai proteolitic, rezultnd proteina matur activ. De exemplu, n cazul insulinei, din produsul genic rezult mai multe lanuri polipeptidice. b) Glicozilarea are loc n RE sau n complexul Golgi n cazul glicoproteinelor secretate. c) Hidroxilarea unor aminoacizi, de exemplu a prolinei i lizinei, este ntlnit n cazul proteinelor esutului conjunctiv - colagen i elastin (asigur integritatea structural); hidroxi-prolina este prezent n structura acetilcolinesterazei i a complementului. e) Adugarea de lipide caracterizeaz proteinele membranei celulare. Cele mai frecvente sunt acilrile (ataarea de acizi grai) i prenilrile. Dintre acizii grai, cel mai frecvent se adaug acidul N-miristic la nivelul glicinei amino-terminale. Proteinele pot fi alctuite din unul sau mai multe polipeptide, de exemplu hemoglobina, fibra de colagen, fiecare dintre ele fiind supus modificrilor postranslaionale.

25. Reglarea epigenetic (pretranscripional) a expresiei genelor Acest tip de reglare are ca scop expresia genelor n anumite organe, esuturi, tipuri de celule sau celule individuale (deci organizarea lor spaial). Pentru aceasta n celulele embrionare difereniate sunt selectate anumite gene, care se vor exprima i la descendenii lor. Aceste fenomene presupun modificarea structurii cromatinei, realizat n principal prin mecanisme epigenetice. n nucleu, ADN formeaz cu histonele structuri cu diferite grade de compactare cromatina. Pentru ca o gen s poat fi transcris, factorii reglatori trebuie s aib acces la promotorul genei. Aceasta necesit o modificare a structurii cromatinei, mai ales a eucromatinei, i anume modificri ale histonelor i metilarea ADN. Acestea sunt reversibile i sunt transmisibile ereditar. a) Modificrile histonelor au drept consecin modificarea cromatinei. De exemplu, metilarea lizinei 4 din structura histonei H3 este asociat cu activarea expresiei genelor, n timp ce metilarea lizinei 9 a aceleiai histone diminu expresia lor. Acetilarea histonelor este asociat cu relaxarea cromatinei, deci cu activarea transcripiei genelor. Cromatina inactiv (heterocromatina) este puternic condensat ca urmare a fixrii strnse a histonei H1. Cromatina activ (eucromatina) este mai relaxat datorit acetilrii histonelor din structura nucleozomului. b) Metilarea ADN este datorat enzimei ADN-metiltransferaza, care introduce o grupare metil n poziia 5 a citozinei secvenelor CG i GC, localizate n promotorul majoritii genelor. Metilarea ADN reprezint cel mai important mecanism de represie a transcripiei. Imediat dup fecundare sunt activate numeroase gene prin demetilarea ambelor genomuri parentale, cromatina se relaxeaz i sunt activate astfel genele necesare dezvoltrii embrionare precoce. Pe msur ce are loc diferenierea celular, unele dintre aceste gene vor fi inactivate selectiv. Metilarea ADN este responsabil i pentru fenomenul de amprentare genomic, care const n exprimarea difereniat a unei gene n funcie de originea, matern sau patern, a acesteia. c) Se consider c trecerea temporar de la configuraia B la forma Z a ADN unor gene face ca acestea s fie mai accesibile la factorii de transcripie.

26. Reglarea transcripional Etapa principal a reglrii expresiei genice are loc n toate celulele la nivelul iniierii transcripiei, mai precis la reglarea activitii ARN-polimerazei II, enzima care transcrie genele care codific proteine. Aceast reglare necesit interaciunea proteinelor transreglatoare (factorii de transcripie) cu secvene specifice, cis-reglatoare, de ADN. Ca rezultat al acestei interaciuni, gene specifice sunt transcrise ntr-un anumit moment. Secvenele cis-reglatoare sunt secvene scurte de ADN la care se fixeaz factori specifici de transcripie; n acest fel este gena este recunoscut de ctre ARN-polimeraz i este reglat specificitatea i intensitatea transcripiei n funcie de necesitile celulare. Unele dintre aceste secvene au localizare precis, la nivelul promotorului genei (TATA, CAAT, GC). Alte secvene, situate n amonte, confer genelor specificitate tisular. Secvenele care regleaz intensitatea transcripiei (intensificatori, atenuatori) au localizare variabil. n urma fixrii factorilor de transcripie pe aceste secvene, cromatina se decondenseaz, ceea ce permite ataarea ARN-polimerazei lng situsul de iniiere i declanarea transcrierii. Factorii de transcripie Factorii de transcripie (transcription factors) (FT) sunt proteine trans-reglatoare care recunosc i se leag de secvenele de reglare (cis) ale ADN. Pentru transcrierea unei gene umane este necesar interaciunea mai multor FT (se cunosc sute de FT). Toi factorii de transcripie conin dou domenii: un domeniu de activare (care activeaz transcrierea) i un domeniu de fixare la ADN; domeniul de fixare are o structur particular de aminoacizi ce formeaz un motiv structural; n funcie de aceasta, se descriu mai multe tipuri de FT: Proteine helix-bucl-helix (helix-loop-helix) la care domeniul de fixare este format din dou -helixuri separate printr-o bucl scurt ; acest model structural este prezent la FT care stimuleaz sinteza de imunoglobuline. Proteine cu degete de zinc (zinc finger), n care aminoacizii se dispun n spaiu sub forma unor degete de mnu, la baza crora se fixeaz un ion de zinc (Zn2+) (cel mai frecvent de cistein sau histidin) (fig. 4.11); acestea se ntlnesc n structura FT ai promotorului genelor menajere

Proteine cu fermoar de leucine (leucine zipper) sunt proteine dimerice; fiecare monomer, -helicoidal, conine cte o leucin la fiecare apte aminoacizi (fig. 4.13). Cele dou helixuri interacioneaz strns (ca un fermoar), mai ales prin legturi ntre leucine. Acest tip de FT se gsesc la unele protooncogene. Deoarece aceste secvene sunt situate adesea la distane foarte mari, n amonte sau n aval de situsul de iniiere, se presupune c activatorul fixat pe secvena intensificatoare interacioneaz cu o component a complexului bazal de transcripie, formnd o bucl de ADN care apropie cele dou secvene. Factorii de transcripie sunt codificai de aa-numitele gene reglatoare (master genes sau selector genes), situate aproape sau la distan mare (40.000 pb) de genele pe care le controleaz. Promotori alternativi Unele gene umane au doi sau mai muli promotori. Prin folosirea lor alternativ rezult diferite izoforme ale unei proteine, cu proprieti diferite. Alegerea promotorilor nu se face la ntmplare, ci prin aciunea unor factori trans-reglatori, dintre care unii specific tisulari. Selectarea promotorilor are loc, de exemplu, n cazul genei distrofinei, care are cel puin opt promotori. Patru promotori sunt situai n regiunea 5 i sunt specifici pentru cortexul cerebral, cerebel, muchi, limfocite; datorit folosirii unui prim exon diferit, produc patru izoforme de distrofin, diferite prin captul N-terminal. Ceilali patru promotori sunt intragenici, n structura cadrului de citire; atunci cnd transcripia ncepe la nivelul acestor promotori sunt folosii numai o parte din exoni, rezultnd izoforme mici de distrofin prezente n retin, celulele Schwann, rinichi.

27. Reglarea postranscripional Dup transcripie, reglarea expresiei genelor poate consta ntr-o modificarea calitativ sau cantitativ a ARNm. (1) n procesul de matisare exonii sunt reunii, de cele mai multe ori, n ordinea n care sunt dispui n gene - matisare constitutiv (constitutive splicing) La numeroase gene umane, din ARNm precursor sunt eliminai att intronii, ct i o parte din exoni; moleculele de ARN matur conin doar anumii exoni care pstreaz ordinea n care sunt dispui n gen. Prin acest proces de matisare alternativ (alternative splicing),

dintr-un transcript primar se formeaz molecule diferite de ARNm matur. n felul acesta o gen poate determina sinteza mai multor proteine diferite. Uneori, aceste proteine sunt izoforme, avnd funcii similare. Alteori se produc proteine complet diferite ca structur i funcie; de exemplu, gena calcitoninei produce n celulele C din glanda tiroid calcitonina (hormon cu rol n reglarea metabolismului fosfocalcic), iar n hipotalamus un peptid nrudit cu calcitonina (calcitonin-related peptide) (cu funcii neuromodulatoare i trofice). (2) Amestecarea exonilor (exon shuffling) reprezint un alt proces prin care, din aceeai gen, se obin proteine cu structuri i funcii diferite: ARNm matur conine toi exonii, dar ntr-o ordine diferit fa de gen; (3) Editarea ARN (RNA editing) este o form rar de procesare a ARNm n care se produce deleia, inseria sau substituia unui nucleotid. n felul acesta, n esuturi diferite acelai ARNm i modific structura, producnd proteine diferite ca lungime. La om, fenomenul de editare a fost descris n gena pentru apolipoproteina B (apoB este un transportor de grsimi); n intestinul subire, n codonul 2152 al ARNm pentru apo B, C este nlocuit cu U, transformnd un codon sens ntr-un codon stop, oprind astfel translaia (varianta scurtat a apo B leag i transport grsimile de origine alimentar); n ficat, acelai ARNm nu este modificat, producnd o protein apo B mai lung (transport grsimile sintetizate de ctre ficat). (4) Poliadenilarea alternativ Genele care conin la nivelul regiunii 3UTR dou sau mai multe situsuri de poliadenilare pot suferi procese de adenilare alternativ, specifice pentru anumite esuturi. (5) Modificarea stabilitii (duratei de via) a ARNm Durata de via a ARNm depinde de cantitatea acestuia. De exemplu, ARNm al histonelor are o stabilitate crescut n timpul replicrii ADN, cnd sinteza acestor proteine este intens, i foarte sczut n alte faze ale ciclului celular. ARNm al unor protooncogene are o stabilitate anormal de crescut i determin o sintez excesiv a proteinelor corepunztoare. (6) Modificarea stocajului ARNm Dup transcripie moleculele de ARNm pot fi stocate n nucleu sau citoplasm printrun mecanism nc necunoscut. Unii hormoni pot produce o cretere rapid a sintezei de proteine prin eliberarea ARN stocat i nu prin stimularea transcripiei.

29. Elemente implicate n replicarea ADN


(1) Dezoxiribonucleotide activate (dezoxiribonucleozide trifosfat - dNTP): dezoxiadenozintrifosfat (dATP), dezoxiguanozintrifosfat (dGTP), dezoxicitidintrifosfat (dCTP) i dezoxitimidintrifosfat (dTTP). Ruperea legturilor fosfat macroergice dintre fosfaii i elibereaz dou grupuri fosfat i formeaz dezoxiribonucleotide activate. (2) Matria (tipar) este reprezentat de fiecare caten parental de ADN. (3) Enzimele care catalizeaz sinteza de ADN sunt numite ADN-polimeraze. La om au fost identificate cinci ADN-polimeraze, notate , , , i ; replicarea ADN nuclear este realizat de ADN-polimeraza , enzima major a replicrii i ADN-polimeraza ; ADNpolimeraza realizeaz replicarea ADN mitocondrial, iar ADN-polimerazele i sunt implicate n repararea ADN. (4) ADN-helicazele catalizeaz desfacerea dublului helix de ADN (folosind energie rezultat din ruperea legturilor fosfat macroergice) i elibereaz monocatenele matri. Helicazele acioneaz n puncte specifice numite origini de replicare, asigurnd apoi naintarea furcii de replicare prin ruperea legturilor de hidrogen, despiralizarea i deschiderea moleculei, pentru a deveni accesibil diferitelor proteine ale replicrii. (5) Proteinele de replicare A (RPA), numite i proteine de legare a monocatenelor ADN sau proteine SSBP (single-strand binding protein) menin separate cele dou catene desfcute de helicaze; SSBP se fixeaz la monocatenele ADN i mpiedic remperecherea bazelor, deci respiralizarea. (6) ADN-topoizomerazele I i II. Despiralizarea dublului helix fr rotaia acestuia creaz n aval de furca de replicare nite superhelixuri (asemntor separrii brute a firelor rsucite dintr-o frnghie); topoizomerazele rup legturile fosfodiester la nivelul uneia (topizomeraza I) sau a ambelor catene (topizomeraza II), produc rotaia liber a capetelor helixului i apoi resudarea lor; n acest fel topoizomerazele detensioneaz (relaxeaz) molecula de ADN. (7) Primaza este o ARN-polimeraz specific implicat n sinteza primerului i replicarea catenei ntrziate. ADN-polimerazele nu pot iniia replicarea, o pot doar continua. Astfel, sub aciunea primazei se sintetizeaz primerul, un fragment scurt de ARN (10-12 nucleotide), complementar cu catena matri; ADN-polimeraza adaug, la captul

OH 3 al primerului, circa 30 de dexoxiribonucleotide. Primaza i ADN-polimeraza sunt apoi ndeprtate, sinteza lanului continund sub aciunea ADN-polimerazei . (8) Proteinele de replicare C (RPC) se leag la jonciunea dintre primer i matri, stabiliznd interaciunea ADN-polimerazei cu matria ADN. (9) Antigenul nuclear de proliferare celular (PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen) se leag n imediata vecintate a proteinelor C; ambele controleaz pornirea sau oprirea replicrii. (10) Ribonucleaza H1 (RNaza H1) ndeprteaz primerul ARN, folosit pentru iniiera replicrii; lacuna rmas este completat de ADN-polimeraza , iar sudarea capetelor este realizat de ctre o ADN-ligaz, refcnd continuitatea catenei.

30.Mecanismul molecular al replicrii ADN


Procesul de replicare ncepe n puncte specifice numite origini de replicare (ori) i, de aici, progreseaz n ambele direcii, pn ce ADN este complet duplicat . La nivelul originilor de replicare, pe ADN se fixeaz enzimele replicrii: topoizomerazele, helicazele, primazele, ADN-polimerazele. Dublul helix este despiralat sub aciunea topoizomerazelor, iar catenele sunt separate temporar de ctre helicaze, formnd furca de replicare, o structur n form de Y. Pe fiecare caten separat se fixeaz proteinele SSB (RPA), care mpiedic remperecherea bazelor complementare i refacerea spontan a dublului helix. Pe cele dou catene matri, ADN-polimeraza ataeaz secvenial i complementar dezoxiribonucleotidele activate. Polimerizarea nucleotidelor se face diferit pe cele dou catene, care sunt antiparalele. ADN-polimeraza nu poate ncepe sinteza prin legarea a dou nucleotide; ea poate doar s adauge nucleotide la captul 3OH al unui lan preexistent (ADN-polimeraza poate numai s alungeasc catena n curs de sintez); de aceea necesit utilizarea unui primer ARN, sintetizat sub aciunea primazei. Sinteza se poate efectua numai n sensul 5-3. Astfel numai una din cele dou catene, denumit caten conductoare sau directoare (leading strand) (catena care are ca matri catena 5-3) poate fi sintetizat n mod continuu i n sensul deplasrii furcii de replicare.

Cealalt caten - catena ntrziat (lagging strand) (catena care are ca matri catena 3-5) - este sintetizat discontinuu i mai lent, sub form de secvene scurte (100-1000 nucleotide) denumite fragmente Okazaki; sinteza fiecrui fragment are loc n sens opus celui n care se deplaseaz furca de replicare. Primerul este eliminat prin hidroliz i nlocuit cu secvene ADN, sub aciunea ADNpolimerazei , iar fragmentele sunt unite de ctre o ADN-ligaz. Primerul este necesar numai la nceputul replicrii pentru catena conductoare, iar pentru catena ntrziat la sinteza fiecrui fragment Okazaki

31. Particularitile replicrii ADN la eucariote

(1) Datorit dimensiunii mari a genomului i asocierii cu proteine, viteza de replicare este mai redus circa 50 nucleotide/secund (fa de 500 nucleotide/secund la procariote). Replicarea ncepe n mai multe puncte de origine (secvene specifice de ADN) care corespund unitilor de replicare numite repliconi. Replicarea progreseaz bidirecional pentru fiecare replicon i, dup ce se termin, repliconii fuzioneaz treptat pn ce ntregul cromozom este duplicat. (2) Comportamentul proteinelor nucleozomale n timpul replicrii nc nu este cunoscut cu precizie; se tie ns c, odat cu siteza ADN, n nucleu are loc i o intens sintez de histone, necesare formrii de noi nucleozomi. (3) Replicarea are loc n faza S a ciclului celular i dureaz, n celulele umane, circa 8 ore (la un ciclu celular de 24 de ore). Deoarece acest timp este scurt pentru replicarea celor peste 6 miliarde de pb din genomul uman, uneori pot apare erori. Relicarea este reglat de o serie de proteine: diferite cicline asigur trecerea din faza G1 n faza S, precum i progresia prin faza S; CDK4 este o protein-kinaz activatoare anumii factori de transcripie activeaz punctele de origine, iar alii stimuleaz expresia genelor necesare intrrii n faza S; Inhibitorii kinazelor dependente de cicline - CKI - blocheaz intrarea i progresia prin faza S (prin inhibarea complexelor CDK-cicline i PCNA) atunci cnd apar leziuni ale ADN sau cnd un esut a ncheiat diferenierea.

Replicarea celor 20-80 de repliconi nu este sincron i se realizeaz ntr-o anumit ordine, n funcie de structura cromatinei: la nceputul fazei S este replicat eucromatina, iar la sfritul fazei S este replicat heterocromatina. n mod normal, ntregul genom este replicat n faza S o singur dat. (4) Replicarea telomerelor Telomerele sunt alctuite din secvene hexamerice repetitive TTAGGG dispuse n tandem pe o lungime de 5-20 kb. Un fenomen caracteristic telomerelor este pierderea de secvene ADN la fiecare replicare, deoarece, la captul 5 al catenelor nou sintetizate replicarea este incomplet, pierzndu-se la fiecare ciclu celular ntre 25 i 200 pb. Aceasta duce la scurtarea progresiv a telomerelor i, dup un numr de replicri (maximum 80 la celulele somatice, cnd este atins limita critic de circa 1,5 kb), la oprirea replicrii i a diviziunii. La nivelul celulelor germinale, n succesiunea generaiilor, lungimea telomerelor rmne nemodificat datorit aciunii enzimei telomeraza. Telomeraza este o reverstranscriptaz special care conine o secven scurt de ARN, complemetar secvenelor repetitive telomerice; telomeraza adaug secvene TTAGGG la captul 3, fr a necesita o matri (fig. 5.4.). n majoritatea celulelor somatice, expresia genei telomerazei este inhibat nc din stadiul embrio-fetal. Dispariia activitii telomerazei dup natere determin scurtarea progresiv a telomerelor dup fiecare diviziune, pe msura naintrii n vrst. Cnd este atins o lungime critic, diviziunea se oprete i ncepe senescena. Pierderea telomerelor produce, de asemenea, instabilitate genomic, urmat adesea de rearanjamente cromozomiale. Telomeraza este reactivat n celulele canceroase (vezi Cap. Boala canceroas). (5) Procesul de replicare este realizat de ctre ADN-polimeraze cu mare fidelitate: rata erorilor de mperechere (mismatch) este de circa 1/109. ADN-polimeraza are, n primul rnd, capacitatea de a poziiona corect bazele complementare (probabil pe baza conformaiei tridimensionale). n al doilea rnd, ADNpolimerazele i au activitate de corectare (proofreading), nlturnd nucleotidele greit ncorporate printr-o aciune 3-5- exonucleazic. Puinele erori de mperechere care apar n prezena mecanismelor menionate sunt reparate.

32. Recombinarea genetic Fenomenul recombinrii genetice conduce la apariia unor combinaii genetice noi (recombinani) prin rearanjarea (reasortarea i redistribuirea) materialului genetic de la doi genitori diferii. Procesul este foarte larg rspndit, asigurnd, n limite naturale, variabilitatea informaiei ereditare. Recombinarea genetic are loc n perioadele preconcepional i concepional i este de dou tipuri: cromozomial i genomic. 1. Recombinarea cromozomial are loc n gametogenez i poate fi intra- i intercromozomial. Recombinarea intracromozomial (omoloag) este reprezentat prin procesul de crossing-over cromozomial, care se realizeaz n profaza primei diviziuni meiotice (vezi Gametogeneza), n urma cruia are loc un amestec de gene ntre cromozomii omologi paterni i materni. Aceast recombinarea intragenic produce o gen hibrid (fuziune genic) ce conine fragmentul terminal dintr-o alel i restul de secven din cealalt alel (fig. 6.1.). Recombinarea intercromozomial se realizeaz ca urmare a segregrii bivalenilor din tetrad n anafaza meiozei primare, repartizarea unei perechi de omologi n celulele-fiice fiind ntmpltoare i independent de celelalte perechi. Consecina segregrii ntmpltoare i independente o reprezint faptul c fiecare gamet dobndete o combinaie diferit de cromozomi paterni i materni. 2. Recombinarea genomic are loc n fecundare prin reasortarea (amestecarea) cromozomilor (genomilor) din cei doi gamei (de la doi indivizi diferii), determinnd apariia unor descendeni care difer genetic att de cei doi genitori, ct i ntre ei: pentru fiecare gamet exist 223= 8.388.608 variante de combinaii cromozomiale, iar pentru fiecare zigot exist 246 posibiliti (246 = 70.368.744.177.664). Cele trei tipuri de recombinare au loc secvenial, permind amplificarea diversificrii genetice a indivizilor dintr-o specie. Recombinarea genetic duce, n timp, la diversificarea fondului genetic al speciei prin: creterea spectrului de genotipuri individuale, creterea gradului de heterozigoie i apariia indivizilor mai viabili i mai fertili. Fiecare individ este un unicat genetic (la nivel molecular, celular, fiziologic, morfologic i psiho-comportamental). Individualitatea genic explic, printre altele, capacitatea difereniat de adaptare, predispoziia diferit la diversele boli, rspunsul diferit al indivizilor la administrarea unui medicament, compatibilitatea sau incompatibilitatea grefelor etc.

33. Mutaiile: definitie, clasificare Mutaiile sunt modificri accidentale (nenaturale), permanente i ereditare (transmisibile n succesiunea generaiilor) ale secvenei de nucleotide din ADN. Aceste modificri produc variante alelice ale secvenei de ADN (genic sau extragenic). Clasificarea mutaiilor a) n funcie de mrimea materialului genetic interesat, se deosebesc trei categorii de mutaii: genice, cromozomiale i genomice. Mutaiile genice intereseaz secvena de nucleotide a unei gene. Mutaiile cromozomiale produc modificri ale structurii cromozomilor i, implicit ale ordinii genelor n cromozomi (rearanjri sau remanieri cromozomiale). Mutaiile genomice sunt modificri ale numrului diploid al cromozomilor: aneuploidie cnd sunt afectate 1-2 perechi, sau poliploidie cnd sunt afectai toi cromozomii. b) Dup tipul celular afectat: mutaii somatice i germinale. Mutaiile somatice sunt mai frecvente; nu se transmit la urmai, ci numai de la o celul la alta, formnd o clon celular (populaie celular) anormal mozaicism somatic; sunt rspunztoare de apariia cancerului i de accelerarea procesului de mbtrnire. Mutaiile germinale sunt mai rare i nu afecteaz individul, dar se transmit la urmai (sunt ereditare);. c) n funcie de cauz, mutaiile se clasific n spontane i induse. Mutaiile spontane sunt mutaii ale cror factori cauzali (de cele mai multe ori naturali) nu pot fi identificai (se consider adesea a fi rezultatul unor erori de copiere n cursul procesului de replicare). Mutaiile induse sunt mai frecvente i sunt produse sub aciunea unor factori fizici (radiaii ionizante), chimici sau biologici. Modificarea informaiei genetice nu este, obligatoriu, nsoit de modificarea fenotipului. Majoritatea mutaiilor germinale ale ADN extragenic nu se exprim fenotipic, ele fiind neutre; sunt responsabile de producerea unor variante alelice care formeaz polimorfismul ADN. Mai rar, mutaiile pot avea efecte benefice (avantajoase), determinnd o adaptare mai bun la mediu, la diferite agresiuni din mediul extern sau creterea fitness-ului. Alterori ele sunt dezavantajoase (detrimentale, patogene), implicate n producerea unor boli; mutaiile reprezint, de altfel, cea mai important cauz de boal la om.

34. Substituia - nlocuirea unei singure baze azotate - reprezint cel mai frecvent tip de mutaie la om i poate fi de dou tipuri: tranziia, constnd n nlocuirea unei baze purinice (A sau G) sau pirimidinice (C sau T) cu o baz de acelai tip; transversia, mai rar ntlnit, n care o baz purinic (A sau G) este nlocuit cu o baz pirimidinic (C sau T) i invers. Consecinele substituiei asupra informaiei genetice Substituia unui nucleotid poate avea consecine diferite n funcie de localizarea mutaiei: secvene codante, necodante sau secvene reglatoare ale genei. (1) n regiunile codante (exoni), substituia poate interesa un codon sens sau nonsens. Substituia ntr-un codon sens poate produce: a) un codon sens sinonim, care codific acelai aminoacid; poplipeptidul codificat rmne neschimbat, deci mutaia este neutr din punct de vedere fenotipic i evolutiv i se numete mutaie silenioas (mut) (silent mutation) sau sinonim; circa 25% din mutaiile punctiforme sunt silenioase. GUU AAG GCU GCU Val Lys Ala Ala GUU AAA GCU GCU Val Lys Ala Ala b) un alt codon sens care va codifica un aminoacid diferit; aceste mutaii sunt nesinonime, deoarece modific sensul unui codon i sunt denumite mutaii cu sens greit (missense mutations). Substituiile cu sens greit pot fi clasificate n: - conservative - cnd aminoacidul este nlocuit cu altul similar din punct de vedere chimic i funcional (de exemplu, arginina i lizina), astfel c efectul asupra funciei proteinei este minim; - neconservative - nlocuirea unui aminoacid cu un altul diferit din punct de vedere chimic i funcional i care modific funcia proteinei; aceste mutaii sunt cele mai frecvente n patologia uman (50%). GUU AAG GCU GCU Val Lys Ala Ala GUU AAG GAU GCU Val Lys Asp Ala ex. HbS din anemia drepanocitar (mutaia GAGGTG duce la nlocuirea acidului glutamic cu valina). c) un codon non-sens sau stop, care nu codific nici un aminoacid; urmarea o constituie terminarea prematur a procesului traducerii, cu formarea unui ARNm mai scurt,

iar dac acesta este stabil, va rezulta o protein de dimensiuni mai reduse, nefuncional (de obicei instabil, mai alesa dac mutaia se produce la nceputul genei); aceste mutaii, numite mutaii fr sens (nonsens mutation), reprezint circa 12% din mutaiile produse la om; de exemplu n talasemii (anemii hemolitice datorate producerii insuficente fie de lanuri , fie de lanuri ale globinei). GUU AAG GCU GCU Val Lys Ala Ala GUU UAG GAU GCU Val stop Substituia ntr-un codon nonsens poate produce: a) un codon sens, care codific un aminoacid; astfel transcripia va continua pn la urmtorul codon stop, formndu-se un ARNm i un poplipeptid anormal de lungi. b) un alt codon stop (foarte rar), mutaia fiind fr efect asupra proteinei. (2) n regiunile necodante intragenice mutaia intereseaz cel mai frecvent intronii (10-15% din mutaii). Substituia se produce la nivelul situsurilor de clivare (splicing) a intronilor (splice site mutation), adic situsul donor 5-GT sau acceptor AG-3; mutaia acestor situsuri poate avea urmtoarele efecte: - abolirea (pierderea) situsurilor de clivare a unui intron; clivarea se produce la urmtorul exon i astfel n ARNm matur se va gsi o secven intronic sau va lipsi un exon (exon skipping), n funcie de situsul afectat; - activarea unor situsuri criptice de clivare (secvene similare unui situs autentic); n ARNm matur va fi prezent un fragment de intron sau va lipsi o parte din exon. n ambele situaii produsul matisrii este nefuncional. (3) Mutaiile secvenelor reglatoare conduc la o funcionare anormal a mecanismelor de control ale expresiei unei gene normale. Astfel, gena se poate exprima ntrun esut neadecvat (unde n mod normal gena ar trebui s fie represat exprimare ectopic) sau la un moment nepotrivit. Aceste mutaii afecteaz cantitatea de protein sintetizat. Mutaiile promotorului modific rata transcripiei, iar cele ale situsului de poliadenilare influeneaz stabilitatea moleculei de ARNm.

35. Deleii i inserii mici (microdeleii, microinserii) Deleia (pierderea) sau inseria (introducerea) unuia sau a mai multor nucleotide reprezint circa 25% din totalul mutaiilor la om. Dac deleiile sau inseriile sunt un multiplu de trei nucleotide, se produce pierderea sau adugarea unor aminoacizi n protein. GUU AAG GCU GCU Val Lys Ala Ala GUU ---GCU GCU Val Ala Ala De exemplu, la europeni, circa 70% din cazurile de fibroz chistic sunt produse de mutaia F508del (prin deleia a trei nucleotide din gena CF se pierde fenilalanina din poziia 508 a proteinei CFTR) Dac deleiile sau inseriile nu sunt un multiplu de trei nucleotide, se produce o decalare a cadrului de citire al genei de la locul n care s-a produs deleia sau inseria. Aceste mutaii, numite mutaii cu modificarea cadrului de citire (frameshift mutations), altereaz ntreaga secven de aminoacizi n aval de locul mutaiei. GUU AAG GCU GCU Val Lys Ala Ala GUU AGG CUG CU Val Arg Leu

36. Leziuni extinse (remanieri genice aberante)- crossing-over inegal Leziunile extinse se produc prin schimburi ntre dou secvene alelice sau nealelice de ADN i sunt mai rare n patologia uman. Cel mai important mecanism este recombinarea omoloag nealelic (RON) produs ntre secvene similare situate n regiuni diferite ale cromozomilor. Ea se produce cel mai frecvent n profaza meiozei primare (cnd are loc mperecherea omologilor) i const ntr-un schimb reciproc inegal - crossing-over inegal , prin care se modific ambele cromatide (unul dintre cromozomi va avea o duplicaie a unei secvene, iar cellalt o deleie a aceleiai secvene).

37. Mutaii dinamice (instabile) Conform conceptului clasic, mutaiile sunt modificri permanente, stabile, care se transmit nemodificate la descendeni. Recent (dup 1991) a fost descoperit o nou clas de mutaii, complet diferit de mutaia clasic, denumit mutaie dinamic (instabil, extensia sau amplificarea repetrilor trinucleotidice) Mutaiile dinamice sunt reprezentate de creteri ale numrului unor secvene repetitive trinucleotidice (CAG, CTG, CGG sau GAA) dispuse n tandem n exoni, introni sau la capetele genei. Caracteristica fundamental a acestor mutaii o constituie instabilitatea lor, exprimat prin creterea, cu ocazia diviziunilor celulelor purttoare, a numrului de copii ale respectivelor secvene repetitive. Pn a deveni manifeste, se numesc premutaii, caracterizate doar prin instabilitate; odat depit numrul critic de repetri, mutaia este complet, se manifest fenotipic i se accentueaz pe msura creterii repetrilor. Ca urmare a extensiei (creterii) progresive a repetrilor pe msura diviziunii celulelor liniei sexuale, bolile produse de mutaii dinamice, transmise de obicei dominant, se caracterizeaz prin fenomenul de anticipaie: debuteaz mai precoce i prezint simptomatologie mai sever n succesiunea generaiilor. Formele cele mai severe se transmit mai des prin unul din prini efect parental. n majoritatea lor, variaiile numerice ale repetrilor trinucleotidice sunt lipsite de efecte fenotipice. Sunt cunoscute, pn n prezent, mai multe excepii, reprezentative fiind: - expansiunea CGG la nivelul promotorului genei FMR1 (Frax Mental Retardation) de pe cromozomul X (Xq27.3) (6-50 repetri n gena normal, 50-200 n premutaie) de la 230 la peste 1000. Mutaia produce o metilare anormal a repetiiilor CGG i apariia situsului fragil pe Xq, asociat cu inhibarea expresiei genei FMR1 i instalarea sindromului X fragil, transmis XD. - expansiunea CAG la nivelul exonului 1 al genei umane HD (codific huntingtina) de pe cromozomul 4p16.3; gena normal conine un numr de repetri mai mic de 26; o cretere a repetrilor peste 37 la nivelul genei produce boala Huntington, transmis AD; expansiunea modific funcia proteinei, genernd o secven poliglutamic anormal - repetarea ntre 50 i cteva mii de ori a secvenei CTG din regiunea 3 netradus a genei DMPK (codific o protein-kinaz) (alela normal conine ntre 5 i 30 de repetri) determin apariia distrofiei miotonice Steinert, transmis AD. Mecanismul de producere a expansiunii nu este cunoscut exact; se presupune c este rezultatul alinieri greite i mperecheri decalate a repetrilor trinucleotidice - glisare replicativ.

C. Cauzele mutaiilor genice Mutaiile genice se pot produce spontan, natural (cel mai frecvent prin erori ale procesului de replicare) sau pot fi induse de ageni din mediul extern sau intern numii mutageni. Aceste cauze, spontane sau induse, determin leziuni ADN, definite ca fiind orice modificare a structurii normale a ADN. Leziunile ADN reprezint semnalul pentru intrarea n activitate a mecanismelor reparatorii; n lipsa refacerii structurii normale (reparrii), respectivele modificri se fixeaz sub form de mutaii. Principalele tipuri de leziuni ADN sunt: modificri ale bazelor purinice sau pirimidinice: dezaminri spontane, metilri, adiii, substituii sau pierderi de baze i crearea de situsuri abazice (apurinice sau apirimidinice); formarea de puni intracatenare sau intercatenare; rupturi monocatenare i bicatenare.

38.Cauzele mutatiilor spontane Cauzele mutaiilor genice Mutaiile genice se pot produce spontan, natural (cel mai frecvent prin erori ale procesului de replicare) sau pot fi induse de ageni din mediul extern sau intern numii mutageni. Aceste cauze, spontane sau induse, determin leziuni ADN, definite ca fiind orice modificare a structurii normale a ADN. Leziunile ADN reprezint semnalul pentru intrarea n activitate a mecanismelor reparatorii; n lipsa refacerii structurii normale (reparrii), respectivele modificri se fixeaz sub form de mutaii. Principalele tipuri de leziuni ADN sunt: modificri ale bazelor purinice sau pirimidinice: dezaminri spontane, metilri, adiii, substituii sau pierderi de baze i crearea de situsuri abazice (apurinice sau apirimidinice); formarea de puni intracatenare sau intercatenare; rupturi monocatenare i bicatenare.

Mutaii spontane. Cele mai importante mecanisme de producere a mutaiilor spontane sunt: (1) Erori ale procesului de replicare

Modificri spontane de tipul formelor tautomere ale bazelor. Formele cetonic (C=O) i aminic (C-NH2) sunt mai stabile, adic mai normale din punct de vedere genetic, dar pentru perioade scurte de timp bazele pot exista i n formele enolic (C-OH), respectiv iminic (C=NH), mult mai instabile; de exemplu, forma imino a adeninei nu formeaz legturi de hidrogen cu timina, ci cu citozina. (2) Leziuni spontane pot apare prin dezaminare sau depurinare a bazelor. Citozina sufer adesea o dezaminare spontan, transformndu-se n uracil (baz anormal pentru ADN) i astfel perechea de baze CG este transformat ntr-o pereche AT (U se aseamn structural cu T), deci s-a produs tranziia CT (fig. 6.3.). Aceast tranziie este frecvent la nivelul dinucleotidul CG din regiunea promotoare a genelor. Dezaminare spontan poate suferi i adenina, guanina sau 5-metilcitozina, transformndu-se n hipoxantin, xantin, respectiv timin. La temperaturi crescute sau scderea pH-ului celular, legtura N-glicozidic dintre o baz purinic i dezoxiriboz poate fi scindat prin hidroliz - depurinare spontan, rezultnd un situs apurinic. 39.Cauzele mutatiilor induse(radiatiile) Cauzele mutaiilor genice Mutaiile genice se pot produce spontan, natural (cel mai frecvent prin erori ale procesului de replicare) sau pot fi induse de ageni din mediul extern sau intern numii mutageni. Aceste cauze, spontane sau induse, determin leziuni ADN, definite ca fiind orice modificare a structurii normale a ADN. Leziunile ADN reprezint semnalul pentru intrarea n activitate a mecanismelor reparatorii; n lipsa refacerii structurii normale (reparrii), respectivele modificri se fixeaz sub form de mutaii. Principalele tipuri de leziuni ADN sunt: modificri ale bazelor purinice sau pirimidinice: dezaminri spontane, metilri, adiii, substituii sau pierderi de baze i crearea de situsuri abazice (apurinice sau apirimidinice); formarea de puni intracatenare sau intercatenare; rupturi monocatenare i bicatenare.

Mutaii induse Mutaiile induse sunt produse de ageni mutageni din mediul extern sau intern. (1) Factorii mutageni din mediul extern (radiaii ultraviolete, radiaii ionozante, ageni chimici) produc diferite alterri ale structurii ADN.

Cele mai frecvente sunt radiaiile ultraviolete (componente ale radiaiei solare) care produc dimerizarea pirimidinelor adiacente (n special a timinelor adiacente) (fig. 6.4.). Agenii carcinogeni - fum de igar, poluani atmosferici (ageni alchilani sau metilani, hidrocarburi policiclice n produii de combustie), gudroane, medicamente antitumorale, difeite metale produc adiii ale unor radicali chimici. Radiaiile ionizante cuprind undele elecromagnetice cu lungime de und foarte mic (raze X i raze gama) i particule cu energie nalt (particule alfa i beta, neutroni). Sursele de radiaii la care sunt expuse populaiile umane sunt naturale (radiaii cosmice, materiale radioactive) i artificiale (radiologie diagnostic sau terapeutic, expunere profesional, expunere accidental). Cantitatea de radiaii ptruns n esut se numete doz de radiaii i se msoar n doz absorbit de radiaii rad (radiation absorbed dose). Deoarece oamenii sunt expui la mai multe surse, se folosete unitatea rem (roentgen equivalent for man). Un rem de radiaie este doza absorbit ce produce acelai efect biologic ca 1 rad de raze X. 100 rem echivaleaz cu 1 Sievert (Sv). Doza medie de radiaii primit de gonade este de 2,4 Sv pe an i 72 Sv pe perioad reproductiv (30 de ani) sau 6-7 rem pe an i 30-80 rem pe 30 de ani. Radiaiile ionizante (X, gama) produc mai ales rupturi mono- sau bicatenare ale ADN-ului, dar dozele sunt foarte sczute, permind sistemelor de reparare s remedieze leziunile. Uneori, acestea sunt lipsite de eficien, putnd aprea mutaii, care sunt, de obicei, sub form recesiv. Radiaiile ionizante au efect cumulativ n timp, care depinde de doza total ncasat. Riscul este mic la nivelul populaiei generale, dar mai crescut la persoanele expuse profesional. O serie de substane chimice au efect mutagen prin: - interferare cu sinteza ADN: analogii bazelor azotate (au structur similar bazelor normale, putnd fi ncorporate accidental n ADN): de exemplu 5-bromouracil, cofeina (analogi ai timinei), 2-aminopurina (analog al adeninei) - alterarea structurii ADN: azot iperita, acridinele, epoxizii Dintre factorii biologici, cei mai importani sunt virusurile: - virusurile oncogene produc modificri structurale la nivelul cromozomilor (sesizat pentru viruii rubeolei, parotiditei epidemice, herpetici). - la unii virui, efectul mutagen const n inseria lor n genomul celulei gazd i decalarea cadrului de citire.

(2) Factorii mutageni din mediul intern. Cei mai importani sunt speciile reactive de oxigen (peroxizi de hidrogen, radicali hidroxil) i produii de peroxidare a lipidelor (acroleina, malodialdehida). Dac sistemele antioxidante de reparare nu sunt eficiente, aceti ageni produc substituii de baze i rupturi monocatenare.

40. Repararea erorilor de mperechere Obinuit, n cursul procesului de replicare ADN-polimerazele poziioneaz nucleotide activate pe baza complementaritii. Uneori, ns, se produce o mperechere greit, necomplementar (mai ales G-T) (cu o probabilitate de 1:10.000), care creaz distorsiuni ale dublului helix, acestea acionnd ca semnal pentru ndeprtarea bazei inserate greit. ADN-polimerazele pot interveni i printr-un alt mecanism important de autocorectare (proofreading). Enzimele verific dac la captul 3OH nu s-a produs o mperechere greit; dac a aprut o eroare, ndeprteaz nucleotidul necomplementar prin capacitatea 3-5 exonucleazic (ruperea legturii fosfodiester de la captul 3) pe care o posed ADN-polimerazele i . Puinele erori care apar n ciuda acestor mecanisme sunt supuse dup replicare unor mecanisme de reparare a erorilor de mperechere MMR (mismatch repair). Cele mai importante enzime din sistemul MMR sunt codificate de genele Mut H, Mut L i Mut S (la om MLH1, MSH2, MSH6, PMS1 i PMS2). Produii acesor gene recunosc mperecherile greite (care produc o distorsiune a catenei nou sintetizate); procesul de reparare const n clivarea i degradarea exonucleazic a fragmentului (de peste 1-2 Kb) ce conine eroarea i refacerea secvenei normale (n care sunt implicate ADN-polimerazele i ). Mutaiile genelor din sistemul MMR sunt implicate n producerea cancerului non-polipozic colorectal ereditar. 41. Repararea bazelor modificate dup replicare Bazele azotate pot fi modificate postreplicativ sub aciunea unor ageni exogeni sau endogeni. (1) Mecanismul de reparare prin excizia bazei (base excision repair BER) intervine n cazul leziunilor produse de ageni endogeni. O baz modificat chimic (cel mai frecvent prin dezaminare spontan) este ndeprtat sub aciunea unei ADN-glicozilaze, care cliveaz legtura N-glicozil dintre baza azotat i dezoxiriboz. Se produce astfel un situs abazic (apurinic/apirimidinic) care este recunoscut de ctre endonucleaza APE1

(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1), enzima esenial pentru acest tip de reparare la om. Enzima cliveaz catena ADN la captul 5 al situsului abazic, dup care intervine ADNpolimeraza care ndeprteaz reziduul 5-dezoxiribozo-fosfat, introduce nucleotidul corespunztor, iar continuitatea catenei este refcut de ctre o ligaz. (2) Reparare fr excizia bazei sau repararea direct monoenzimatic (base excision repair BER) intervine n cazul leziunilor produse de ageni alchilani (endogeni sau exogeni). Agenii alchilani transfer gruparea metil n situsurile reactive ale bazelor azotate, de exemplu n cel al guaninei rezultnd o guanin metilat (care se poate mperechea cu timina). Modificrile produse de agenii alchilani sunt reparate direct, fr a ndeprta bazele azotate, de o enzim specific numit metilguanin metil-transferaza (MGMT); aceasta transfer gruparea metil de la nivelul metilguaninei pe un reziduu propriu de cistein formnd metilcisteina (care inactiveaz enzima). Astfel la fiecare reparare este distrus o ntreag enzim, iar mecanismul de reparare nu poate face fa atunci cnd leziunile sunt produse de ageni alchilani exogeni. (3) Reparare prin excizia nucleotidelor (nucleotide excision repair NER). Aceast cale este utilizat pentru corectarea leziunilor care produc distorsiunea dublului helix, ca de pild dimerii de pirimidin produi de radiaiile ultraviolete sau modificrile chimice produse de aflatoxin sau benzpiren. Sistemul de reparare este complex i cuprinde mai multe gene (ale cror mutaii au fost identificate n dou afeciuni rare: Xeroderma pigmentosum i sindromul Cockayne). Modul de localizare a leziunii nu este pe deplin cunoscut. Dup recunoatere, este blocat activitatea helicazelor i se formeaz un complex mare proteic care va produce incizia dubl a catenei ce conine leziunea; dup ndeprtarea fragmentului cu leziune, este resintetizat ADN-ul (cu ajutorul ADN-polimerazei sau ) i sunt legate capetele de ctre ligaz. Mecanismele MMR, BER, NER reprezint variante ale unui mecanism general de reparare prin excizie-resintez, care difer prin tipul leziunii, modul de recunoatere i prin moleculele reparatoare, i care se realizeaz n mai multe etape: recunoaterea leziunii de ctre enzime specifice; desfacerea dublului helix de ctre o helicaz; excizia fragmentului lezat i a unui segment nvecinat sub aciunea unei endonucleaze; ndeprtarea i degradarea fregmentului de ctre exonucleaze;

resinteza componentelor lacunei, folosind ca matri catena complementar de ADN, de ctre ADN-polimeraze; formarea legturii fosfodiester ntre fragmentul nou sintetizat i capetele libere ale catenei de ADN de ctre o ADN-ligaz.

42.ANOMALIILE CROMOZOMIALE Cnd modificrile cantitative sau calitative ale materialului genetic implic regiuni cromozomiale suficient de mari pentru a fi vizibile la microscopul optic de rutin folosind tehnici de analiz citogenetic (cariotiparea, bandarea, autoradiografia etc.), ele sunt denumite mutaii sau anomalii cromozomiale. Anomaliile cromosomiale sunt modificri ale structurii sau numrului cromozomilor. 1. Clasificarea anomaliilor cromozomiale a) Dup momentul producerii lor, se mpart n constituionale i dobndite. Anomaliile constituionale se produc n cursul gametogenezei unuia din prini sau n primele etape ale embriogenezi, fiind prezente la natere. Anomaliile dobndite apar n cursul vieii, sub form de clone celulare anormale. b) Dup modul de afectare a cromozomilor, se mpart n structurale i numerice. Anomaliile cromozomiale structurale se caracterizeaz prin modificarea structurii normale a cromozomilor. n funcie de efectul lor fenotipic, sunt mprite n anomalii structurale echilibrate i neechilibrate. Anomaliile echilibrate (translocaii i inversii) sunt caracterizate prin modificarea poziiei unuia sau a mai multor segmente cromozomiale, deci fr afectarea cantitii de material genetic i fr efecte fenotipice (n majoritatea cazurilor). Anomaliile neechilibrate (deleii, duplicaii, cromozomii inelari, cromozomii dicentrici i izocromozomii) sunt caracterizate prin prezena suplimentar (trisomie parial) sau absena (monosomie parial) a unei pri din cromozom. Anomaliile cromozomiale numerice sunt modificri ale numrului de cromozomi fa de numrul normal diploid (2n = 46). Ele se clasific n poliploidii prezena n plus a unuia sau mai multor seturi haploide de cromozomi i aneuploidii prezena n plus sau absena unuia sau a ami multor cromozomi. c) n funcie de numrul de celule afectate, se mpart n omogene i n mozaic. Anomaliile omogene se caracterizeaz prin prezena anomaliei n toate celulele individului,

iar cele n mozaic prin prezena a dou sau mai multe linii celulare diferite prin numrul de cromozomi (provenite din acelai zigot). d) n funcie de tipul de cromozom afectat, se clasific n autozomale (intereseaz cromozomii somatici), gonozomale (intereseaz cromozomii sexuali X sau Y) i mixte (sunt implicai i autozomi i cromozomi sexuali). e) n funcie de tipul de celul afectat, se mpart n somatice (care modific fenotipul individului afectat) i germinale (care nu modific fenotipul individului afectat, dar se pot transmite prin gamei la descendeni) 43.Anomalii structurale intracromozomiale Anomaliile cromozomiale structurale (mutaii cromozomiale) Modificrile structurale sunt consecina ruperii cromozomilor i reunirii anormale a capetelor cromozomiale. (1) Deleiiile (del) sunt anomalii cromozomiale neechilibrate, care constau n pierderea unui fragment cromozomial. Prezena unei singure rupturi determin apariia unei deleii terminale (fig. 6.5a); fragmentul acentric se pierde, iar la captul rupt se formeaz un nou telomer; deleia terminal poate fi observat doar prin tehnici de bandare (deleie microscopic) sau de citogenetic molecular (FISH) (deleie submicroscopic sau microdeleie) Deleia interstiial (fig. 6.5b) se produce n prezena a dou rupturi pe acelai bra cromozomial, cu eliminarea segmentului intermediar i reunirea extremitilor; deleiile interstiiale sunt mai frecvente dect deleiile terminale, deoarece nu implic formarea de noi telomere (necesare pentru stabilizarea cromozomului). Toate deleiile produc o monosomie parial (haploinsuficien) pentru genele situate n regiunea cromozomial absent. n funcie de dimensiunea fragmentului absent, deleia permite sau nu supravieuirea. Atunci cnd fragmentul absent depete 2% din mrimea setului haploid, monosomia este incompatibil cu viaa postnatal. Deleiile submicroscopice (microdeleiile) determin sindroame ale genelor contigue, n care manifestrile fenotipice sunt datorate pierderii mai multor gene nvecinate. Cele mai frecvente deleii ntlnite n practic sunt sindromul Wolf-Hirschhorn (del4p), sindromul cri du chat (del5p), sindromul velo-cardio-facial DiGeorge (del22q11), sindroamele Prader-Willi i Angelman (del 15q11-12) .a. (2) Cromozomii inelari (r) sunt consecina a dou rupturi produse pe brae diferite ale cromozomului; prin reunirea extremitilor fragmentului cu centromer (centric) se formeaz un cromozom inelar (fig. 6.6.), iar fragmentele acentrice (terminale) se vor pierde. Aceast

anomalie realizeaz o deleie i monosomie parial a segmentelor terminale cromozomiale; cromozomii inelari, de exemplu r(21), r(X), sunt mai rari n practic, deoarece sunt instabili. (3) Inversiile (inv) sunt determinate de prezena a dou rupturi; nainte ca procesul de reunire s aib loc, segmentul dintre cele dou puncte de ruptur sufer o rotaie de 180o. Atunci cnd ambele rupturi sunt localizate pe acelai bra al cromozomului, iar fragmentul rotit nu conine centromerul, inversia este denumit paracentric (fig. 6.7a). Inversiile pericentrice includ i centromerul, fiind produse prin rupturi pe ambele brae (fig. 6.7b). Inversiile paracentrice nu pot fi recunoscute cu ajutorul tehnicilor clasice de coloraie, deoarece nu modific forma cromozomului; ele pot fi ns identificate prin metodele de bandare, deoarece succesiunea benzilor este evident alterat. Inversiile pericentrice pot fi detectate i cu ajutorul tehnicilor uzuale, atunci cnd rupturile sunt localizate la distane diferite fa de centromer, deoarece se modific poziia centromerului Inversiile sunt anomalii cromozomiale echilibrate, care nu determin modificri ale cantitii de material genetic, ci doar n ordinea genelor de pe segmentele cromozomiale inversate. Ele produc, n schimb, tulburri ale procesului de crossing-over, gameii formai fiind neechilibrai. (4) Duplicaia (dup) reprezint dublarea unui segment cromozomial, care se poate ataa n tandem (pstrnd succesiunea genelor) sau se rotete cu 180 inversnd ordinea genelor (duplicaie n tandem invers). Consecina o reprezint apariia unei trisomii pariale pentru segmentul duplicat. Duplicaia poate avea ca origine un crossing-over inegal (cel mai frecvent), o translocaie echilibrat sau un izocromozom. La om, duplicaia este mai frecvent ntlnit comparativ cu deleia, iar consecinele sale fenotipice sunt mai puin severe; duplicaiile produse la nivel molecular pot avea un important rol n evoluie, prin diversificarea genic. Cele mai frecvente duplicaii sunt: dup12q i dup17q, care produc sindromul Pallister, respectiv sindromul Charcot-MarieTooth. (5) Izocromozomul (i) se formeaz prin clivarea anormal, transversal a centromerului. In acest caz, rezult un cromozom telocentric instabil, care poate fi transformat ntr-un cromozom metacentric, ale crui brae au un coninut genetic identic, denumit izocromozom (alctuit numai din brae scurte sau numai din brae lungi) (fig. 6.8). Prezena unui izocromozom presupune existena unei monosomii pentru braul pierdut i a unei trisomii pentru braul implicat n formarea izocromozomului. Cel mai frecvent, izocromozomul a fost identificat la circa 20% din cazurile de sindrom Turner i(Xq):

pacientele prezint, alturi de un cromozom X normal, un izocromosom pentru braul lung al celuilalt cromosom X (fig. 6.9). 44. Anomalii structurale intercromozomiale Anomaliile cromozomiale structurale (mutaii cromozomiale) Modificrile structurale sunt consecina ruperii cromozomilor i reunirii anormale a capetelor cromozomiale. (1) Translocaiiile constau n transferul unui fragment cromozomial ntre doi cromozomi. Translocaiile pot fi reciproce, robertsoniene i nereciproce (inserii). Translocaia reciproc (t) se caracterizeaz printr-un schimb reciproc de segmente cromozomiale ntre doi cromozomi neomologi, care au suferit rupturi (fig. 6.10a). In funcie de lungimea segmentelor cromosomiale schimbate, translocaiile reciproce pot fi egale sau inegale. Translocaiile reciproce au o importan deosebit pentru patologia uman, deoarece purttorii unei translocaii echilibrate, normali fenotipic, pot da natere unor descendeni cu o constituie cromozomial anormal (translocaie, trisomie sau monosomie parial). Translocaia robertsonian (rob) sau fuziunea centric este o translocaie reciproc ntre doi cromozomi acrocentrici (excepie cromozomul Y), omologi sau neomologi, care sufer rupturi la nivelul braelor scurte. In majoritatea cazurilor, rupturile se produc la nivelul centromerelor sau pe braele scurte, foarte aproape de centromer, rezultnd un cromozom monocentric sau dicentric i dou fragmente acentrice (ce conin ambele brae scurte, care se pierd) (fig. 6.10b); pierderea braelor scurte (conin genele pentru ARN ribozomal) este lipsit de efecte fenotipice, deoarece sunt suficiente genele rmase pe cromozomii acrocentrici normali. Numrul de cromozomi din celul se reduce de la 46 la 45. Fuziunea centric a cromozomilor 13 i 14 rob(13q14q) este cea mai frecvent de translocaie la om, fiind urmat, ca frecven, de fuziunea centric a cromozomilor 14 i 21 rob(21q14q). Purttorii unei translocaii robertsoniene sunt normali fenotipic dar pot da natere unor descendeni anormali; de exemplu, n cazul translocaiei rob(21q14q), prin fecundare cu gamei normali pot rezulta ase tipuri de zigoi: normal, cu translocaie robertsonian, cu trisomie 14, cu monosomie 14, cu trisomie 21 i monosomie 21. Inseria (ins) este o translocaie nereciproc ce const n inseria unui segment cromozomial n regiunea interstiial a unui cromozom neomolog; este condiionat de prezena a trei rupturi (dou pe un cromozom i una pe cellalt cromozom) (fig. 6.11.), fiind astfel o anomalie rar. Din nou, purttorul inseriei este sntos, dar descendenii si pot fi neechilibrai genetic (cu monosomie sau trisomie parial).

(2) Cromozomii dicentrici (dic) rezult din deleia regiunilor telomerice de la doi cromozomi, urmat de fuzionarea lor telomeric (fig. 6.12.). Numrul de cromozomi din celul se reduce la 45. Dac cei doi centromeri sunt suficient de ndeprtai unul de cealalt, unul dintre ei se inactiveaz rezultnd un cromozom pseudocentric, care se poate menine pe parcursul a mai multe generaii celulare. Cromozomul dicentric cu ambele centromere active este instabil i va fi eliminat n timpul diviziunii. 45. Anomalii cromozomiale numerice La om, celulele somatice normale sunt diploide (2n = 46 de cromozomi), iar celulele sexuale normale sunt haploide (n = 23 de cromozomi). Anomaliile numrului de cromozomi sunt de dou tipuri: poliploidii i aneuploidii, care pot fi omogene sau n mozaic. a) Poliploidia reprezint multiplicarea setului haploid (n) de cromozomi, de exemplu 3n, 4n, 5n etc. Singurele poliploidii identificate la om sunt triplodia i tetraploidia. (1) Un set haploid de cromozomi suplimentari determin apariia unei celule triploide (3n = 69 cromozomi); formula genetic pentru o astfel de celul este 69,XXX, 69,XXY (cea mai frecvent) sau 69,XYY. Triploidia este incompatibil cu viaa postnatal, fiind observat frecvent la embrionii avortai n primele sptmni de sarcin. Majoritatea produilor de concepie triploizi care au supravieuit o anumit perioad de timp au avut o constituie cromozomial n mozaic 3n/2n, cu prezena unui numr mare de celule diploide. Triploidia poate fi consecina unor defecte din timpul: meiozei: lipsa diviziunii unuia din precursorii celulelor sexuale, ducnd la apariia unui gamet diploid; este frecvent lipsa eliminrii globulului polar din ovocitul II, urmat de fecundarea cu un spermatozoid normal (diginie). mitozei: n cazul mozaicurilor (3n/2n) fecundrii: fertilizarea ovulului de ctre doi spermatozoizi (dispermie); Cercetrile efectuate cu ajutorul tehnicilor de bandare sugereaz c factorii paterni, i ndeosebi dispermia, sunt sursa predominant a triploidiei la specia uman. (2) Tetraploidia (4n = 92 cromozomi), multiplicarea de 4 ori a numrului haploid de cromozomi (92,XXXX, 92,XXYY etc.), este extrem de rar i ntotdeauna letal. Poate fi consecina fuzionrii a doi gamei anormali, neredui (2n), dar acest mecanism este improbabil (sunt menionate doar cteva cazuri n literatur). Este mai plauzibil ipoteza

suprimrii primei diviziuni de clivare a unui zigot diploid, dup diviziunea cromozomilor, dar nainte de diviziunea citoplasmei (absena citokinezei). Poliploidia poate apare i n decursul vieii adulte, datorit unui accident mitotic absena citokinezei (endomitoza): cromozomii se comport normal pn n stadiul de telofaz, dar citokineza nu se produce, rezultnd o celul tetraploid cu 4n cromozomi monocromatidieni. Celule poliploide se ntlnesc n unele esuturi i n condiii normale; astfel, megacariocitele din mduva osoas au de 8-16 ori numrul haploid de cromozomi. Celule tetraploide sunt prezente, de asemenea, i la nivelul ficatului n regenerare, ca urmare absenei citokinezei. 46.Cauzele aneuploidiilor omogene Aneuploidia este modificarea numrului de cromozomi din una sau mai multe perechi; pot exista unul sau mai muli cromozomi n plus sau n minus fa de numrul normal. Aneuploidia este nregistrat n populaia uman mai frecvent comparativ cu poliploidia, iar consecinele sale sunt importante pentru patologia uman. Aneuploidia implic modificri numerice att la nivelul autozomilor, ct i a cromozomilor sexuali (X sau Y). Cauzele principale ale aneuploidiei omogene sunt erori produse n cursul meiozei: nondisjuncia (nedisjuncia) i pierderea de cromozomi datorit procesului de retardare anafazic. a) Non-disjuncia meiotic Non-disjuncia reprezint lipsa separrii cromozomilor unei perechi de omologi n anafaza meiozei I (non-disjuncia cromozomial) sau a cromatidelor surori ale unui cromozom meioza II (non-disjuncia cromatidian); datorit acestei erori, ambele elemente (cromozomul sau cromatida) trec n una din celulele-fiice i vor lipsi n cealalt celul-fiic. Non-disjuncia poate interesa cromozomii somatici sau cromozomii sexuali. Non-disjuncia din gametogenez determin apariia unor gamei anormali, avnd consecine diferite la brbai i la femei, din cauza particularitilor gametogenezei la cele dou sexe. Astfel, la brbat, dintr-un spermatocit primar rezult patru spermatozoizi funcionali; fiecare diviziune meiotic fiind nsoit de eliminarea unui globul polar Din acest motiv, la brbat, nondisjuncia n decursul primei meioze va determina apriia unor spermatozoizi disomici (n+1) i nulisomici (n-1), n timp ce nondisjuncia care survine n

decursul meiozei II va produce i gamei normali, alturi de gamei disomici i nulisomici (fig. 6.15.). La femeie ns, non-disjuncia survenit fie n decursul primei, fie a celei de a doua meioze, nu poate produce dect ovule anormale, disomice sau nulisomice (fig. 6.16.). Dup fecundarea cu un gamet normal, gameii disomici i nulisomici vor forma un zigot trisomic sau monosomic. Posibilitatea ca un zigot anormal s fie consecina unei anomalii survenite n timpul ovogenezei este astfel mai mare dect cea a unei anomalii similare aprute n decursul spermatogenezei. b) Retardarea (ntrzierea) anafazic (fig. 6.13.) const n deplasarea cu ntrziere a unui cromozom (cromatid) n cursul anafazei meiozei I sau II i care, n momentul refacerii membranelor nucleare, va rmne n afara celulelor-fiice. n consecin, apar gamei nulisomici care, prin fecundare, vor forma zigoi monosomici. 47.Cauzele aneuploidiilor in mozaic Aneuploidia este modificarea numrului de cromozomi din una sau mai multe perechi; pot exista unul sau mai muli cromozomi n plus sau n minus fa de numrul normal. Aneuploidia este nregistrat n populaia uman mai frecvent comparativ cu poliploidia, iar consecinele sale sunt importante pentru patologia uman. Aneuploidia implic modificri numerice att la nivelul autozomilor, ct i a cromozomilor sexuali (X sau Y). Aneuploidiile n mozaic sunt de obicei consecina unei erori produse n cursul mitozei zigotului. a) Non-disjuncia zigotic. Rezultatul non-disjuniei zigotice este apariia unui mozaic (mixoploid), a crui constituie cromozomial depinde de momentul n care a avut loc accidentul mitotic. Astfel, dac non-disjuncia intereseaz prima diviziune de clivare a unui zigot normal, va rezulta un produs de concepie care prezint dou linii celulare anormale: una monosomic i una trisomic pentru cromozomul n cauz . Dac non-disjuncia intereseaz a doua diviziune de clivare a zigotului va rezulta un blastocist mixoploid alctuit din trei linii celulare: una normal (disomic), una trisomic i una monosomic b) Retardarea anafazic are drept rezultat apariia unor clone celulare cu 2n-1/2n cromozomi. 48. Consecinele fenotipice ale anomaliilor cromozomiale

n funcie de consecinele fenotipice, anomaliile cromozomiale se mpart n: anomalii echilibrate, n care cantitatea de material genetic rmne nemodificat i fenotipul este normal; anomalii neechilibrate, n care cantitatea de material genetic se modific (n plus sau minus) i fenotipul este anormal; 1) Consecinele anomaliilor cromozomiale echilibrate Anomaliile echilibrate (translocaii reciproce, inversii) determin, n general, un fenotip normal, dar au consecine asupra reproducerii: - datorit prezenei anomaliei structurale, sinapsa ntre cromozomii omologi este anormal i produce blocarea gametogenezei; - producerea de gamei anormali care, dup fecundare, formeaz embrioni cu monosomii sau trisomii pariale (uneori complete), care de multe ori sunt eliminai prin avort spontan (circa 1 din 250 de persoane aparent sntoase are o anomalie cromozomial echilibrat care poate da tulburri majore de reproducere). 2) Consecinele anomaliilor cromozomiale neechilibrate Anomaliile neechilibrate (poliploidii, aneuploidii, deleii, duplicaii, cromozomi inelari, izocromozomi) sunt modificri cantitative ale materialului genetic (anomalii de dozaj genic); ntruct informaia genetic din cromozomii anormali nu este modificat calitativ, fenotipul anormal este consecina excesului sau lipsei unei gene normale. Anomaliile de dozaj genic se caracterizeaz printr-o serie de modificri comune: tulburri de cretere pre- i postnatal, dismorfie facial, anomalii congenitale majore multiple, alterri ale structurii i funciei sistemului nervos central (manifestate prin ntrzieri n dezvoltarea psiho-motorie), modificri ale dermatoglifelor, anomalii ale funciei gonadelor. Factorii care influeneaz gravitatea afectrii fenotipice sunt: (a) Mrimea dezechilibrului genetic. Poliploidiile, trisomiile cromozomilor mari i monosomiile autozomale sunt incompatibile cu viaa; cu ct dimensiunea cromozomului este mai mare, cu att gravitatea trisomiilor autozomale este mai mare (tri 13 > tri 18 > tri 21). (b) Tipul de anomalie. Monosomiile sunt mai grave dect trisomiile i sunt letale pentru toi autozomii, dar i a majoritii cromozomilor X. Aneuploidiile cromozomilor sexuali sunt mai puin grave dect cele ale autozomilor, datorit inactivrii pariale a cromozomilor X suplimentari.

(c) Coninutul genic i cantitatea de eucromatin/heterocromatin a cromozomului implicat. Anomaliile care intereseaz regiunile eucromatice sunt mai grave dect cele care intereseaz regiunile bogate n heterocromatin. (d) Numrul celulelor afectate. Aneuploidiile omogene sunt mai grave dect cele n mozaic.