1.

tehnologii
Definiiaaparintoare
Ingineriei genetice,
tehnicile
i
acestui domeniu
Gregor Mendel 1866

Griffith 1923

Avery Osvald & Colin McLeod & MacLyn

McCarty 1944

25 aprilie 1953 - descoperirea structurii dublu helix a

ADN Watson, Crick si Willkins

F. Crick - 1958 - dogma centrala a biologiei

Kornberg ADN polimeraza

Ochoa S. Nirenberg W. i Khorana G. 1961 1967

codul genetic i corespondena codon-AA
Howard Temin i S. Mizutani (1970)- infirma
dogma centrala prin descifrarea reverstranscripiei cu
reverstranscriptaza

A. In 1923 frederick Griffith n experienele de

transformare genetic efectuate la oareci

descopera ca tulpinile nevirulente ale bacteriei

Streptococcus pneumonie devin virulente daca
sunt injectate la oareci mpreuna cu tulpinile
virulente, omorte iniial princaldura.
B. Natura materialului care a conferit
virulena bacteriilor nepatogene nu a fost
cunoscuta de catre Griffith.

Watson & Crick 1950-1953

Structura ADN?
Modelul atomic (difractie
cu raze X/ Willkins &
Franklin) arata doua
catene infasurate in jurul
unui ax imaginar=
dublu helix).

Watson and Crick

Cargaff : masuratori cantitative ale compozitiei
ADN la dif sp.
-

(1) %A = %T i %G = %C

(2) Raportul-purine (A,G): pirimidine(T,C)=1:1

(3) A+T/C+G 1

Molecula de ADN este formata din 2 catene, in care

legaturile intre bazele azotate se stabilesc intotdeauna
intre A si T si intre C si G (complementaritate)

PREMISELE APARI]IEI
Ingineriei genetice catiina
Enzime de restrictie
Tehnica PCR
Tehnicile de hibridare moleculara
Tehnicile de secventiere

1. Descoperirea enzimelor de restricie

2 Multiplicarea unei gene prin PCR reacia

n lan a polimerazei (Karry Mullis
3 Tehnicile de hibridare ale acizilor nucleici

4 Secvenierea ADN(Sanger)
Ingineria genetic este definita ca ansamblul de
metode i tehnologii efectuate in vitro cu gene,
cromozomi sau celule ntregi, n scopul construirii
unei structuri genetice cu proprieti ereditare
premeditate. (L. Popa i Rodica Repanovici)

Condiiile ce trebuie ndeplinite pentru pentru caorice

metoda sau tehnica sa poata fi inclusa n
domeniul ingineriei genetice:

S conduc la apariia unor forme

complet noi de via cu proprietai genetice i
funcionale premeditate;
(2) Combinaiile genetice noi sa fie realizate n
laborator (in vitro) i n afara actului natural al
reproducerii;

(3) Sa se porneasca de la una sau cteva celule

(molecule) noi care apoi s poat fi izolate i
clonate.

Tehnici i tehnologii
apartinatoare IG

I.
binarea in vitro a materialuluigenetic peste barierele de
prin

1. tehnologia ADN recombinat

2. Hibridarea i cibridarea celular
(3)Mutageneza in vitro
partin IG tehnicile sau tehnologiile care nu utilizeaz ADN

mbinat
- fertilizarea invitro;

- procese naturale cum sunt: conjugarea,

transducia, infecia virala, transformarea;

- inducerea poliploidiei;
- transferul de embrioni;
regenerarea unei plante ntregi pornind de la o celula
difereniata sau dintr-un esut nedifereniat (calus) etc.

Genomul definiie, organizarea genomului nuclear la eucariote.

Organizarea secvenelor de ADN n
genom - clase de secvene ADN. Expresia genelor eucariote
(transcripia i translaia informaiei

genetice). Organizarea genomului extranuclear (mitocondrial ) la

eucariote

molecular/GENOMUL
Genomul este totalitatea materialului
genetic al unei celule
Este repartizat n doua compartimente:
La eucariote - nucleu genomul nuclear

La procariote nucleoid genom nucleoidal n

citoplasma genomul extranuclear (la celulele
animale / mitocondriile, la plante
mitocondriile i plastidele;sau extranucleoidal
la bacterii - plasmidele )

Genomul nuclear eucariot

Genomul nuclear eucariot - totalitatea

cromozomilor din nucleu (2n sau n).
La eucariote cromozomii au structura liniara
Fiecare cromozom este format dintr-o
singura molecula de ADNd.c, de lungime
enorma.
ADN-ul de la eucariote este asociat cu

proteine histonice.

ADN mpreuna cu proteinele histonice i

nonhistonice alaturi de molecule de ARN, ioni
de Ca i Mg compun substana fundamentala a
cromozomilor cromatina.

Modelul mpachetarii cromatinei din

cromozomi i implicit a ADN-ul, are loc n
mai multe stadii (fibra de ADN,
nucleozomul, solenoidul i cromatida) i
duce n final la obinerea unei formaiuni
compacte cromozomul bicromatdic, cu
diametrul de 1400 nm.

Fibra de ADN 2nm Nucleozomul 11nm

Solenoidul 30 nm Cromatida 700 nm
Cromozomul bicromatidic 1400 nm

Organizarea secvenelorde
ADN n genom

Genomul eucariot este complex dei cea mai mare

parte din ADN nu este reprezentata de gene
structurale.
Dup frecvena de apariie a secvenelor n

genom acestea sunt grupate n 3 categorii:

1. Secvene unice;
2. secvene repetate :

2.1 secvene mediu repetate

2.2 secvene nalt repetate

1. - SECVEN]ELE UNICE

1. - SECVENELE UNICE o copie, doua

sau cteva copii/genom
Secvenele unice genele structurale

reprezinta o proporie redusa din genom , n

total 28% din care doar 2% se traduce n
proteine (exonii genelor)

Secvenele care codific proteinele

(secvenele unicesau gene structurale)
Gena structurala segment din ADN
care codifica un produs funcional:
proteina, enzima sau hormon

Genele structurale la eucariote

sunt formate din exoni (fragmnete

informaionale) i introni (fragmente
noninformaionale)

Expresia genelor eucariote:

Transcripia la eucariote
n nucleu : ARN polimeraza II
n etape: ARNm precursor - ARNm intermediar i

ARNm matur
1) se prelucreaza capetele ARNm (7 metilguanozina la
capatul 5 i cozile poli-A la capatul 3)
2) intronii se elimina din mesajul genetic i
se asambelaza exonii ARNm matur care trece n
citoplasma, la ribozomisinteza proteinelor

Translatia eucariot

participa ARNm, ARNr, ARNt i enzima ARNt

sintetaza
Are loc n citoplsma la ribozomi ,duce la
sinteza unei protein

Reprezentarea secvenelor unicesi

repetate la nivel de genom

Secventele unice si exomul celulei

Exomul celulei este format din secvenele
structurale care se transcriu i se traduc,
Reprezinta doar 2% din genom
Intronii din gene se transcriu dar nu se
traduc. Sunt eliminai din mesajul genetic i

reprezinta 26% din genom

O proporie foarte mare din genese

transcriu n ARN funcional, necodant, dar nu
s
unt translatate n proteine. Acestea
formeaza 4/5 din transcriptomul celulei
Transcriptomul este format din totalitatea
transcriptelor (speciilor de ARN) produse
ntr-o celula. Speciile de ARN necodant,
sunt specii de ARN finale cu funcii clasice
n sinteza de proteine (ARNr, ARNt .a.), la
care se adaugaspeciile mici : ARNmi,
ARNsi, i altele mai lungi care au funcii
reglatoare importante: ARNsn, ARNsno

Reprezentarea altor clase de

secvene la nivel de genom
Exomul 2%
Intronii din gen reprezinta o proporie semnificativa din
genom 26%.
Pseudogenele - 12%, sunt gene nefuncionale ca urmare a
acumularii unor mutaii
Secvenele repetate: de tip microsatelit, minisatelit
3%, i secvenele slab repetate (Segmental duplication or lowcopy repeats) 5%
Secvene distribuite prin genom (transpozonii) sunt
grupate n doua clase: transpozonii ADN (3%) i
retrotranspozonii (ARN) din care fac parte secvenele LTR
- Long Terminal Repeats (8%), secvenele SINE: Short
Interspersed Elementes (13%) i secvenele LINE: Long
Interspressed Elements (20%).
Secvenele implicate n reglarea structural la nivel

heterocromatic reprezinta o proporie de 8% din genomul

nuclear.

Organizarea genomului
extranuclear la eucariote

genomul extranuclear (n celulele animale

este reprezentat de ADN mitocondrial
Mitocondria se transmite pe linie materna

ADN mitocondrial este dublu catenar i circular (16kb),

alcatuit dintr-o catena grea (H) bogata n G i o catena
uoara (L) bogata n C.

Are doua regiuni: o regiune codant (37 de gene)

o regiune necodant, denumita i regiune de
control (~1000 pb).
Catena grea codific
-12 polipeptide enzimatice,
-2 molecule
de ARNri
-14 molecule de ARNt.
Catena uoar codific
-un singur polipeptid enzimatic
i 8 molecule de ARNt.

Regiunea de control prezinta o serie de

variaii structurale ntre indivizi,
denumite polimorfisme ADNmt, care
sunt utile n procedeele de identificare
de persoane (amprente genetice)
Regiunea codanta: codifica proteinele
care participa la fosforilarea oxidativa,
deine genele pentru sinteza propriilor
specii de ARNr i ARNt.

Prezinta 2 origini ale replicari care pornesc din puncte

diferite pe cele doua catene i n direcii diferite
La nivelul mitocondriei n codul genetic exista excepii faa
de cel nuclear, astfel codonii START pot fi AUA, AUC i AUU
i nu doar AUG (Met).
La mitocondrii codonul UGA nu este codon stop,
acesta n schimb codifica triptofanul.
Codonii AGA i AGG sunt codoni STOP
Metionina este codificata de doi codoni la nivel de
mitocondrii: AUG i AUA
Genele mitocondriei au structura continua,
asemanatoare genelor procariote, fiind lipsite
aproape n totalitate de introni

Variaiile genomului: Polimorfismele SNP (Single Nucleotide

Polymorphisms) RFLP(Restriction
Fragment length Polymorphism), VNTR (Variable Number in Tandem
Repeats) i STR (Short Tandem repeats). Ce este un polimorfism ADN?
n ce constau polimorfismele SNP, RFLP; VNTR i STR? Care sunt
tehnicile prin care pot fi evideniate acestea ?

Variaiile genomului
Polimorfisme la nivel ADN

Polimorfism- variaie la nivel ADN care determina

existena a 2 sau mai multe alele.

Tipuri de polimorfisme ADN:

1. SNP
2. RFLP
3. VNTR
4. STR

Detectarea lor este importanta n

- selecia asistata de markeri
- amprente genetice
- sexarea embrionilor
-trasabilitatea animalelor, produselor si
subproduselor acestora
- detectarea unor boli

Polimorfismele genomului pot fi

evidentiate prin tehnicilele moleculare:
a)PCR
b) hibridare
c) secventiere

Polimorfisme de tip SNP (Single Nucleotide

Polymorphism/Snips) constau n modificarea
(nlocuirea) unei singure nucleotide din AND
Sunt foarte numeroase n genom (n medie la fiecare 1000 pb/106 n
genomul animal
Sunt cartate n tot genomul uman dbSNP/NCBI i la unele animale (taurine
Apar n regiunile genice (exoni
sau introni) dar i intergenice

SNP - markeri biologici evidenierea lor n tot genomul prin

tehnica microarray (predicii n dezvoltarea unor boli, raspunsul la
toxine, medicamente etc.
- la taurine / determinarea valorii de ameliorare

Unele SNP sunt recunoscute de enzime de restricie

deoarece apar n interiorul situsurilor enzimelor;
acestea pot fi evideniate cu tehnica PCR/RFLP
Alte SNP nu apar n situsul ER/secveniere

Detectarea tuturor polimorfismelor SNP din genom - cu ajutorul

tehnicilor de hibridare (tehnica microarray)

Polimorfismele RFLP (rif=lips

RFLP - Polimorfism n interiorul ADN care

este recunoscut de catre o enzima de
restricie

Daca n situsul enzimei apare o mutaie

(substituie, deleie, inserie, duplicaie)
enzima nu-i recunoate situsul i nu mai
taie rezulta fragmente de dimensiuni
diferite (genotipurile indivizilor)
Variaiile n lungime polimorfisme sau
markeri RFLP

Polimorfismele RFLP

Pot fi identificate prin reacia PCR-RFLP

Prin tehnici de hibridare (restricie
i transfer pe membrane- Southern
blotting)

Polimorfismele VNTR\minisateliti

Variable Number in Tandem Repeats secvene nalt repetate i

tandemizate cu monomerul format din 20-50 pb, repetate n
tanedm
Noninformaionale, nu se
transcriu/traduc
Polimorfismele VNTR sunt date de numarul repetiiilor existent la nivel
alelic
Polimorfismul este ridicat-(multe alele/locus)
Utile n ntocmirea amprentelor genetice

Sunt identificate mai ales prin tehnici de hibridare datorita lungimii mari a
alelelor

Polimorfismele STR
(microsateliii)

STR Short Tandem Repeats / secvene

simple nalt repetate i tandemizate, cu
monomerul format din (1-6pb)n.
Noninformaionale (nu se transcriu/traduc)
Polimorfismul dat de numarul repetiiilor n
tandem la nivel alelic
Polimorfism mult mai ridicat dect VNTR

Utilizare/ amprente genetice n scop de

identificare, studii filogenetice etc

Profilul electroforetic al
polimorfismelor STR

limorfismele STR- identificate prin tehnicil PCR cu primeri specifici construii

din vecinatat locilor STR

INSTRUMENTEMOLECULAREDESTUDIUICERCETARE
4. Instrumentele moleculare Enzimele de restricie: definiie, clasificare, utilizri

1. Enzmele de restricie

Enzimele de restricie fac parte dincategoria

nucleazelor, enzime care produc digestia catenei de ADN prin

ruperea legaturilor fosfodiester dintre nucleotide.

Se mpart n doua categorii: exonucleaze i

endonucleaze
Dintre endonucleaze fac parte enzimele de restricie
Au fost izolate de la bacterii si pot fi caracterizate
dupa:

- Denumire
- Modalitate de actiune
- Frecventa de aparitie a situsului de recunoastere

Denumirea enzimelor de
restricie
ovine de la numele bacteriei de la care au fost
izolate
Expl- EcoRI
Prima litera defineste genul (E=Escherichia)
Urmatoarele doua specia (cocoli)
Urmeaza uneori o litera care indica plasmida de
pe care a fost inzolata gena care codifica
enzima (Rplasmide ce conin gene de
rezistena la antibiotice)
Mai apar si cifre romane I,II, III care indica

modul de aciune

DUpa modalitatea de actiune

enzimele recunosc anumite situsuri de

restricie (secvene de nucleotide) unde
produc taieturi dupa o schema prestabilita.
A) taie drept formeaza capete drepte
sau boante
B) taie decalat formeaza capete adezive
sau coezive

Frecvena de apariie a

situsului de recunoatere

Enzimele recunosc situsuri (secvene) de

restricie formate din 4 6 pb i taie doar
n acel loc
Enzimele care taie n situs de 4pb taie
des iar cele care taie n situs de 6pb taie
rar

Utilizari

1) n tehnicile PCR-(PCR-RFLP) sunt utilizate la digestia

(restricia) ADN sau a produsuluiPCR

2) n tehnologia ADN recombinat sunt

utilizate la izolarea genei pasager i la
deschiderea vectorului
3) n secvenierea genomului- genomul este mai
nti fragmentat cu ajutorul ER, apoi clonat n
bacterii (librariile de gene) i apoi secveniat
4) n tehnica RFLP prin digestie, hibridare i
transfer pe membrane (Southern Blotting)

Instrumentele moleculare Tehnica PCR : definiia, principiul tehnicii, amestecul de reacie,

i polimeraza termostabil utilizat n PCR. Vizualizarea produilor PCR prin
electroforez n gel de agaroz

1980, Kary Mullis laureat cu premiul Nobel Cum

putem multiplica un fragment de ADN ?
1. Prin tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction) se
poate multiplica un fragment de ADN (gena) ntr-un
numar mare de copii n doar cteva ore, fara sa
apelam la clonare.
2. Clonarea ADN prin intermediul unui vector, de
exemplu o plasmida bacteriana, care transferata
ntr-o gazda de tipul Escherichia coli, permite
exprimarea i multiplicarea fragmentului n
descendena.

Principiul tehnicii PCR

Are la baza modelul de replicare a ADN in vitro, n
care ADN-ul este denaturat i enzima ADN
polimeraza sintetizeaza 2 copii complementare cu
cele doua matrie deADN.
Diferene:

Denaturarea ADN se produce termic, prin

ncalzirea
soluiei la o temperatura apropiata defierbere
n tehnica PCR amplificarea este catalizata de
o ADN polimeraza termostabila

Etape
Denaturare-ADN polimeraza utilizeaza drept matria o
singura catena de ADN. Aceasta catena se obine prin
ncalzirea ADN la o temperatura apropiata de fierbere, cnd
are loc ruperea punilor de H dintre cele doua catene
complementare, proces denumit denaturarea ADN (1).
ALINIEREA PRIMERILOR
ADN polimeraza i ncepe activitatea dupa o secvena
oligonucleotidica scurta denumita primer care definete
capetele fragmentului ce urmeaza sa fie amplificat. Alinierea
primerului (2) cu direcia 5-3 se face pe baza de
complementaritate, la capetele 3 ale matriei. Primerii
definesc capetele fragmentului ce va fi amplificat.

ELONGA]IA

Enzima ADN polimeraza (Taq polimeraza)

alungete catena noua prin adaugarea pe baza de
complementaritate a nucleotidelor existente n
tubul de reacie etapa denumita elongare(3).
Amplificarea este aproximativ exponeniala
rezultnd dupa treicicluri doua copii; dupa 10 cicluri
256 copii; dupa 20 de cicluri 262.144 copii; dupa 32
cicluri 1,73 miliarde copii etc.
Alegerea primerilor
Se face n funcie de cunotineele anterioare pe care le avem
despre secvena fragmentului ADN ce urmeaz s fie
amplificate. Din acest punct de vedere avem dou categorii de
primeri
Primerii specifici de locus
Primerii specifici de locus sunt alctuii din 10-25 nucleotide
i sunt complementari capetelor unei secvene specifice
(gene) cu structur cunoscut.

Primerii arbitrari
Sunt alctuii de obicei din 6-10 nucleotide mperecheate la
ntmplare. Coninutul lor n G - C trebuie s fie de cel puin
40%. Cei cu coninut mai mic de 40% n G i C nu produc
amplificarea (datorit legturilor de H mai slabe i care se rup
la 72-740C, temperatur la care are loc polimerizarea).

AMESTECUL PCR
Orice amestec PCRconine:
(1)- ADN-ul matria: o cantitate foarte mica este suficienta pentru ca
reacia de polimerizare sa aiba loc (ng)
(2)- primerii (sens i antisens), cu direcia 5-3 i de secvena
complementara capetelor de ADN ce urmeaza sa fie amplificata
(3)- cele 4 tipuri de nucleotide (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)- ele sunt
adaugate de polimeraza pe baza de complementaritate cu matria la
lanul ncretere
(4)- enzima ADN polimeraza termostabila, enzima cu funcie polimerazica
prin care adauga nucleotidele la lanul n cretere imediat dupa primer.
Enzima din reacia PCR este termostabila (rezista la temperatura de

denaturare a ADN). Aceste proprietai sunt ndeplinite de Taq polimeraza

(ADN polimeraza extrasa de la bacteria termofila Thermus aquaticus)
(5)- tamponul enzimei Taq polimeraza (pe baza de Tris-HCl i KCl)
(6)- clorura de magneziu (pentru funcionarea optima a enzimei)

ADN polimeraza din reacia PCR

ADN polimeraza este o enzima care catalizeaza

biosinteza unei catene de ADN, pe baza

complementaritaii cu o matria ADN.
Acioneaza numai dupa o secvena
oligonucleotidica scurta, denumita primer

In vivo are ADN polimeraza realizeaza replicarea

ADN n faza S a interfazei

In vitro ADN polimeraza este una speciala,

termostabila i ndeplinete aceeai funcie de

polimerizare pe care o ndeplinete ADN
polimeraza in vivo

ADN polimerazele termostabile sunt utilizate

n cercetare. Ele sunt extrase de la bacterii
ermofile, deoarece rezista la temeperatura
de denaturare a ADN (90-95oC).
ADN polimerazele pot prezenta 3activitai:
a) polimerazica 5-3 prin care catalizeaza
biosinteza ADN
c) exonucleazica 3-5 prin care corecteaza
greelile de mperechere din timpul sintezei
c) exonucleazica 5-3 prin care ndeparteaza
nucleotide n direcia sintezei (pe cele din
primerul ribonucleotidic). Aceasta activitate
nu este necesara la PCR deoarece enzima nu

trebuie sa ndeparteze primeri.

n reacia PCR se utilizeaza Taq polimeraza (ADN

polimeraza) extrasa de la bacteria termofila

Thermus aquaticus

Enzima are fidelitate de replicare mai redusa i

introduce greit nucleotide, n medie una la fiecare
milion de nucleotide adaugate corect, pe care nsa
nu poate sa le corecteze deoarece este lipsita de
activitatea exonucleazica 3-5
ADN polimeraza Pfu extrasa de la bacteria

Pyrococcus furiosus are fidelitate superioara de

replicare faa de Taq polimeraza deoarece prezinta
activitate exonucleazica 3-5. Este utilizata mai ales

n reaciile de secveniere unde fidelitatea replicarii

trebuie sa fie foarte exacta pentru ca descifrarea
secvenei sa fiecorecta.

ELECTROFOREZA

Denumirea de electroforeza a luat natere prin asocierea a

doua cuvinte din greaca veche: electron - chihlimbar i
phoresis - deplasare
Este utilizata ca metoda de separare a fragmentelor de
ADN sau a proteinelor
Clasificarea metodelor electroforetice:
n mediu liber, metoda care se bazeaza pe migrarea
speciilor ionice ntr-o soluie tampon;
n mediu suport (stabilizant). Mediile suport pot fi relativ
inerte: cum este hrtia de filtru, acetatul de celuloza,
silicagel, alumina, celuloza microcristalina etc., sau care
participa activ la separare interacionnd cu particulele
care migreaza: gelurile de agaroz, geluri de amidon
i geluri de poliacrilamid.

Electroforeza fragmentelor de ADN n gel

de agaroz

Gelurile sunt medii poroase n care porii au

dimensiuni apropiate cu ale particulelor supuse
separarii, caracterizndu-se prin efectul de sit
molecular.
Electroforeza n gel de agaroza este o metoda simpla,
rapida i sensibila pentru separarea, identificarea i
purificarea fragmentelor de ADN. n soluie tampon,
ADN are sarcina electrica negativa i se va ndrepta
spre anod.
Prin colorare, ADN-ul sau produii PCR pot fi
vizualizai n lumina UV, n urma electroforezei.
Agaroza este un polizaharid extras din algele roii
(Rhodophyta)
Gelurile de agaroza, dei au o putere de rezoluie mai
mica dect cele de poliacrilamida, au o gama de
separare mult mai larga, ele fiind utilizate pentru
separarea fragmentelor mari de ADN de la 200 pb

pna la aproximativ 50 kb n funcie de concentraia

Mobilitatea electroforetica a ADN n geluri

de agaroza depinde de :
- masa molecular a ADN. Aceasta se exprima n
daltoni sau perechi de baze, unde 1 pb=660 dal;

- conformaia ADN care explica mobilitaile diferite la

mase moleculare egale. Moleculele de ADN pot avea 3
conformaii: circulara nchisa, circulara deschisa - nick
(crestarea unei catene a ADN), sau liniara.

Mobilitatea celor trei tipuri conformaionale depinde de condiiile

de lucru:
- concentratia agarozei - la concentraii mari fragmentele au
mobilitate electroforetica mai scazuta;

- soluia tampon marea majoritate a soluiilor tampon sunt pe

baza de Tris i un pH ntre 7,5-7,8;(TAE, TPE i TBE care ofera
o rezoluie mai buna)
- cmpul electric aplicat nu trebuie sa depaeasca 5V/cm pentru
a obine o separare cu rezoluie foarte buna;

Variantele amplificrii prin reacia PCR Tehnica PCR-RFLP - (Restriction

Fragment Length Polymorphism) pentru studierea polimorfismelor la nivelul
situsurilor de restricie: principiul tehnicii, etape, tipuri de primeri, avantajedezavantaje, aplicabilitate

TEHNICA PCR-RFLP - (Restriction

Principul tehnicilor RFLP se bazeaza pe

evidenierea polimorfismelor existente n ADN
la nivelul situsurilor enzimelor de restricie.
Aceste variaii sunt cauzate de mutaii punctiforme
(substituia unei nucleotide cu alta), inserii, sau
deleii care apar n interiorul situsului de restricie.
n acest fel, enzima de restricie nu mai recunoate
situsul respectiv i nu mai taie, rezultnd un
polimorfism de lungime.

Evidenierea polimorfismelor RFLP se

poate face prin doua strategii:
A) Prin reacia PCR-RFLP
B) prin hibridarea fragmentelor digerate
prin restricie enzimatica, cu sonde
moleculare marcate radioactiv i
transfer pe membrane (tehnica
Southern blotting)

Tehnica PCR RFLP presupune

izolarea ADN de la fiecare individ, purificarea

i cuantificarea
1. amplificarea prin PCR a genei cu ajutorul
primerilor specifici de locus
2. Digestia (restrictia) enzimatica
3. Electroforeza fragmentelor n gel de
agaroza pentru evidenierea genotipurilor
(polimorfismele RFLP)

Fragmentele ADN obinute n urma restriciei se

vor separa n gelul de electroforeza sub forma

unor benzi situate n diferite regiuni care

corespund unui genotip
Aprecierea marimii fragmentelor se face prin
comparare cu un marker de GM cunoscuta
urmata de citirea i interpretarea rezultatelor
astfel:
- cu ajutorul RFLP se vor identifica variaiile
genetice dintre indivizi la nivelul
situsurilor enzimelor de restricie,
respectiv genotipurile existente la locusul de
interes (AA, Aa, aa).

Tehnica genereaza markeri

codominani, specifici de locus care pot
fi urmarii n descendena.

Aplicaii=n practica de ameliorare a

animalelor pentru evidenierea
polimorfismelor de la loci de interes
economic

- nsuirile produciei de lapte (k-cazeina, Blactoglobulina, Pit1)

- nsuirile produciei de carne (leptina,

tiroglobulina, calpastatina etc)

- nsuiri de reproducie,
- rezistenta la boli etc.
2. n medicina umana i veterinara pentru
evidenierea polimorfismelor unor loci asociai cu
diferite maladii, detectarea falsurilor in produse
alimentare
3. n practica de ameliorare a plantelor

i tehnica PCR asimetric

(Asymetric PCR) pentru generarea populaiilor unei singure
catene: principiul tehnicilor, etape, aplicaii
Este o variant a tehnicii PCR n care amplificarea pornete de la
cteva molecule de ARNm.
n prezena enzimei revers transcriptaza, molecula de ARNm
devine matri pentru sinteza ADNc (complementar), dup
care procesul de amplificare decurge n mod normal
Tehnica RT

PCR (Reverse Transcription-PCR)

Principiul tehnicii

Este o tehnic de determinare semicantitativ, spre

deosebire de tehnica Real Time PCR (RT-qPCR) care
msoar exact i n timp real expresia a unei gene
Principiul tehnicii- sinteza unei gene are loc pornind de la
transcriptul ARNm
Reacia se face n paralel cu a unei gene menajere
(housekeeping gene) cum este -actina care are un nivel

constant de expresie la fiecare individ.

in compararea raportului dintre expresiile celor dou gene putem
aprecia ct protein a fost sintetizat n organism la un moment
dat.
APLICATII

Cuantificarea expresiei genice se bazeaz pe

presupunerea c in vivo se pstreaz o anumit

proporionalitate ntre cantitatea de ARNm i cantitatea
de produs codificat de gen.
Aprecierea cantitii de ARNm sintetizat este util atunci
cnd se dorete s se msoare cantitatea de proteine,
enzime sau hormoni, sintetizat n funcie de anumite de
mediu (Ex. Hranire) sau de metabolism
De expl. Studierea expresiei genei obezitii (ce codific
leptina) la animale aduce informaii valoroase legate de
depozitele de grsime

PCR ASIMETRIC (Asymetric PCR)

Prin aceast metod PCR se genereaz ADN

monocatenar n numeroase copii. Primerii se includ n

reacie ntr-un raport de 50:1 i respectiv 100:1, practic un
primer la o concentraie normal, iar cellalt diluat. Ceilali
componeni utilizai sunt n concentraii similare ca ntr-o
amplificare normal. n primele 15-25 de cicluri, marea
majoritate a produsului de amplificare este dublucatenar,
dup care primerul aflat n concentraie redus se
epuizeaz. Datorit primerului rmas singur se genereaz
multiple copii ale unei singure catene (catena
complementar celei la care se ataeaz primerul aflat n
concentraie normal).

APLICATII
Prin aceasta tehnic se genereaz ADN

monocatenar utilizat n reaciile de secveniere

sau pentru clonarea de gene in stare
monocatenara (vectorul M13)
Secvenierea presupune descifrarea structurii
nucleotidice a unei gene.

e realizezaz pe fiecare caten n parte (sens i

antisens)

hnica PCR invers (Inverse PCR) i PCR ancorat (Anchored PCR)

principiul tehnicilor

PCR INVERS (Inverse PCR- iPCR)

Se aplic pentru amplificarea unei secvene necunoscute

(A) care flancheaz o secven cunoscut (B).

Etape:
A) Digestia ADN cu o enzim de restricie (A), aleas astfel nct
s taie n afara secvenei cunoscute B, pentru producerea de
capete adezive.
B) Fragmentul obinut n urma restriciei se circularizeaz cu
ADN ligaza.
C) Fragmentul circular se taie cu o enzim care taie n interiorul
secvenei cunoscute B pentru obinerea unei molecule liniare cu
capete cunoscute.
fragmentul liniarizat se amplific prin PCR cu primeri construii de la nivelul
capetelor secvenei cunoscute

PCR ANCORAT (Anchored PCR)

n cazul acestei tehnici este suficient cunoaterea

unui singur capt al secvenei de ADN pe care dorim

s o amplificm.
La cellalt capt se ataeaz o secven de
cteva nucleotide ce conin guanina (poli -G).

 La fragmentul poli-G se va ataa n ciclul urmtor, n

urma denaturrii, primerul ancorat (PA) format dintr-o

secven scurt ce conine mai multe citozine (poli-C).
La cellalt capt, cu secvena cunoscut, se va ataa
primerul specific PX

Aplicaiile tehnicii PCR n generarea markerilor cu

importan n selecia i ameliorarea animalelorCe sunt
markerii moleculari? La ce sunt utilizati? Ce tipuri de
polimorfsme ADN pot fi markerigenetici? Care
polimorfisme ntrunesc condiiile markerilor ideali?
Cum sunt utilizai n selecia asistatla nivel molecular
(MAS)? Ce avantaje prezint vis a vis de tehnicile clasice
de selecie?

Aplicatiile

tehnici PCR

Selecia asistat de markeri

genetici(marker Assisted Selection- MAS) n

populaiile de animale
Filogenie, taxonomie
Medicin si
Sexarea embrionilor
Amprentele genetice n scop de identificare
Cercetarea fundamental

1. SelecUia asistat de markeri genetici

n populaUiile de animale
nsuirile care fac obiectul seleciei i ameliorrii sunt

codificate la nivel ADN

Variaiile existente la nivel ADN (polimorfismele) pot fi

utilizate n selecia asistat de markeri genetici dac

ntre acestea au fost stabilite asocieri cu diferite
nsuiri ale produciilor, rezistena la boli i duntori,
etc.
Prin reacia PCR are loc dezvoltarea de noi markeri
genetici i genotipizarea indivizilor n vederea
seleciei i ameliorrii populaiilor de animale pentru
un ctig genetic rapid i precis

Filogenie, taxonomie
Taxonomia clasic, realizat pe baza nsuirilor

morfologice sau a celor biochimice i fiziologice, a

fost reconsiderat n unele cazuri pornind de la
informaia din ADN, n special cea a ADN
mitocondrial (D-loop).
Filogenia gradul de nrudire dintre speciile actuale
sau dintre cele actuale i cele disprute poate fi
determinat pe baza informaiei din ADN, prin
alinierea i compararea secvenelor de ADN n
bazele genetice de date (NCBI- instrumentul
BLAST).

 Amplificarea prin PCR a unor secvene ADN

parial degradate ce proveneau din probe

strvechi (oase, frunze, polen) i compararea
acestora cu secvene omoloage de la
organisme vii a revoluionat studiile de
evoluionism permind confirmarea teoriilor
privind gradul de nrudire dintre speciile
actuale i cele disprute

2. AplicaUii n medicin i n Sexarea

embrionilor animali
n medicin s-a reuit producerea de teste PCR

pentru identificarea n doar cteva ore a unor maladii

infecioase (tuberculoza, boli virale, etc.) sau a unora
genetice (hemofilia). De asmenea tehnica PCR s-a
dovedit util i pentru diagnosticarea maladiilor
ereditare n stadiu de embrion, determinarea sexului
n faz de embrion etc.
Sexarea embrionilor animali este util pentru
obinerea de produi de un singur sex, pentru
creterea randamentului de exploatare a fermei (se
pot obine doar produi masculi pentru producie de
carne sau doar produi femeli pentru reproducie i
pentru nsuirile limitate de sex (lapte, ou, icre etc)

3. Amprentele genetice n scop de

identificare
Criminalistica i justiia beneficiaz astzi de

amprentele genetice n scopul identificrii

persoanelor care au svrit fapte penale dar
i pentru determinarea paternitii, amprente
care au la baz reacia n lan a polimerazei
Pentru amprentare se utilizeaz loci foarte
polimorfi din genom astfel nct amprenta s
aib o probabilitate extrem de ridicat de
discriminare ntre indivizi. Astfel de loci sunt
microsateliii.

4. Cercetarea fundamental
Cercetarea fundamental - prin tehnica PCR

a facilitat studierea funciilor genelor,

secvenierea ADN, sau determinarea
efectului funcional mutagenic.

1. APLICATIILE TEHNICII PCR N GENERAREA

MARKERILOR MOLECULARI CU IMPORTANT N
AMELIORAREA ANIMALELOR
Genotipizarea animalelor la loci asociai cu nsuirile

produciilor:
nsuiri privind calitatea produciilor:

-cantitatea de grsime i protein din lapte

-cantitatea de grsime din fibra muscular i din
carcas
nsuiri privind cantitatea produciilor
-

Cantitatea produciei lactate

Cantitatea de carne din carcas
Greutatea i nsuirile de conformaie
nsuiri privind rezistenUa la boli

- nsuiri de reproducie - fecunditate, fertilitate

Caracterele cantitative
nsuirile cantitative sunt rezultatul interaciunii dintre

mii de gene minore i cteva gene majore, ce

controleaz creterea i dezvoltarea, sinteza de
hormoni, funcia reproductiv, depozitele de grsime,
etc. Dintre aceste unele gene sunt responsabile de
codificarea unor:
- hormoni
- receptori ai hormonilor
- factori de cretere
- alte proteine
fiind considerate gene candidat n MAS (Marker
Assisted Selection) .

Ce

sunt markerii moleculari

Markerii moleculari sunt fragmente de ADN,

de regul noninformaionale (regiuni

hipervariabile de ADN sau introni), uneori
chiar informaionale (gene funcionale) ntre
care s-au stabilit asocieri cu nsuiri ale
produciilor, rezistena la boli i duntori n
scopul utilizrii lor n selecia asistat de
markeri genetici (MAS) sau care pot fi utilizai
pentru ntocmirea unei amprente genetice n
scop de identificare.

La ce sunt utilizaUi?
Pot fi utilizai n selecia asistat de markeri

moleculari (MAS)
n programele de ameliorare a animalelor
La cartarea locilor caracterelor cantitative QTL
(Quantitative Trait Loci),
La determinarea structurii genetice a unei
populaii
n stabilirea diversitii genetice
La diagnosticarea diferitelor maladii genetice
Cu ajutorul lor este posibil identificarea i
stabilirea trasabilitii unui produs de origine
animal (expl. carne)

Genele pe cromozomi i strile

homozigote/heterozigote

Markerii genetici la nivelul cromozomilor(gene sau

porUiuni din acestea)

Markeri care flanchez gene

Distanta dintre marker si gena trebuie sa fie mai mica de 5cM pentru ca
markerul sa se transmita prin linkage complet cu gena

Cum

sunt

utilizaUin

selectie?

Dup genotipizarea indivizilor, prin procedee

speciale de mperechere, genele de interes

pot fi transferate cu mai mult precizie i ntrun interval de timp mai scurt de la o linie la
alta sau de la o ras la alta.
Fenomenul poart numele de introgresia
genelor.

Avantajele pe care le ofer utilizarea

markerilor moleculari
Selecia asistat de markeri (MAS) poate fi aplicat la
ambele sexe pentru caracterele limitate de sex
(producia de lapte, ou, etc)
poate fi aplicat timpuriu pentru caracterele de
reproducie;
poate fi aplicat i pentru caracterele care se
manifest trziu n viaa animalului sau se
msoar dup sacrificarea animalului;
n trasabilitate este singura metod 100% sigurpentru
identificarea provenienei unui produs

Markeri genetici asociai cu nsuirile produciei de lapte la taurine: kcazeina, lactoglobulina, Pit-1(Metode de evideniere a
polimorfismelor i asocierile alelelor favorabile cu nsuirile ).

Cum sunt utilizaUi n selecUie markerii

Se preleveaz probe biologice din populaUia analizat
Se extrage ADN
Se genotipizeaz populaUia la locii de interes economic prin PCR (de
exemplu PCR-RFLP, etc)
Se fac studii de asocieri genetice ntre genotip i performanUe productive
Are loc selecUia indivizilor care poart alele favorabile (de exemplu alelela
A), acetia fiind utilizai la reproducie
Sunt excluse de la reproducUie genotipurile nefavorabile (de exemplu care
poart alela )
Dup mai multe generaUii de selecUie, are loc creterea frecvenUei alelei

favorabile (A), asociata favorabil cu o insusire de interes economic

Markerii ADN care codific proteinele laptelui

Mai mult de 90% din proteinele laptelui sunt
reprezentate de 4 tipuri de cazeine :
cazeina - s1 , -s2, cazeina i k-cazeina
din laptele integral
i alte dou tipuri de proteine din zer:
lactoglobuline i lactalbumine

Markerul k-cazeina
Gena ce codific k-cazeina (13 kb; 5 exoni i 8 introni).
Structura genetic la locusul k-cazeinei poate fi determinat
cu tehnica PCR-RFLP, prin amplificarea cu primeri specifici a
unui fragment de 350 pb, urmat de restricUia produilor de
amplificare cu enzima HinfI.
La acest locus exist 2 alele: A - normal i mutant favorabil i de interes n practica de ameliorare a
animalelor.

Determinarea genotipurilorPCR-RFLP/HinfI/electroforeza in gel de

agaroz
homozigot AA: 132/134 pb i 84 pb;
heterozigoUii A: 266pb, 132/134 i 84 homozigoUii : 266pb i 84 pb

Homozigotul BB al k-cazeinei - lapte cu proprieti

superioare de prelucrare n industria brnzeturilor.
Avantajele utilizrii homozigoUilor - scurtarea timpului de
formare a coagulului, un coagul mai dens i realizarea unei
producUii mai mari de brnz n comparaUie cu laptele
provenit de la vacile cu genotip homozigot AA.
n urma genotipizrii n schemele de selecUie sunt utilizaUi
indivizii cu genotip i A, aceasta va duce la creterea
frecvenUei genei n populaUie, ce se rsfrnge n
managemnetul fermei printr-un randament superior a
producUiei de brnz

Markerul B-lactoglobulina
-lactoglobulina este absent la om, oarece i
obolan
are proprietatea de a gelifica zerul, fiind
important n fabricarea urdei. EvidenUierea
polimorfismului tehnica PCR-RFLP/HaeIII
n selecUie alela B a - lactoglobulinei are efect
superior, fiind asociat cu o cantitate mai mare
de protein i grsime
Genotipuri favorabile n selecUie la cei doi loci:
BBkcazeinBB - lactoglobulin

Markerul Pit1
Factorul de transcripie pituitar (Pit 1) este un factor celular
specific pentru activarea expresiei genelor prolactinei (PRL),
tirotropinei i hormonului de cretere (GH) n glanda
pituitar anterioar;
Polimorfismul la locusul Pit1 a fost studiat prin tehnica PCRRFLP n care produsul de amplificare de 1355pb a fost digerat
cu enzima HinfI.
Genotipul AA, 270, 425 i 660pb pentru i 270, 385 i 660
pb i pentru heterozigotul A 270, 385, 425 i 660

Polimorfismul Pit 1 la rasa lUat romneasc

Alela A a genei Pit1 a fost asociat cu o
producie superioar de lapte, cantitate mai
mare de protein i cantitate sczut de
grsime.
Genotipuri favorabile n selecUia n tandem:
AAPit1BBK-cazeina

Markeri genetici asociai cu nsuirile produciei de carne la taurine:

tiroglobulina, leptina i receptorul leptinei, calpastatina, hormonul de
cretere. (Metode de evideniere a polimorfismelor i asocierile alelelor
favorabile cu nsuirile).

Markeri genetici asociaUi cu nsuirile

producUiei de carne la taurine
Markerii:
Tiroglobulina
Leptina i receptorul leptinei
Calpastatina
Hormonul de cretere

Markerul Tiroglobulina
Tiroglobulina (Tyr) este un hormon
glicoproteic sintetizat de celulele foliculare ale
tiroidei, implicat n depozitarea de grsime n
muchi i n stocarea de energie.
Polimorfismul (TG5) situat n secvenUa leader a
genei tiroglobulinei a fost asociat cu coninutul
intramuscular de grsime i frgezime a crnii
la bovine
Detectarea polimorfismului - PCR/RFLP

Markerul Leptina (LEP) i receptorul leptinei

(LEPR)

Gena obezitUii (ob) i produsului ei leptina Leptina

este un hormon proteic de 16 kDa sintetizat n
principal de Uesuturile adipoase i excretat n snge,
fiind implicat n reglarea greutUii corporale, a
balanUei energetice, controlul formrii osoase,
fertilitate i funcUiile imune ale organismului.
Mutaiile aprute n gena care codific leptina
suprim producUia acestui hormon, acestea fiind
asociate cu obeziti morbide att la roztoare, ct i
la om (ob/ob).

 Greutatea carcasei i cantitUile mai mari de grsime din carcas au fost

atribuite unui polimorfism RFLP din gena leptinei
MutaUiile n gena leptinei: o mutaUie punctiform de tipul CC/TT n secvenUa
codificatoare a genei sunt implicate n legarea receptorului i semnalizarea
hipotalamusului cu privire la ingestia de hran
HomozigoUii CC semnalizarea hipotalamusului stop ingestiei de hran
HomozigoUii TT nu se produce semnalizarea, animalele continu s se
hrnesc.HomozigoUii TT consum o cantitate mai mare de mas uscat i
protein crud dect heterozigoUii CT i homozigoUii CC, au grad crescut de
marmorare a crnii, lactaUii superioare
HomozigoUii CC au o carne slab

Markerul calpastatina (CAST)

Frgezimea crescut a crnii ce ajunge pe
masa consumatorului este determinat de
activitatea enzimatic endogen a dou forme
enzimatice - proteazele calpaine (calpaina m i
) ce sunt activate de ionii calciu. Acestea apar
n mod natural n muchi.
Calpastatina este substratul endogen ce
inhib calpaina.

 gena calpastatinei, are dou variante genetice: una

asociat cu frgezimea crnii (alela favorabil) i
cealalt cu o carne mai dur (alela nefavorabil n
selecUie). EvidenUierea polimorfismelor - PCR/RFLP/DdeI

Markerul gena

hormonului de cretere bovin (bGH)

Gena bGH cartat pe cromozomul 19 bovin face parte dintr-o familie multipl
de gene (din care mai fac parte prolactina i hormonii lactogeni placentari)
Gena bGH este format din 5 exoni (I-V) i 4 introni (A-D).
La nivelul ei au fost puse n evidenU cteva regiuni polimorfice:n interiorul
exonului V- n poziUia 2141;n intronul C -poziUia 1547, n poziUia 2637 a aceluiai
intron, toate cele trei polimorfisme fiind evidenUiate prin tehnica PCR-RFLP.
ntre unele polimorfisme din gen s-au stabilit asocieri cu performanUele de
cretere i cantitatea de carne din carcas
n selecUie a fost detectat ca favorabil alela pentru un polimorfism de
tip PCR-RFLP

Markeri genetici asociai cu nsuirile produciei de carne la

suine (markerul CRC1 asociat sindroamelor de stres) i ali markeri la
suine. Markeri genetici asociai cu rezistena la bolile
prionice la ovine
Markeri genetici asociai cu nsuirile produciei de carne la
suine

Gena halotan (Hal/1823) = gena receptorului rianodin (Ryr 1) sau

gena sindromului de stres (aa cum a fost denumit prima dat) a
fost prima gen marker utilizat n selecUie la suine.
O mutaUie punctiform aprut la nivelul genei canalului de
eliberare a calciului determin starea homozigot/heterozigot (NN,
Nn, nn) la acest locus asociat diferitelor forme de sindroame de
stres: Sindromul de stres al suinelor (PSS), Sindromul de hipertermie

malign; sindromul de carne PSE (Pale-soft-exudativ)

 La suine sindromul de stres produce modificri metabolice care au

efecte semnificative asupra calitUii crnii. Calitatea crnii poate fi:
Normal (NN, Nn): pH 6,4 la 45 min de la abatorizare i pH final 5.5
PSE - pale-soft-exudative (nn)(pH<6 la 45 min. dup abatorizare) sau
DFD
- dark-firm-dry (pH>6 la 12-24h dup abatorizare)

Ultimele dou sunt improprii pentru procesare:

HeterozogoUii Nn sufer de hipertermie malign asociat
pierderilor prin deces pe perioada transportului. HomozigoUii
nn trebuie eliminaUi din populaUii deoarece sufer de sindrom
acut de stres mortalitate i carne PSE, DFD
Din schemele de selecUie se exclud homozigoUii nn. Se utilizeaz
linii terminale de vieri NN x cu femele NN sau Nn.

Alte aplicatii ale markerilor ADN

Markeri asociaUi cu rezistenUa la boli la ovine
Encefalopatiile spongiforme transmisibile (EST) sunt un grup de boli
prionice fatale, att la om ct i animale: Scrapia la ovine i caprine,
encefalopatiile spongiforme ale bovinelor (BSE), felinelor, nurcilor,
struUilor, elanului i lemurienilor.
AgenUii cauzatori prionii, molecule proteice lipsite de acizi nucleici
Caracteristic comun: vacuolizri i degenerescenU la nivel SNC
Fr tratament
Toate sunt boli fatale

Scrapia
boal prionic fatal a ovinelor i caprinelor
Produce pierderi mari n turme
InfecUia orizontal i vertical
Animalele afectate trebuie sacrificate i arse. Punile
infestate nu pot fi utilizate 3-5 ani
n gena ce codific proteina prionic normal (Pr-P) exist mai mulUi loci
polimorfi, unele genotipuri fiind asociate cu rezistenUa/sensibilitatea la
boal.
SelecUia pentru creterea rezistenUei asistat de markeri genetici

Gena codificatoare a proteinei prionice conUine 3 loci polimorfi SNP, n

codonii 136, 154, 171 care alctuiesc un bloc haplotip cu transmitere
nlnUuit

La majoritatea raselor la cei 3 loci exist 5 alele i 15

genotipuri posibile ncadrate n 5 clase de risc:
Genotipul ARR/ARR- rezistenU natural la scrapie
Genotipul VRQ/VRQ sensibilitate maxim la scrapie
SelecUia: vizeaz genotipizarea animalelor i eliminarea din
schemele de selecUie a genotipurilor sensibile purttoare a
alelelor VRQ

Markeri genetici pentru sexarea embrionilor la taurine i

markerii genetici pentru trasabilitatea crnii de bovin. Metode
moleculare pentru detectarea patogenilor si a OMG-urilor in produse
alimentare.

 Cresctorii de bovine sunt interesaUi fie de

producerea numai a produilor de sex femel
(pentru a avea posibilitUi mai mari de sporire
a producUiei marf, ct i o dublare a
intensitUii de selecUie anual care se rsfrnge
pozitiv n ctigul fermei pe termen lung) sau a
viUeilor de sex mascul (cazul cresctorilor de
carne de bovine, deoarece carcasa masculilor
este cu 60-70% mai grea dect a femelelor).

au fost dezvoltate metode moleculare rapide ce

fac posibil identificarea cromozomului Y nc
din stadiul embrionar.
La baza metodei st principiul identificrii
secvenUelor specifice (dY)) prezente pe
heterozomul Y i absente pe X, precum i a unor
secvenUe specifice de tip microsatelit.

Markerii microsateliti pentru

Trasabilitatea crnii de bovin

Presupune alctuirea unei bnci de esuturi de la toate animalele
Genotipizarea la 8 loci microsatelit i alctuiea unei amprente genetice
unice, specifice fiecarui individ
Formarea unei baze de date genetice n care sunt stocate toate amprentele
Fiecrui animal i corespunde un nr de identificare prezent n crotalie, banca
de Uesut i baza de date genetice
Verificarea traseului crnii prin amprentarea probelor din abator (sau
magazin), urmata de cutarea potrivirii amprentei n baza de amprente si
identificarea fermei din care provine animalul

Metode moleculare pentru detectarea

patogenilor in produsele alimentare
Majoritatea bazate pe PCR si Real Time PCR
Unele bazate pe tehnici de hibridare
(FISH/Fluorescent In Situ Hybridization)
Detectarea tulpinilor enterohemoragice a E.coli
(EHEC), implicate in colita hemoragica si sidromul
hemoragic uremic.
Tulpina E. coli O157:H7 alaturi de Salmonella, L.
monocytogenes, si Campylobacter sunt
considerate patru cele mai importante tulpini
patogene din alimente.

Detectarea E. coli O157:H7

Datorita dozelor mici de toxina produsa de tulpinile
enetrohemoragice (Shiga like toxine/verocytotoxine VT1
si VT2) pentru a cauza imbolnaviri, detectarea acestora
este importanta la concentratii foarte reduse in hrana.

Prin reactia PCR, genele codificatoare a

verotoxinelor
1 si 2 de la E.coli O157:H7

Detectare organismelor modificate

genetic in hrana
2 din cele mai importante gene ce se regasesc in
alimente sunt:
Gena Bt preluata de la Bacillus thuringensis care

produce o toxina impotriva daunatorilor la

plante. Adaugarea genei in genomul plantelor
transgenice reduce aplicarea de insecticide
pentru protectia plantelor.
Gena pentru rezistenta la Glifozat a fost
transferata la plante pentru protectie fata de
erbicide totale (Roundup)

 Prin PCR se amplifica un fragment din promotorul

35S care conduce gena de rezitenta la glifozat,
Deoarece majoritatea alimentelor au adaosuri de
soia si porumb, detectarea prin PCR a
promotorului 35S evidentiaza prezenta transgenei
(OMG) in alimente.
Alaturi de promotorul 35S se amplifica si gena
tubulinei care este prezenta in toate plantele
confirma prezenta AND-ului plantei in probe.
AND-ul este izolat din plante de soia sau produse
alimentare

 Se utilizeaza primeri specifici pentru amplificarea

celor doua fragmente de gene
(1) promotorul 35S/ un fragment de 162 pb

Amprentele genetice n scop de identificare: istoric,

definiie, tipuri de polimorfisme nucleare i
extranucleare (locii VNTR, STR) utilizate la ntocmirea
amprentelor i aplicaiile acestora.

AMPRENTA AND

Polimorfisme individuale la nivel ADN

evideniate sub forma unui profil
asemntor codului de bare, care
difereniaz individul de ali indivizi

Tipuri de amprente i tehnici de

evideniere
Clasificare:
Dup locii i tehnicile de amprente
unilocus

- multilocus

Amprentele bazate pe PCR (PCR-RFLP, AFLP,

Sequence-Tagged Microsatellite Profiling (STMP) pentru evidenierea microsatelit i Tehnica STR VNTR (Sequence - Tagged RepeatsVNTR)/minisateliti
Amprente: bazate pe hibridare (RFLP, microarray)

Istoricul amprentelor ADN

utilizate n identificare

Wyman i White (1978-1980) - primele observaii

referitoare la polimorfismul ADN asupra genei globinei
au detectat cu ajutorul enzimelor de restricie (prin
tehnica RFLP) un locus polimorf din ADN
caracterizat printr-un numr mare de fragmente
de restricie cu lungime variabil.
Au observat c polimorfismul din gen (RFLP) se
gsete de-a lungul ntregului genom uman.

Alec Jeffreys primul cercettor care a aplicat tehnicile de

genetic molecular n justiie

n 1985 Alec Jeffreys descoper n gena alfa a hemoglobinei

umane care coninea (pe lng secvena normal de
nucleotide a genei hemoglobinei) un sector din ADN n care
se repet de multe ori aceeai secvent de dou nucleotide
(CA)n.
Numrul acestor repetiii de tip (CA)n era foarte diferit de la
o persoan la alta, iar acest polimorfism evideniat l-a
evideniat sub forma unui profil electroforetic asemntor,
codului de bare i l-a denumit amprent genetic.
A estimat c ansa erorii de difereniere ntre indivizi la locii
microsatelii este practic nul, apreciat teoretic a fi una la
12 miliarde.

Locii cu polimorfism ridicat pentru

ntocmirea amprentelor ADN

Amprentele ADN sunt realizate n

diferite scopuri:
- cele unilocus pentru evidenierea
unui polimorfism asociat unei nsuiri
sau rezistenei la boli
-cele multilocus pentru studierea
diversitii genetice la plante i animale
iar la om n scop de identificare

Locii cu polimorfism ridicat pentru ntocmirea

amprentelor n scop de identificare pot fi
situai n genomul nuclear sauextranuclear

Genetica judiciar utilizeaz aceste polimorfisme n

expertiza medico legal;cercetare filiaiei
biologice (teste de paternitate);identificarea
criminalistic
MARKERII ADN nuclear (de tip microsatelit
STR i minisatelit VNTR) - sunt identificai n
tot genomul sau doar pe heterozomi (X i Y)
i MARKERII ADN extranuclear (ADNmt)

M rkerii ADN nuclear:

a
Secvenele repetate:
5
a) mediu repetate (cteva copii-10 copii/genom)
5
7
b) nalt repetate (10 -10 copii/genom)
Sunt formate din ADNnoninformaional

- Nu se transcriu/traduc
- Au polimorfism foarte ridicat (numr foarte mare
de alele la un locus)

I. ADN inalt repetat -VNTR (VARIABLE

NUMBER IN TANDEM
REPEATS)/MINISATELIII
Monomerul VNTR - format din (zeci de pb)n.
Se gsete n cteva copii-105 copii/genom)
este distribuit peste tot n genom
Poate fi situat n interiorul genelor (introni) sau n
regiunile intergenice
Polimorfismele VNTR sunt determinate de numrul
repetiiilor monomerului i de poziia acestora n genom.
Numrul de copii (n) din fiecare tandem este variabil n
cadrul speciei umane, de la un individ la altul=diferentiaza
alelele
Apariia de alele noi are loc prin crossing-over inegal

Exist dou tipuri de formaiuniVNTR:

unilocus
multilocus

Se apreciaz c analiza a 3 sau 4 loci polimorfi de tip VNTR unilocus

(de pe cromozomi diferii) este de regul suficient pentru
investigarea unei filiaii, ntruct ofer o orientare clar cu privire
la cazurile de excludere i pot confirma paternitatea cu o
probabilitate de 99%. ansa ca 2 indivizi nenrudii s aib aceeai
combinaie de alele pentru 4 loci VNTR este apreciat statistic ca fiind
de 1:1 milion.

Aplicaii

ntocmirea amprentelor genetice n scopul:

- stabilirii paternitii
- de identificare
- criminalistic i justiie
Construirea bncilor de ADN (profile VNTR
de la persoane care au nfptuit delicte
penale);
Filogenia speciilor

EXEMPLE:
1.
Obinerea unei amprente ADN
folosind o prob VNTR (1)prepararea probei
Primul intron din gena mioglobinei conine repetiii ale
aceleiai secvene miez de 33 bp . Aceast secven miez
se gsete i la ali loci VNTR, marcai VNTR I, VNTR II i
VNTR III
Prin tehnica
de hibridare i
transfer pe membrane Southern bloting s-a realizat
hibridarea ADN-ului din probe cu o sond format din
secvena miez de 33
bp
rezultnd amprenta ADN de la
3 indivizi (Fig.
dup J.D. Watson i
col., 1992)
Fiecare individ (A,B,C) are nr diferit de repetiii
(/alela) pecei doi cromozomi i un profil electroforetic
caracteristic

Amprenta VNTR pentru demonstrarea clonrii oii

Dolly prin transfer nuclear din celule somatice de
animal adult
Pentru ntocmirea amprentei ADN au fost
prelevate probe ADN:
din celulele glandei mamare ale oii donoare de
material genetic (U)
-din celulele glandei mamare cultivate n
laborator (C)
de la clona Dolly (D)
, constatndu-se potrivirea perfect ntre
cele 3 amprente U,C,D.
1,2 i 3-12 probe de la ali indivizi

II. ADN nalt repetat STR (Short

Tandem REPEATS)/MICROSATELIII

MICROSATELIII STR- sunt secvene nalt repetate i

tandemizate
Unitatea repetitiv (monomerul) este format din (1-6 pb)n. Cei mai
frecveni microsatelii n genom sunt cei care au unitatea format din 2
i 4 nucleotide.
se transmit codominant

polimorfism foarte nalt, potrivit pentru ntocmirea de

amprente genetice care pot discerne chiar ntre indivizi
strns nrudii
Secvenele STR sunt supuse unei evoluii extrem de rapide,
de apariie de noi alele prin erori fcute de ADN polimeraza
n timpul replicrii ADN. Frecvena cu care apar mutaiile la

nivelul microsateliilor este de ordinul 4x10-4- 5x106/alel/generaie.

Deoarece lungimea acestora este mic, metoda

pentru cartare este tehnica PCR
Primerii sunt structurai dup secvena unor gene
unice care flancheaz aceti loci.
Dup amplificarea PCR i electroforez n gel se pot
evidenia genotipurile.
Alele se transmit codominant i pot fi urmrite n
descenden

n identificarea criminalistic se utilizeaz bncile de date ADN i

markerii STR.
Bncile de ADN sunt colecii de amprente STR provenite de la
indivizii care au nfptuit delicte penale.
Nivelul de informaii furnizat de aceti 13 loci STR are o
probabilitate de discriminare de 1 la 100 de trilioane
Markeri STR. COmbined DNA Index System (CODIS) baza
american de date

Etapele parcurse pentru realizarea unui

test ADN n serviciile medico-legale i

criminalistice

Sursele de ADN :
]esuturi proaspete, snge integral, celule ale mucoasei
bucale, foliculi piloi sau probe uscate: pete de snge
sau sperm de la locul faptei
Probe de snge de lasuspeci

Prelevarea i conservarea probelor biologice pentru

analiza ADN
Izolarea i purificarea ADN din probele biologice

Cu ajutorul unor procedee chimice, fizice sau

combinate,
evitndu-se
contaminarea
i
degradarea probei

Genotiparea ADN n scop de identificare

http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/elsi/forensics.s
html#2

Se poate realiza prin dou tipuri de tehnici:

1. tehnici bazate pe hibridare (tehnica RFLP combinat cu
Southern blotting) a fost prima tehnic utilizat n acest
scop)
2. tehnicile bazate pe reacia PCR:
Tehnica sequence-tagged microsatellite profiling (STMP)
pentru evidenierea polimorfismelor STR (short tandem
repeats)
Tehnica STR - VNTR (Sequence - Tagged RepeatsVNTR)
Metoda care s-a impus n prezent este metoda bazat pe PCR
pentru locii STR (Short Tandem Reapeats) - tehnica (STMP)
Tehnicile PCR utilizeaz primeri construii din secvenele
genelor nvecinate

Evidenierea polimorfismului cromozomului Y i X pentru

ntocmirea amprentelor genetice

Polimorfismele cromozomul Y - n testarea paternitii cnd este

investigat descendentul mascul al unui tat prezumtiv, precum i n
diferite cazuri de criminalistic.
O regiune a cromozomului Y conine diferite tipuri de secvene
polimorfe cum ar fi: markerii bialelici (unilocus)

Secvene -STR(DIS19) i VNTR (secvene repetitive) .

Cele mai utilizate STR-uri Y pentru ntocmirea de amprente sunt formate
din repetiii trinucleotidice i tetranucleotidice.
Polimorfismele cromozomului X - Datorit modului particular de transmitere a
caracterelor genetice specifice cromozomului X genotiparea markerilor XSTR este util atunci cnd sunt disponibile pentru testare surori vitrege sau
bunica matern. n timp ce taii transmit cromozomul X fiicelor lor ca

haplotip, mamele transmit materialul lor genetic X n grupe de linkage,

rezultat n urma fenomenelor de recombinare meiotic (crossing-over).

ADN citoplasmatic ADNmt i

prentele genetice
Evideniereapolimorfismului

ADNmt
ADNmt se transmite pe cale matern la fii i fiice, iar
fiicele transmit ADN mitocondrial la generaia urmtoare.
Masculii nu transmit ADN mitocondrial;
Analiza regiunii de control a ADNmt (1000pb) este o
metod eficient pentru studiul i compararea
provenienei oaselor, a ADN-ului vechi i foarte degradat
i mai ales pentru analiza firelor de pr fr bulb, mediu
acid, umiditate, nhumare prelungit; alte tipuri de probe
pentru care a euat tiparea cu markeri nucleari.

Realizri
1.

2.

Determinarea filiaiei, a paternitii i identificarea persoanelor

care au svrit fapte penale.
Stabilirea identitii unor persoane disprute n condiii suspecte

S-a demonstrat c rmiele scheletice descoperite

la Ekaterinenburg, n M-ii Ural, aparin ]arului
Nicolae II i familiei acestuia.
n aprilie 2000 l-a Paris, pe baza analizelor ADN s-a
demonstart c fiul regelui Louis Charles de France
XVI i al Mariei Antoaneta, a murit n nchisoare.
A fost stabilit apartenena familial a numeroi copii
dai disprui n diverse circumstane (rpii la
natere) n Argentina, n anii 1970.

Identificarea victimelor din 11 septembrie

2001 de la World Trade Center (20000 de resturi ale
victimelor de la World Trade Center au fost analizate
i introduse ntr-o baz de date ADN pentru
identificare.
n anul 2005 cercetarea s-a considerat ncheiat;
1585 din cele 2987 victime fiind identificate.
Pentru restul victimelor s-a considerat c probele
sunt prea mici pentru a putea fi analizate. n 2007 o
companie american a dezvoltat o nou tehnologie
de analiz ADN bazat pe cantiti mici de material
biologic i cercetarea a fost redeschis, pentru
identificarea tuturor victimelor.

3. Pentru stabilirea identitii pot fi utilizate si la

animale. Analiza este util
n stabilirea
trasabilitiicrnii
4. Cu ajutorul amprentei ADN s-a demonstrat
c oia Dolly este o clon provenit prin
transfer nuclear din celule somatice de
animal adult n ovocite enuclete.

Pot fi utilizate pentruprotecia i conservarea

genofondului
Au fost alctuite bnci de ADN, librrii ADN, celule i
esuturi congelate, pentru speciile de animale
ameninate cu dispariia.
Au fost alctuite amprentele ADN pentru identificarea i
monitorizarea urilor grizli, (a cror efectiv s-a redus cu
99%)
4. Urmrirea ancestral a migraiei umane
Bioantropologii utilizeaz amprentele ADN (ADN i
ADNmt) pentru urmrirea migraiei umane i
ntocmirea arborelui genealogic n familii.

Tehnicile bazate pe
hibridarea acizilor nucleici principiul
Instrumentele moleculare

tehnicilor i
tipuri de sonde. Tehnica de hibridare i transfer pe
membrane Southern blotting i tehnica de hibridare
microarray: principii i aplicaii.

Tehnici de hibridare ale acizilor nucleici

Denaturarea ADN-ul este un proces de rupere a punilor de hidrogen

dintre catenele de ADN, atunci cnd soluia n care se gsete acesta
este nclzit la >95oC.

Dac soluia se rcete brusc ADN-ul rmne denaturat (monocatenar).

Renaturarea (hibridarea acizilor nucleici) sau refacerea punilor de
hidrogen se produce dac rcirea soluiei se face lent i este meninut
temperatura la 65oC pentru o anumit perioad de timp.
Hibridarea acizilor nucleici se bazeaz pe proprietile unei catene de ADN
de a forma molecule dublu catenare sau de a renatura dac bazele
azotate sunt complementare ntre ele. Acest lucru se ntmpl n cazul
n care exist complementaritate n proporUie mare ntre moleculele
de ADN nemarcate i sonde.
Analiza de hibridare a acizilor nucleici implic utilizarea sondelor
marcate de acizi nucleici pentru a identifica molecule de ADN i ARN,
cu grad nalt de similitudine, dintr-un amestec de molecule de acizi
nucleici nemarcai sau de acizi nucleici int.
ntotdeauna sonda i proba trebuie s fie monocatenare

Una dintre cele dou este marcat pentru detectarea hibrizilor moleculari

Metode de hibridare ale acizilor

nucleici :
Metode de hibridare a acizilor nucleici

A. hibridarea acizilor nucleici i

transferul pe membrane - Metoda
Southern blotting
B. hibridarea acizilor nucleici pe
microcipuri Microarray (DNA Chip)

Sondele s r secii calde

Sondele reci calde

n procesul de hibridare una dintre catenele de acizi

nucleici care este marcat se numete sond
Sondele marcate cu radioizotopi - sonde calde

sunt obinute cu ajutorul atomilor de 32P, 33P, 35S sau 3H

pot fi detectate n soluie sau pe suport solid (autoradiografie)/
intensitatea semnalului radioactiv
Sistemul de marcare neradioactiv pentru producerea sondelor reci
implic utilizarea unor substane fluorescente, neradioactive

Exist dou modaliti de producere a sondelor reci:

Marcarea direct neradioactiv

Marcarea indirect neradioactiv

Marcarea direct neradioactiv, n care sunt

utilizate substane denumite fluorofori pentru
modificarea nucleotidelor ncorporate n ADN n
timpul sintezei.
Marcarea indirect neradioactiv, utilizeaz
cuplarea chimic a unei molecule reporter
modificate cu un precursor nucleotidic. Dup
ncorporarea n ADN, gruprile reporter se vor lega
specific de o alt protein sau un ligand cu
afinitate crescut pentru moleculele reporter, aa
cum sunt anticorpii, iar detectarea se face cu
markeri care recunosc anticorpii.

Tehnica presupune identificarea unor

polimorfisme RFLP n urma hibridrii cu sonde
marcate radioactiv.
Pentru realizarea tehnicii RFLP/Southern
blotting se parcurg mai multe etape:
1. RFLP
(1) digestia ADN genomic cu enzime de
restricie (RFLP);
(2) separarea fragmentelor de dimensiuni
variabile n gel de agaroz

2. Southern blotting
(3)gelul este acoperit cu o membran de nitroceluloz
sau un filtru de nitroceluloz peste care se adaug un
teanc de hrtii de filtru;
(4)se introduce membrana de nitroceluloz mpreun cu
gelul ntr-un rezervor n care se gsete o soluie
tampon;
(5)fragmentele de ADN din gel sunt purtate de soluia
tampon ctre membrana de nitroceluloz pstrndu-se
poziUia relativ a benzilor din gel;
(6)urmeaz denaturarea membranei cu soluii alcaline;
(7) membrana de nitroceluloz cu fragmentele de ADN
imobilizate pe ea (proba) este introdus ntr-o pung n
care se gsete sonda n soluie, marcat radioactiv.

Sonda poate fi reprezentat de

fragmente de ADN, sau
- ADNc.
Sondele marcate vor hibrida cu
ADN monocatenar imobilizat pe
membran, pe baz de
complementaritate.
(8) Splarea membranei de
nitroceluloz pentru ndeprtarea
sondelor nehibridate i uscarea n
etuv;
(9)Autoradiografia filtrului de
nitroceluloz va evidenia profilul de
benzi ce indic numrul i mrimea
fragmentelor de ADN complementare
sondei
- (10) se obtine o amprent genetic
- Aplicatii
evidentierea genelor clonate n diferite
gazde,
ntocmirea hrUilor de restricUie,
Identificarea markerilor moleculari
RFLP
i/sau
determinarea
mutaUiilor (deleiilor, inseriilor i a
altor rearanjri ale genomului).

Identificarea genelor nrudite (fie la

aceeai specie
- fie cu alte specii)
EvidenUierea familiilor repetitive de
secvenUe din genom
- Pot fi identificate o gam larg de maladii
determinate genetic cum este de exemplu
distrofia muscular Duchenne

S-a

demonstrat cu ajutorul
acestei tehnici c la drojdii
exist gene nrudite cu
oncogenele RAS (RAt
Sarcoma) de la om
- grad nalt de conservare
evolutiv.
S-a constatat c genele RAS
umane sunt funcionale i la
drojdii i c unele secvene din
originea replicrii de la drojdii
sunt similare cu secvene
umane

Instrumentele moleculare Secvenierea

acizilor nucleici: Metoda Maxam-Gilbert

i Metoda Sanger principiile

metodelor i etape de realizare

Tehnologia ADN
Microarray (DNA
chips)

n tehnologia ADN microarray sunt

utilizate suporturi solide, miniaturale
(1,3 mm-1,3 mm),pe suprafaa crora
sunt imobilizate un numr mare de
sonde ADN (10-25 pb), fiecare cu
alt secven oligonucleotidic i ntro poziie diferit una fa de cealalt.
Sondele sunt secvenUe
oligonucleotidice sintetizate
chimic sau secvenUe scurte de
ADN sau ADNc.
Tehnologia ADN microarray (DNA
chip) utilizeaz hibridarea invers,
adic sonda este imobilizat pe
suportul solid iar proba
(secvenUa Uint) se afl n

soluUie i este marcat

fluorescent (Cy3 i Cy 5).
Exist mai multe variante ale tehnicii
microarray: n
care are loc hibridarea cu probe ADN
sau ADNc
Se urmrete identificarea unor
polimorfisme ADN de tip SNP sau se
determin expresia unor gene prin hibridare
cu molecule de ARNm(n diferite boli)

In tehnologia SNP microarray plcuele

conin un numr foarte mare de secvene
oligonucleotidice cu un numr foarte
mare de markeri SNP dintr-un genom
(500.000 n cazul genomului uman,
50.000 sau 500.000 la vaca, porc, cal,
cine, oaie)
.{Cipurile SNPau fost dezvoltate i pentru
cartof, mr, roie, porumb, orez i cire.}
Prin dirijarea probelor ctre sonde,
hibridarea se va produce doar ntre
secvenele
ntre
care
exist
complementaritate n proporie destul de
mare
Vizualizarea secvenelor hibridate se face
n lumina UV, la scanarea plcilor culorile
indic poziiile de hibridare
Scanarea tuturor markerilor SNP din
genom /utilizat pentru stabilirea de
asocieri i ameliorarea speciilor de ferm i

a plantelor de cultur.
La om tehnica SNP microarray este util n
predicii n unele
boli genetice i n cancer; n farmacogenomic
etc
. O parte a populaiei (de referin) este genotipat
la cca 50.000/500.000 loci SNP- uri prin tehnica
microarray i sunt nregistrate fenotipurile (nsuiri
ale produciilor, rezistena la boli etc.
Efectele tuturor SNP sunt estimate n populaia de
referin prin modele statistice n care se stabilesc
asocieri ntre fenotip i polimorfisme ecuaii
predictive cu privire la valoarea de ameliorare
(A) a populaiei de referin
Cealalt parte a populaiei se genotipeaz cu acelai
SNP-chip iar valoarea genetic total este estimat
pe baza ecuaiei predictive ntocmit pentru
populaia de referin (2)

Microarray pentru prognosticul n

cancerului de san

n analiz sunt utilizate probe de

ARNm din celule sntoase i
canceroase, marcate florescent

(Cy3 i Cy5) Sunt comparate

genele care se exprim activ n
tumori comparativ cu genele din
celulele normale. Fiecare spot
colorat indic genele care se
exprim i intensitatea de expresie
n stare normal i n cancerul de
sn (n anumite esuturi)

METODA MAXAM I GILBERT

(1977)se bazeaz pe
degradarea chimic a
catenelor de ADN.
-

secvenUa operonului lac de

la E. coli
a genomului virusului SV 40
a plasmidei pBR322

Etape
Izolarea unei gene sau a unui fragment de ADN
Amplificarea PCR asimetric
Tratarea fragmentului cu fosfataza alcalin pentru
eliminarea radicalului 5
fosfat;
Marcarea cu 32P a captului cu ajutorul enzimei
polinucleotidkinaza;
PopulaUia de catene este mprUit n patru tuburi
de reacUie.
n fiecare tub exist un reactiv care ndeprteaz
(cliveaz) selectiv i parUial o anumit baz:
tubul 1 - reactivul ndeprteaz G
tubul 2 - reactivul ndeprteaz A+G
tubul 3 - reactivul ndeprteaz T+C
tubul 4 - reactivul ndeprteaz C

Migrarea fragmentelor rezultate ntr-un gel de

poliacrilamid
Autoradiografia gelului

tehnologia ADN recombinat definiie,

schema general de realizare,
principii de baz, elemente ietape.

Prin tehnologia ADN recombinat se

poate
clona un fragment de ADN (denumit
pasager) ntr-un vector specializat,
care are
rolul de a transporta molecula pasager
ctre
o celul gazd i de a o proteja de
enzimele
acesteia. La nivelul celulei gazd gena
strin sau pasagerul se va multiplica
mpreun cu vectorul, formnd
mpreun o
molecul de ADN recombinat.

in tehnologia ADN recombinat

intervin mai multe elemente:

Pasagerul gena clonat ,
Vectorul transportorul genei
clonate
Receptorul celula gazd n
care este
clonat ADN recombinat
i diferite enzime enzime de
restricie, ligaze, polimeraze,
enzime
de modificare a capetelor
moleculelor de acizi nucleici
1. obinerea pasagerului i
pregtirea
vectorului
2. alegerea gazdei i pregtirea
acesteia
pentru primirea ADN recombinat
3. Clonarea ADN recombinat

4. Selecia i analiza clonelor

recombinate
5. Detectia genei clonate si a
produsului ei de sinteza
6. Multiplicarea ADN recombinat
i
utilizarea lui n diferite aplicaii.
PRincipii
Pentru transferarea unei gene strine ntr-o
gazd este
necesar construirea moleculelor de ADN recombinat;
Aceasta se realizeaz in vitro prin ligarea genei
pasager la o molecul vectoare, prin legturi
covalente, cu enzima AND ligaza.
Pasagerul (gena de interes) se obine prin mai multe
metode (reverstranscripie, sintez chimic sau
izolare din celule) i va fi pregtit la capete astfel
nct s se poat uni stabil cu vectorul (prin
capete adezive)
Vectorul utilizat trebuie s fie adecvat:
(1) Vectorul trebuie s fie specific celulei gazd sau s
conin elemente specifice gazdei pentru iniierea
transcripiei i translaiei
(2) Vectorul trebuie s fie adecvat mrimii genei
pasager pe care o transferm

(3) Vectorul

trebuie s dein gene marker pentru

selecia recombinanilor
(4) Vectorul mpreun cu pasageul (ADN recombinat)
trebuie s aib capacitate de replicare autonom
Transferul de gene n celule procariote
biotehnologii moderne
Transferul de gene n celule eucariote animale
transgenice
Celula gazd o bacterie- poate primi molecule de
AND recombinat numai dac se gsete ntr-o
stare specific numit stare de competen, care
va suferi astfel un proces de
transformare.

Enzimele utilizate n

tehnologia ADN recombinat

ADN polimerazele dependente de matri,
enzimele de restricie, ligazele i enzimele de
modificarea capetelor moleculelor de acizi
nucleici

Enzimele utilizate pentru

manipularea

ADN se mpart n mai multe

categorii:
ADN polimerazele
Nucleazele
ADN ligazele
Enzime de modificare capetelor
moleculelor de acizi nucleici
ADN polimerazele sunt enzime ce
catalizeaz sinteza unei catene
polinucleotidice
complementare unei matrie ADN;
Enzima care polimerizeaz o
caten de ADN
poart numele de ADN
polimeraz;
Enzima care sintetizeaz un
ADNc, pornind de
la o matri ARN se numete
reverstranscriptaz;

Enzimele care fac sinteza pe baza

unei matrie
ADN sau ARN se mai numesc ADN
polimeraze
dependente de matri.
Modelul aciunii ADN
polimerazelor
dependente de matri se
refer la
polimerizarea ADN pe baz de
complementaritate cu o matri
ADN ce are
direcia 3 5 sau ARN ce are
direcia 5-3
And polimerazile dependente de matrita
ACTIVITILE ENZIMELOR :
Activitatea principal este de a polimeriza
(aduga nucelotide) pe
baza de complementaritate cu o matri
(activitate polimerazic)
Multe dintre polimerazele dependente de
matri pot degrada

molecula de ADN (activitate exonucleazic) la fel

de bine cum pot s
o sintetizeze.
Activitile exonucleazice ale enzimelor pot fi
de dou tipuri:
activitate exonucleazic 3 5 prin care
enzima ndeprteaz
nucleotidele de la captul 3. Acestea sunt
enzimele care corecteaz
greelile fcute de ADN polimeraz n timpul
sintezei moleculei de
ADN;
enzime cu activitate exonucleazic n
direcia 5 3, o activitate mai
puin nt lnit dar prezent i la replicarea
ADN in vivo, prin care
enzima degradeaz secvene scurte ataate la
matri n direcia 5
3 (primerii).

ADN si Arn polimeraze utilize in cercetare

Prima ADN-polimeraz a fost

identificat i
purificat la sf ritul anilor 1950
de ctre Arthur
Kornberg i a fost denumit ADNpolimeraza I,

izolat de la bacteria Escherichia

coli;
are rol esenial n replicarea
genomului
bacterian.
Enzima prezint o activitate
polimerazic n
direcia 5 3 i activitate
exonucleazic n
ambele direcii (3 5 i 5 3).
Datorit celor dou activiti
polimerazice nu
poate fi utilizat n reacia PCR
Se obin din polimeraze native,
extrase de la
bacterii
Prin modificarea polimerazei
Kornberg
(tierea sa cu ajutorul unei enzime

proteolitice n dou segmente) sa obinut

polimeraza Klenow care pstreaz
activitatea polimerazic i cea
exonucleazic
3 5 dar i lipsete activitatea
exonucleazic 5 3.
Aceasta poate fi utilizat n
reacia PCR

in reacia PCR clasic este

utilizat o
enzim termostabil (Taq
polimeraza) ce
lucreaz optim la 72oC dar
rezist chiar la
temperaturi de 95oC. Aceast
enzim este

extras de la bacterii
termofile cum este
bacteria Thermus aquaticus ce
triete n
ape termale
Nu are activitate
exonucleazic 3-5 (vezi
cursul PCR infidelitatea
replicrii ADN
cu Taq polimeraza). n
reaciile PCR de
nalt stringen se
utilizeaz polimeraza
Pfu.

NUCLEAZele
Nucleazele sunt enzime care
degradeazmoleculele de ADN
prin ruperea legturilor

fosfodiesterice ce leag o
nucleotid de alta,
genernd mono sau
oligonucleotide cu capete 5
fosfat.
Dup modul de aciune,
nucleazele pot fi:
exonucleaze, care
acioneaz la capetele 5 sau
3
ale ADN sau ARN (existnd 5 sau
3 exonucleaze)
elimin nd o nucleotid sau o
secven scurt de
oligonucleotide
endonucleaze, care
acioneaz n interiorul
catenei. Unele dintre ele (tipul II)
taie moleculele
de acizi nucleici numai ntre
unele baze

particulare sau numai la nivelul

unor secvene
specifice de nucleotide. Acestea
sunt enzimele
de restricie.
La ce sunt utilizate enzimele de
restrictive in tehnologia AND

La deschiderea vectorului
pentru
inserarea genei pasager
La izolarea genei pasager
din genom
Cum functioneaza enzimele de
restrictie
O enzim de restricie
recunoate o anumit
secven din molecula de ADN
n care produce

dou tieturi, c te una pe fiecare

caten a ADN,
n interiorul sau l ng secvena
recunoscut
denumit situs de restricie.
Denumirea enzimelor de restricie se
formeaz
dup o anumit regul, astfel:
spre exemplu
enzima EcoRI prima liter
definete genul
(Escherichia), urmtoarele dou
specia
bacterian de la care a fost
izolat (coli),
acestea fiind urmate uneori de alte
litere care
definesc plasmida care o produce
(R) i cifra

roman I, II sau III care indic

modul de aciune.
Marea majoritate a enzimelor au
situsuri de
recunoatere formate din 4 pb (taie
des) sau 6
pb (taie rar) i taie mai ales n
interiorul
situsului de recunoatere
Situsul de recunoatere a marii
majoriti a
enzimelor de tip II este un
palindrom care are
secvena n baze azotate
inversat pe cele dou
catene la citirea n direcia 5
3, fa de o ax
de simetrie, rezult nd capete
boante (blunt

ends). n alte cazuri tierea se

face dup o
schem decalat rezult nd
fragmente cu
capete 3 i 5 adezive (cohesive
ends) sau
lipicioase, care se pot reuni
refc nd molecula
de ADN.

AND LIGAZE
Sunt utilizate n tehnologia ADN
recombinat la unirea stabil (prin
legturi vectorul mperecherea
bazelor azotate dintre capetele
adezive generate de ER se face prin
legturi temporare, instabile n
aceasta variant, nsADN ligaza
va sintetiza legturile fosfodiester
ntre nucleotidele aflate la capetele

fragmentelor adezive, determin nd

stabilitatea ADN recombinant.
CUM POT FI UNITE STABIL
FRAGMENETE CU CAPETE
BOANTE
Pentru creterea eficienei de ligare a
fragmentelor cu
capete boante - are loc convertirea
capetelor boante n
capete adezive.
Metode: utilizarea linkerilor sintetici sau a
adaptorilor
(ca i la tehnica AFLP).
- cu ajutorul enzimelor terminaltransferaze
Linkerii sunt fragmente de ADN dublu
catenare,
sintetizate in vitro, n a cror structur
se regsete
situsul de restricie al unei enzime. Prin
ligarea
linkerilor la capetele fragmentelor de
ADN rezult

concatemeri formai din tandemul:

linker + fragment
ADN + linker linker + fragment +
linker etc., n
etapa urmtoare aceste molecule pot fi
atacate de ctre
enzime de restricie ce formeaz
capete adezive i
astfel fragmentele de ADN rezultate vor
putea fi unite
cu eficien sporit.
Adaptorii au structura linkerilor doar
c asupra lor s-a
acionat anterior cu enzime de
restricie.

Alt metod de creare a

capetelor adezive este
fcut cu ajutorul enzimelor
denumite terminal
transferaze, care adaug
homopolimeri la un

capt al fragmentului de ADN, de

exemplu cozi
poli (A). Pe cellalt fragment de
ADN, terminal
transferaza va aduga cozi poli (T)
deoarece n
amestecul de reacie exist un
singur
deoxinucleotidtrifosfat, timina. n
mod similar
pot fi generate cozi poli (G) i
respectiv cozi
poli (C)

Elementele tehnologiei ADN recombinat

pentru clonarea genelor: Pasageul (gena de

interes) -Metode de obinere a

pasagerului n tehnologia ADN recombinant

Gena pasager este orice gen de interes care

poate fi transferat
ntr-o celul gazd bacterian n scopul
exprimrii acesteia
(producerii de biomolecule) sau a obinerii de
animale transgenice.
Exemple de gene clonate n bacterii pentru
producerea de biomolecule sunt:
Gena ce codific factorul de coagulare VIII i IX
de la om pentru Tratamentul hemofiliei
Gena ce codific hormonul de cretere umanpentru tratarea hipostaturii
Gena ce codific insulina uman pentru
tratatrea diabetului
Exemple de gene clonate pentru obinerea de
animale transgenice
- Gena ce codific lactoferina uman la vac,
oaie , capr pentru
obinerea unui lapte cu proprietii
asemntoare laptelui matern
- Gena ce codific lizozimul

- Gena

ce codific hormonul de cretere de la

bovine, uman, de la
somoni la diferite specii acvacole- pstrv,
somoni, crap, midii,
stridii etc

Gena pasager sau gena de interes

poate fi
obinut pe mai multe ci:
fragmentul de ADN este izolat cu
ajutorul
enzimelor de restricie din
celulele n care
acesta se exprim;
fragmentul de ADN este rezultatul
unei reacii
enzimatice de revers transcripie
pornind de la
o matri de ARN;
fragmentul de ADN este sintetizat
chimic

pornind de la structura cunoscut

n baze
azotate a unei gene de interes

Gena care urmeaz s fie

clonat ntr-un
vector poate fi sintetizat n
laborator
pornind de la structura ei n
nucleotide.
Deoarece sintetizatoarele de
gene
produc secvene
oligonucleotidice de
circa 8-12 nucleotide,
asamblarea

acestora se face enzimatic cu

ajutorul
ADN ligazei.
Vectori de clonare a genelor ce sunt
vectorii?; elemente
caracteristice vectorului, rolul
lor i clasificare n funcie de
mrimea insertului (genei pasager)
i a gazdei n care pot fi
transferai.

n experimentele de clonare a ADN

intervine un
element foarte important - vectorul, care
poate primi n
structura sa o molecul strin de
ADN (pasagerul) fr
s i fie afectate funciile.

Vectorul
are capacitatea de replicare autonom
n celula gazd
protejeaz gena pasager de aciunea
degradant a
enzimelor celulei gazd
transport gena pasager n gazd
unde se va multiplica
i se va exprima.
Are 3 elemente eseniale:
- originea replicrii (ori)
- markeri de selecie
- situsuri pentru enzime de restricie

Vectorul de clonare
Mrimea
insertului
Vectori plasmidiali standard 10 kb
Vectori derivai din bacteriofagul 23 kb
Vectori cosmide 44 kb
Vectorii BAC (cromozom bacterian
artificial)Mai mult de 300 kb

Vectorii YAC (cromozom artificial de

drojdie)2.0 Mb

Plasmidele sunt molecule mici de ADN

circular care
se gsesc n citoplasma bacteriilor
Exist mai multe tipuri de plasmide
bacteriene:
TRANSFERABILE
A)- care codific factori de sex (F, F,
Hfr) care mediaz
transferul genelor la alte bacterii (F-)
NETRANSFERABILE
B) -care conin gene de rezisten
la antibiotice (AmpR,
TetR, KanR)
C) Col care conin gene ce determin
sinteza
colicinelor ce omoar tulpini apropiate
de bacterii
Plasmidele sunt prezente la majoritatea
speciilor, dar
nu la toate tulpinile de bacterii

Vectorii plasmidiali provin din

plasmide
native care sunt modificate n
secven
Vectorul mpreun cu
pasagerul formeaz
ADN-ul recombinat
Vectorii recombinai pot fi
introdui n
celule prin transformare ,
deoarece prin
tratarea cu clorur de calciu,
oc termic
(42oC) sau electroporare,
bacteriile de
tipul E. coli devin permeabile
pentru
ADN.

Vectorii plasmidiali mpreun cu gena

pasager se
replic eficient n gazdele lor celulele
bacteriene
Fiecare vector conine 3 elemente
eseniale:
(1) originea replicrii (ori), recunoscut
de ctre ADN
polimeraza bacterian este
responsabil cu
multiplicarea vactorului

(2) Situsuri pentru una sau mai

multe enzime de
restricie (situs unic sau multiplu
de clonare)
unde vectorul poate fi deschis
pentru
introducerea genei pasager
(3) Markeri de selecie (gene de
rezisten la antibiotice,

gena lacZ, molecule reporter) pentru

selecia coloniilor
transformate

n funcie de markerul pe
care l poart
selecia clonelor recombinate
se face fie
pe medii cu antibioticele (Amp
si Tet) dac vectorul conine gene
marker de
rezisten la antibiotice
Fie pe medii cu lactoz
dac vectorul
conine gena lacZ din
operonul Lac E.coli

Exemple de vectori
plasmidiali: pBR322,
pUC, pGEMTeasy etc care pot
clona cca
10kb
Vectorii plasmidiali pentru clonare n
celule procariote n scopul construirii librriilor
de gene Exemplu vectorul BAC (Cromozom
Bacterian Artificial) elemente
carcacteristice i modalitatea de clonare i de
selecie a clonelor recombinate care poart aceti
vectori. Aplicaii

Vectorul de clonare
Mrimea
insertului
Vectori plasmidiali standard 10 kb
Vectori derivai din bacteriofagul 23 kb
Vectori cosmide 44 kb
Vectorii BAC (cromozom bacterian
artificial)Mai mult de300 kb
Vectorii YAC (cromozom artificialde
drojdie)2.0 Mb

Vectorii de clonare BAC

(Bacterial
Artificial Chromosome)
Vectorii

BAC sunt vectori de clonare

construii pe baza
plasmidelor F.
Factorul F confer avantajul ca acetia s
poat fi meninui
ntr-o singur copie n celul, eliminnduse astfel
posibilitatea recombinrii sau a pierderii
insertului
Aceste plasmide conin dou gene, par A
i par B ce menin
numrul de 1-2 copii/celul.
Vectorii BAC conin: originea replicrii de
la plasmidele F ,
un situs de restricie multipl i mai muli
markeri de
selecie
Au fost creai n scopul mririi capacitii
de clonare a
insertului (300 kb).

 [Dezavantaje:

prezena n insert a unor

regiuni bogate n
AT sunt toxice pentru celula gazd E.coli
care ncearc s le
elimine.]

Aplicaii
Vectorii

BAC au fost utilizai la

construirea
librriilor genomice (colecii de
gene ale unui
genom ntreg)
Pentru descifrarea unui genom,
acesta este mai
nti fragmentat cu enzime de
restricie iar
fragmentele sunt clonate n
vectorii BAC.
Toate fragmentele dintr-un
genom formeaz

o librrie genomic. Fragmentele

sunt
recuperate si secveniate i
asamblate n
forma original sub forma unei
hri fizice
Vectorii (Cromozom Artificial de Drojdie)
pentru clonare n celule procariote
i/sau eucariote structura i
modalitatea de clonare i selecie a
clonelor recombinate care poart aceti

vectori

Vectorul de clonare YAC

(Yeast
Artificial Chromosome)
YAC sunt vectori e clonare artificiali care
fac posibil clonarea
Vectorii

unor fragmente mai mari de ADN n celule

bacteriene sau de drojdii.
Lungimea fragmentului de ADN ce poate fi clonat
n aceti vectori
este mult superioar vectorilor BAC: 0,2 2 Mb.
Genomul vectorului YAC n form liniarizat conine
urmtoarele
elemente:
A. Pentru clonare n drojdii (Sacharomyces
cerevisiae)
secvena Tel (telomere) la fiecare capt;
secvena CEN (centromer) responsabil cu
segregarea cromozomilor n
mitoz;
Originea replicrii ARS (pentru replicare
autonom) de la S.cerevisie
care permite replicarea vectorului n conformaie

liniarizat n
drojdii
un

marker de selecie pe fiecare bra pentru

detectarea i meninerea
vectorului YAC n celula de drojdie (cu genele TRP1
i URA3 care
necesit prezena adoi aminoacizi n mediu: triptofan
i uracil);

B. Pentru clonare n gazde

bacteriene:

Originea

replicrii (ori)
responsabil cu
circularizarea vectorului n
momentul
ptrunderii acestuia n gazde
bacteriene
de tip E.coli i un marker de
rezisten la
ampicilin (AmpR+).
Un situs de clonare multipl
care permite
introducerea genei pasager cu
ajutorul
mai multor enzime de restricie

Selecia clonelor
recombinate cu
vectorii YAC

drojdii: pe medii cu triptofan

i uracil
n bacterii: pe medii cu
antibiotic

Vectori virali pentru clonare n celule de mamifere

n scopul producerii animalelor transgenice.
Vectori adenovirali (SV40 Virusul Simian 40) i
vectori retrovirali (virusul Sarcomului Rous RSV). Elementele caracteristice

VECTORII VIRALI PENTRU

CLONARE N CELULE
EUCARIOTE/transgeneza
animal
I. ADENOVIRUSURI
Virusul SV40 sau Virusul
Simian 40 este vectorul cel mai
utilizat pentru clonarea genelor

n celulele mamiferelor. Este un

adenovirus
Virusul a fost izolat din
celulele renale provenite de la
maimuele Rhessus i
Cynomolgus.
SV 40 este un virus oncogen
ce producetumori maligne la
hamsteri i are capacitate de
transformare in vitro a celulelor
umane.

Genomul virusului
(Adenovirus)
este

constituit dintr-o molecul

de AND bicatenar, de form
circular, ce conine 5 gene.

ADN

viral codific cinci

proteine (VP1, VP2, VP3) ce se
gsesc ca i componente ale
nveliului capsidei n particula
matur (virion). Oncoproteinele
SV40 sunt AgT (long) i Agt
(short)
Replicarea

ADN viral ncepe cu

originea replicrii.
Citirea genelor se face ncepnd cu
punctul ori n dou direcii:
- spre dreapta ei, urmnd sensul
invers acelor de ceasornic ;
- spre stnga ei, n sensul acelor
de ceasornic.
n dreapta i n stnga locului care
marcheaz originea replicrii ADN
viral se gsesc genele care
controleaz replicarea ADN (timpurie
i trzie) i implicit transcripia.

Astfel, genele din partea dreapt a

regiunii ori se transcriu timpuriu i
controleaz sinteza ARNm timpuriu,
n timp ce genele din stnga regiunii
ori se transcriu tardive i controleaz
sinteza ARNm trziu
Din

regiunea trzie a
genomului SV 40 mai
fac parte: gena proteinei
principale de nveli a virusului
(VP1) i genele ce codific
proteinele minore de nveli,
denumite VP2 i VP3, ce se
gsesc n cantitate mic n
nveliul virusului.
Vectorii derivai din SV40 pot fi de
dou feluri:
Vectori

cu deleie n regiunea
trzie a ADN SV40 ;

Vectori

cu deleie n regiunea
timpurie a ADN SV 40.
Cele dou categorii de vectori
pot fi propagate n celulele
gazd numai n prezena ADN
provenit de la unele virusuri
ajuttoare (helper virus), care
asigur funcionarea regiunii
defective a genomului SV40 i
ncapsidarea AND recombinat.
ntotdeauna, virusul ajuttor
are regiunea defectiv contrar
regiunii defective din genomul
SV 40.
Vectorii construii din genomul
SV40 prin nlocuirea regiunii
timpurii cu gena strin

se propag n celulele COS

(celule care poart o regiune
stabil integrat a genomului
SV40), [ntruct antigenul T
produs de aceste celule asigur
iniierea replicrii ADN
recombinat prin legarea lui
la secvena - originea replicrii.

II. RETROVIRUSURI

Virusul sarcomul Rous

(RSV)

 RSV

este un retrovirus

Genomul

virusului este format din

ARN ce codific:
(1) enzima transcriptaza invers (pol)
care
determin transcrierea genomului
viral ARN n
ADNc,
(2)o capsid proteic (gag), (3) un
nveli extern
(lipoproteic-env) i (4) enzima
tirozinkinaza (src).
La capete se gsesc secvene
palindromice cu rol
de promotor i terminator (P i R)
Din genomul viral se nltura gena
src responsabil cu oncogeneza iar
n locul ei se introduce genapasager.
Alegerea gazdei i pregtirA pentru
primirea ADN recombinat

 Receptorul

sau celula gazd se

alege n funcie devectorul utilizat
astfel nct aceast sa l accepte,s
se poat multiplica n interiorul ei
(clonare) i nunele cazuri s permit
exprimareainformaieigenei pasager
(expresie).
Transferul

de gene n celulele
procariote -utilizeaz
vectorii: plasmidiali, fagii , cosmide,
BAC, sau
YACbiotehnologii
Transferul de gene n celule
animale -vectorii virali
de tipul SV40 sau RSV animale
transgenice

24. Receptorul (gazdele bacterine) gazdele

de tip EK1: caracterizare, mutaii

specific

Gazdele procariote bacteriene in

tehnologia AND
recombinat
In

tehnologia AND recombinat se utilizeaz

gazd bacteriena modificate genetic. Dintre
acestea fac parte tulpinile derivate din
bacteria E.coli si Bacillus subtillis.
ProprietilegazdelorEK1
Derivdintulina K12 a bacteriei E.coli
Gazdele EK1- gazdele E. coli (A) prezint mutaii
de tipul:
recA prin care bacteria prezint o sensibilitate
ridicat la lumina solar i la lumina UV astfel nct
supravieuirea nafara laboratorului este diminuat;
- thyA- este o mutaie prin care bacteria necesit
n mediul de cultur timin sau timidin necesare
biosintezelor proprii;
- amber mutaii ce determin suprimarea
sintezei unui anumit
produs prin introducerea prematur a unui codon
STOP;

-gal-pentru screeningul coloniilor transformate

dup culoare alb/albastru ce accept vectoriii din
seria pUC (de exemplu, tulpina DH5).
Clonarea ADN n celule gazd procariote i
transformarea bacterian: inducerea strii
decompeten la bacterii pentru acceptarea ADN
recombinat.

Etapa III. Clonarea ADN

recombinat
Exprimarea

genei pasager
necesit pe lng introducerea n
gazd, ca inseria n vector s fi
fcut ntr-un cadru de citire corect
pentru ca transcripia i translaia s
determine un produs proteic stabil.
Adica

fa de elementele genetice
ale unui operon in cazul gazdelor
bacteriene (P+SD....T).
Gena structural trebuie s fie
plasat sub controlul transcripional

al unui promotor unde ARN

polimeraza i ncepe funcia i un
situs de legare la ribozom pentru o
traducere eficient.

Introducerea ADN recombinat n

celule gazd
bacteriene/transformarea
genetic
Transformarea genetic este
un proces care apare natural la
unele bacterii, prin care acestea
primesc i accept molecule
exogene de ADN (de exemplu n
cazul transferal factorului de
fertilitate de la bacterii F+ la F-)
n tehnologia ADN recombinat
se transfer o molecul de ADN
recombinat (de la dou specii)

n celule bacteriene acestea

suferind un proces de
transformare genetic.

Metode de introducere a ADN recombinat

n celule gazd procariote: metodele fizice,
chimice imecanice

Inducerea strii de
competen

de transformare in vitro a
bacteriilor este precedat de
inducereaartificial strii de
Competene . Aceast stare depinde de unii
factori fiziologici cum sunt: faza ciclului de
diviziune celular, specia bacterian, etapa
fiziologic de cretere, mediul de cultur
Fenomenul

etc. Metodele de inducere a strii de

competen pot fi: chimice, fizice, mecanice
Prin tratarea celulelor bacteriene cu ioni
de calciu
(Ca2+) membrana celular devine
permeabil pentru scurt
timp pentru molecule strine. De
asemenea, ocultermic
(42oC) de scurt durat determin
creterea substanial
a numrului de celule aflate n stare de
competen, ceea
ce faciliteaz ptrunderea ADN recombinat
n celulele
receptoare.
Metodele mecanice de transfer a
genelor sunt
utilizate cu succes la bacterii, plante i
specii acvacole.
De aici fac parte: electroporarea i
metoda biolistic
Electroporarea este un fenomen de
inducere a

permeabilizrii membranei celulare sub

aciunea unui
cmp electric de scurt durat cnd
membrana celular
este strbtut de un cmp electric care
duce pentru
scurt durat la creterea dimensiunii
porilor prin care
ptrund moleculele de ADN exogen.
Pentru a nu leza membrana celular
diferena de potenial
aplicat se determin n funcie de tipul
celulelor, mrimea
i conformaia fragmentelor de ADN ce
urmeaz s fie
transferate.
De exemplu, valoarea maxim acceptat
pentru bacterii
este de cca. 25V/cm.

Electroporarea
Suspensia

celular este plasat

mpreun cu molecula de ADN

recombinat n cuvete de cuar

care sunt introduse n
electroporator dup ce au fost
setai parametrii aparatului.
Urmeaz inducerea ocurilor de
scurt durat pn la
ptrunderea ADN n celule. Dup
electroporare suspensiile
celulare sunt trecute pe medii de
cultur unde AND recombinat se
va multiplica mpreun cu gazda.

Selecia i analiza clonelor recombinate

(cu ajutorul markerilor). Detecia genelor
clonate i/sau aprodusului de sintez

SELECIAIANALIZA

CLONELOR RECOMBINATE
I.

Selecia clonelor recombinate cnd

vectorul este un
plasmid bacterian, cosmide, vectori de
expresie, vectori
BAC sau YAC trnsferati in bacterii
Selecia clonelor se face pe baza
markerilor de selecie prevzui la nivelul
vectorului i uneori i a genei pasager, pe
un mediu selectiv.
n cazul n care vectorul poart un
marker de rezisten launul sau mai multe
antibiotice selecia transformailor se
face pe medii cu antibiotice pe care cresc i
se dezvolt doar coloniile transformate.
n cazul n care markerul utilizat este
gena galactozidazei (LacZ) din operonul
Lac de la E. coli selecia celulelor

transformate se face prin teste histochimice

n prezena indicatorului X-gal.

II Selecia clonelor recombinate

cnd vectorul este un fag
(bacteriofag)
Transferul moleculelor de ADN
recombinat prin intermediul
bactreriofagilor (de tipul
fagului ) n celulele procariote
se realizeaz prin transducie ,
rezultnd celule bacteriene
modificate genetic, n care
evidenierea genei pasager se
face la nivelul plajelor de liz.
DETECtIA GENEI CLONATE I A
PRODUSULUI DE SINTEZ
- identificarea genei prin
tehnici de hibridare (metoda
Southern blotting);

analiza secvenei
nucleotidelor pasageruluiexcizat
din vehicul (secvenierea);
- excizia genei pasager din
vehicul pe cale invers clonrii,
migrarea n gel de agaroz
i detecia ei pe baza greutii
moleculare.
- detecia rapid a produsului
de sintez a genei pasager cu
ajutorul moleculelor reporter
(GFP, YFP, gena LacZ din
operonul lac de la E. coli,
luciferaza etc

Aplicaiile tehnologiei ADN

recombinat: n bioindustrii:
industria farmaceutic,
industria alimentar i n
bioremediere
Transferul de gene n
celulele procariote este o
aplicaie a biotehnologiilor
moderne cu care se produc
astzi cantiti mari de
biomolecule utilizate n
medicin i farmacie,
protecia mediului i
industria alimentar.
Avantajele biotehnologiilor:
- bacteriile n care se
produc

biomoleculele cresc n spaii

restrnse n cantiti foarte
mari (bioreactoare
2.- sunt lipsite de virusuri i
patogeni care ar putea fi
transferai la om
3. - se pot produce n timp
scurt, n cantiti foarte
mari (ciclul celular foarte
scurt la bacterii)
Exemple de produse farmaceutice
comerciale obinute prin clonare de
expresie n microorganisme
Boala creia i se adreseaz
Factor de coagulare VIII Hemofilia A
Factor de coagulare IX
Hemofilia B
Eritropoietina
Anemii
Insulina
Diabet
Hormon de cretere
Maladii produse de deficiene n GH
Activatorul de plasminogen tisular
Afeciuni trombotice
Vaccinul mpotriva hepatitei B
Hepatite tip B
Interferon
Reticuloendoteliozele leucemice
hepatite cronice
Interferon-
Scleroze multiple
Interferon - Infecii ale pacienilor cu boli
cronice

granulomatoase
Interleukina-2
Carcinoame ale celulelor
renale
Factor de stimulare a coloniilor
granulocitare (G-CSF)
Neuropenii post-chimioterapie

Dezoxiribonucleaze

Fibroza chistic

Industria alimentar:
vanilina
Bioremediere: anumite
plante sau bacterii pot
degrada n mod natural
diferite substane chimice,
metale grele sau uleiuri.
n anul 1980 a fost
produs prin recombinare
prima superbacterie
care poate degrada
hidrocarburi

fost obinut prin

transferul a 4 plasmide (Tol)
de la diferite bacterii
ntlnite n mod natural la
suprafaa produselor
petroliere. 2010 prima bacterie
cu genom sintetizat artificial introdus
n Mycoplasma mycoides enucleat,
(Synthya) obinut la Craig Venter
Institute
Utilizri - dezvoltarea de aplicaii
pentru: bioremediere
creterea eficienei de extracie a produselor
petroliere
producerea de combustibili bio
producerea de vaccinuri
In prezent acelasi institul lucreaza la
rescrierea enomului de porc pentru obtinerea de
organe umane destinate transplantului, prin
intermediul geneticii sintetice

Transferul genelor ncelule eucariote

nvederea obinerii animalelor transgenice.
Definitie, scop,etape. Obinerea constructului
genic i metodele de obinere a animalelor
transgenice.

Transferul ADN
recombinat n
celule de mamifere
Tehnicile de manipulare genetic se
mpart n:
Tehnici de manipulare a genelor (a
ADN) n vederea obinerii de
animale transgenice;
Tehnici de manipulare a genoamelor
n vederea clonrii animalelor

Prin

transferul genelor in vivo n

celule animale somatice vorbim de
terapie genic iar prin transferul
genelor n celule germinale (gamei)
se obin animale transgenice.

Transgeneza animal

Transgeneza

animal const n
adugarea unei gene strine n
interiorul genomului unui organism
viu, inactivarea unei gene (animale
knockout) sau nlocuirea foarte precis
a unei gene endogene cu alt gen[Pentru a putea fi nlocuit o
gen defectiv de la un organism
are loc un proces de
recombinare omoloag (ntre
gena defectiv i cea normal)
care poate conduce la
inactivarea genei mutante sau la
nlocuirea ei cu gena normal.]

Scopul transgenezei
animale
n

agricultur ameliorarea
produciilor animale;

Obinerea

de exemplare mai mari

i cu cretere rapid sau cu o
producie superioar
n medicin - producerea de
proteine umane n laptele animalelor
transgenice;
studierea unor boli umane (animale
model);
inactivrii unei gene (animale knockout);
producerii de organe (inim,
rinichi, plmni etc.) n vederea
xenotransplantrii i de celule
pancreatice, hepatice n animale
transgenice destinate transplantului la
om.
n industrie, de exemplu obinerea
de capre transgenice care produc
pnz de pianjen pentru materiale
rezistente

Etapele transgenezei
1.

Obinerea constructului genic

format din gena (genele de

interes) ielemente de reglaj ale
genei
2 Transferul genei n pronucleul
celulei ou (prin microinjecie)
3 Cultivarea zigotului in vitro pn
nstadiul embrionar - n funcie
de specie
4. Transferul embrionilor n femele
Receptoare

Obinerea constructului
genic
Primul

pas n realizarea transgenezei

animale este obinerea constructului
genic format din gena structural i
segmentele cu funcie de reglare.
Exprimarea eficient a genei
structurale n genomul gazd presupune
plasarea sa ntr-un cadrul de citire
corect fa de elementele reglatoare:
transgena este

situat ntotdeauna n aval de elementele

promotor specifice gazdei sau analogi ai
acestora i este urmat de secvena
pentru sinteza cozilor poliA

Transferul genei strine n

vederea obinerii de animale
transgenice
Metode

de transfer a genei pasager:

1. Microinjecia
Eficiena de obinerea a
animalelor transgenice prin
aceast metodeste de 515%, cu mult superioar altor
metode.
Cel mai frecvent au fost
transferate prin microinjecie
genele n pronucleii oulor
fertilizate, dar transferul poate fi
realizat i n embrioni.

Microinjecia a fost metoda

dezvoltat prima dat pentru
obinerea oarecilor transgenici
i este utilizat azi att la
mamifere ct i la peti.
Metoda presupune utilizarea
unei micropipete prin care se
introduce un ac foarte fin din
sticl.
Oule fertilizate sunt strpunse
prin membrana de micropipet prin
care se introduce acul, urmnd
injectarea unei soluii tampon n
care se gsesc 106-107 copii ale
constructului genic.
Acul este ndeprtat iar oule se
incubeaz pn la realizarea
primelor diviziuni mitotice/
embrionilor, urmnd transferul lor
n mame receptoare.

2.

Transferul genelor prin

intermediul vectorilor virali (adeno i
retrovirali)
3. Transferul genelor prin
intermediul celululor stem embrionare
4. Transferul genelor mediat de
lipozomi pentru transgeneza n
mas (la specii acvacole)
5. Metode mecanice pentru
introducerea ADN-ului n
embrioni :metoda biolistic
i electroporarea (la specii acvacole)

Metoda biolistic
este

aplicat n special la plante,

dar i la speciile acvacole
cumembran corionic dur, pentru
obinerea de specii transgenice.
Metoda presupune bombardarea
celulelor int, cu particule acoperite
cu ADN.

ADN

este depus pe suprafaa unor

bile (miniproiectile) de dimensiuni
foarte mici (1m) din aur sau tunsgen
i apoi sunt mpucate cu un dispozitiv
special n icre sau n celulele
plantelor.
Peretele celular foarte dur poate fi
strbtut astfel de aceste
microproiectile care transport ADN
exogen n celul,

Realizri ale transgenezei animale n

agricultur animale transgenice pentru gena
hormonului de cretere. Exemple ale
transgenezei animale la ovine i la taurine.

Realizri ale transgenezei

animale la diferite specii
I Aplicaii n agricultur

Istoric:
Prima

realizare a transgenezei
animale a fost fcut n anul
1982, cnd Palmiter i
colaboratorii si au obinut
primii oareci transgenici ce
exprimau gena hormonului de
cretere de la obolan.
Zigoii de la oareci care
prezint nanism (genotip Lit.Lit),
au fost injectai cu molecule de
ADN recombinat format din
gena hormonului de cretere de
la obolan fuzionat cu
promotorul genei metalotioninei
de la oarece
s-au obinut oareci gigani ce
aveau greuti de 2 - 3 ori
mai mari dect oarecii pitici
(lit.lit).

Au

fost testate mai multe metode

ns cea mai eficient a fost
microinjecia n pronucleii oulor
fertilizate.

pentru transmiterea
transgenei n descenden a
fost necesar ca transferul s
fie fcut foarte rapid,
naintea primei diviziuni a
zigotului.
Transgena a fost gsit att
n celulele somatice ct i n
gameii de oareci
transgeniciintegrarea stabil
transgenei
n cazul transferului dup
prima diviziune mitotic
transgena se integreaz doar n

anumite esuturi rezultnd

organisme mozaic (cu esuturi
transgenice i netransgenice).

Realizri ale transgenezei

Animale

transgenice pentru
hormonul de cretere (GH)
Primele realizri ale
transgenezei la animalele de
ferm
Gena ce codific GH
preluat de la diferite
specii a fost transferat n
zigoi de iepuri, porci i oi
Alegerea genei GH ca
transgen prezena ei n
genom poate fi detectat i

fenotipic printr-o cretere mai

accelerat i un nivel crescut
al hormonului n circulaie.
- importan economic
exemplare mai Mari
Randamentul

la

animalele
de ferm a fost unul sczut,
mult mai redus dect la oareci,
doar1 din 200 ou fertilizate i
injectate au produs animale
transgenice
Rezultate interesante s-au obinut la
porci prin transferul genei hGH condus
de promotorul metalotioninei.
Prin legarea genei pasager la acest
promotor exprimarea GH n porcii
transgenici are loc atta timp ct n
alimentaia lor este prezent
zincul deoarece promotorul

metalotioninei legat de gena GH va

induce sinteza hormonului.
Ovine transgenice pentru GH care
cresc mai repede i au greuti
superioare au fost obinute tot
prin transferul genei hormonului
de cretere de la alte specii
fuzionat la promotorulmethalotioninei
; S-a obinut i un procent mai
redus de grsime n carcas i o carne
mai slab.
Aproape toate speciile acvacole au
fost modificate genetic pentru gena GH

Ovine transgenice pentru

producia de ln
n

experimentele de transgenez la
oi s-a urmrit obinerea de exemplare
cu ln de calitate superioar. n
acest scop s-au ncercat mai multe
strategii care vizeaz aminoacizii cu
S:

A)-

transferul de gene ce codific

cisteina de la bacterii n genomul
oilor.
Prin sinteza cisteinei n animalele
transgenice se mbuntete procesul
de cretere a lnii.
B)- transferul de gene la nivelul
microflorei ruminale reprezentat de
Bacterioides, Ruminococcus etc. poate
mbunti eficiena de degradare a
substratului celulozic din hran i
sinteza de aminoacizi cu sulf necesari
sintezei firului de ln;
C)- Modificarea plantelor furajere
n scopul mbuntirii coninutului n
aminoacizi cu sulf necesari sintezei
keratinelor.

Vaci transgenice
Obinute

prin microinjectarea ADNului strin n pronucleul unui zigot

care a fost cultivat in vitro pn la
stadiul de morul sau blastocist i
apoi transferat la o mam adoptiv.

Din

1000 zigoi injectai cu ADN sau dezvoltat 129 de embrioni care au

fost transferai la vaci.
Din 19 viei nscui, doi au coninut
ADN-ul strin integrat n genomul lor
Strategii de transgenza la taurine:
a)adugarea de gene pentru
modificarea compoziiei laptelui
B) supraexpresia unor gene
C) inactivarea unor gene
1. Adugarea n compoziia laptelui de
compui cu activitate antimicrobian cum
este lizozimul, a fost posibil prin
transferul genei ce codific lizozimul
(1) de la om la capr n vederea
studierii expresiei acestei gene n
laptele de capr.
Vaci transgenice destinate s
exprime lizozimul uman la nivelul
glandei mamare (expresia genei a fost
la 68% fa de compoziia laptelui
de mam, respectiv 270 g/ml)

alt protein produs n animale

transgenice este lactoferina (2).
Lactoferina uman din laptele
matern are rol n transportul fierului i
n protecia tubului digestiv la nounscut.
Poate fi secretat n laptele de vac
n urma transferului acestei gene de la
om. Lactoferina este foarte sensibil
la cldur i ca atare pasteurizarea
laptelui destinat consumului uman
i anuleaz efectul (L. M. Houbedine,
1997).
Au fost produse vaci transgenice
pentru rezisten la infecia cu
Staplhylococcus aureus la nivelul
glandei mamare (mastita) prin
transferul genei ce codific
lysostaphinul (3)

2. supraexpresia unor compui cum

sunt proteinele din lapte:
Laptele conine cantiti mari
de proteine cum sunt cazeinele (1),

- lactoglobulinele(2) sau proteina

acid din zer (3)(codificat de gena
WAP).
Producia acestor proteine este
reglat de promotori care
limiteaz expresia lor doar
n celulele glandei mamare.
n vacile transgenice
componenii proteici
se supraexprim rezultnd un
lapte cu coninut mai mare de
proteine.
3. Inactivarea unei gene:
producerea de lapte fr lactoz
(1) destinat persoanleor cu
alergie la lactoz sau a unui
lapte cu coninut sczut de
grsime

Aplicaiile transgenezei animale n medicin:

animalele knock-out i xenotrasplantarea,
animalele model pentru studierea bolilor,
producerea de proteine recombinate n laptele
animalelor transgenice etc

Xenotransplantarea
producerea de organe destinate
transplantului la om Porcii sunt
animale optime pentru
producerea de organe destinate
xenotransplantului la om.
Recent au fost obinui porci
transgenici knock-out (prin
scoaterea din funcie a unei
gene responsabile de rejecia de
organ). Astfel pot fi adugate
sau ndeprtate proteinele
rspunztoare de apariia
rejeciei la i de la donor sau
receptor

Animale model sunt produse pentru

studierea bolilor umane cercettorii de

la Univ. Harvard au reuit obinerea unui
oarece model OncoMouse care
poart o gen responsabil de
dezvoltarea diferitelor forme de
cancer la om.
Alte animale model produse: oareci
transgenici pentru studiul
retinoblastomului (form a
cancerului de ochi la copii);
oareci model pentru studiul
demielinizrilor la nivelul sistemului
nervos prin transferul unei
gene de la un papovavirus;
au fost produi porci transgenici
pentru studiul ateroscleozei
umane; oareci transgenici pentru
studiul scrapiei la oi; iepuri
transgenici pentru studiul
hipercolesterolemiei la om;

3. Animalele transgenice pot funciona

ca bioreactoare ce vor produce nivele
ridicate de proteine sau hormoni, n
laptele lor (Watson i colab., 1992).
Genele de interes sunt legate la
promotorul - actoglobulinei care este
activ n celulele glandei mamare unde
se va exprima alturi de gena
clonat.Un animal transgenic poate
produce pn la 8000 l lapte pe an din
care pot fi extrase 40-80 kg proteine
active.
n lapte pot fi produse diferite
biomolecule cu aplicaie n medicin
i industria farmaceutic .
Astfel de exemple sunt producerea
unor proteine ctive cum este factorul
IX de coagulare, interleukina 2,
activatorul de plasminogen tisular,
urokinaza etc.

Aplicaiile animalelor transgenice n

industrie.

n 2001, doi oameni de tiinta

de la compania Nexia
Biotehnologii (Canada) au reuit
obinerea de capre transgenice
prin transferul genei ce codific
formarea firul de la pianjen.
Caprinele au nceput s fabrice
firul de mtase att n lapte ct
i pe corp. Prin extragerea
polimerilor din lapte i a fibrelor
din esut acestea pot fi ulterior
prelucrate n fire flexibile dure,
din care pot fi fabricate uniforme
militare, microsuturile medicale
sau plasele la rachetele de tenis.
Animalele transgenice pot funciona
ca bioreactoare ce vor produce nivele
ridicate de

proteine sau hormoni, n laptele lor

(Watson i colab., 1992).
Genele de interes sunt legate la
promotorul - lactoglobulinei care
este activ n celulele glandei
mamare unde se va exprima alturi
de gena clonat.Un animal transgenic
poate produce pn la 8000 l lapte pe
an din care pot fi extrase 40-80 kg
proteine active.
n lapte pot fi produse diferite
biomolecule cu aplicaie n medicin i
industria farmaceutic .
Astfel de exemple sunt producerea
unor proteine active cum este factorul
IX de coagulare, interleukina 2,
activatorul de plasminogen
tisular, urokinaza etc.

Realizri ale transgenezei animale la peti i

alte specii acvacole. Precauii impuse de
trangeneza animal la speciile acvacole.

Gene pasager de intereseconomic la

specii acvacole
Gena hormonului de cretere
prelevat de la om, obolan, vac, somon
chinook, pstrv curcubeu, tilapia etc.,
n scopul creterii vitezei de
dezvoltare i a obinerii unor greuti
superioare
Gena de rezisten la nghe (AFP
antifreeze protein de la, merluciu,
Macrozoarces americanus) n scopul
creterii speciilor n zone nordice
Creterea rezistenei la boli i
duntori prin transferul genelor ce
codific interferonul, cecropinele
(antibacteriene), lisostafinul etc de la
alte specii

Constructul genic
Este

format din gena/genele

structurale i regiunile cu rol de reglaj
(promotori, secvene de legare la
ribozomi iu terminatori)
Promotori care au dat rezultate
bune la speciile acvacole prin
integrarea stabil a genei n
genom:
- genele omoloage Hox de la
oarece i om
-secvenele LTR de la virusul
sarcomului Rous
Secvene de la virusurile
primatelor (SV-40 i citomegalovirus)

Genele reporter n
transgeneza la peti
Pentru

evidenierea integrrii transgenei

n genom se utilizeaz gene reporter care
pot fi detectate uor i care sunt fuzionate
cu transgena obinndu-se un produs de
fuziune ntre gena reporter i transgen

Gene reporter:
1) Genele GFP,

YFP, RFP (green, yellow,

red fluorescente protein ) de la meduza
Aequorea victoria, pot fi identificare
direct n lumina UV
2) gena ce codific luciferaza de la
licurici (Phoetinus pyralis)
3) gena beta galactozidazei/identificare
pe medii cu lactoz n prezena indicatorului
X-gal

Metode de transfer a genelor

la peti
Microinjecia prin transferul de plasmide
recombinate n icre fecundate - are
eficien destul de redus (cca 1%- 20%).
A fost aplicat la crap, pstrv, somon,
tilapia, tiuc, fintinel, etc. Cele mai bune
rezultate - la petele zebr i la medaka

Electroporarea rezultate bune la

scoici. Transferul genelor mediat de
sperm transgenele sunt depuse
pe suprafaa spermatozoizilor sau
sunt introduse n spermatozoizi prin

elecroporare. Rezultate sczute la

peti.
Metode

biolistice - aplicate la
scoici i peti dar cu randamente mai
sczute dect microinjecia.
Transferul genelor cu ajutorul
vectorilor virali rezultate bune
obinute cu vectorii Virusul
sarcomului Rous i virusul Simian 40
(SV+40) dup transfecia
spermatozoizilor sau a icrelor

La peti i specii acvacole este

preferat metoda de transgenez
n mas prin intermediul
lipozomilor, n care transgenele
sunt nglobate n lipozomi

Realizri ale transgenezei la

specii acvacole
Somonii

de Pacific (genul
Oncorhynchus) transgenici pentru GH
la Onchorynchus kisutch (coho) a
fost ransferat gena GH de la O.
nerka (sockeye) condus de
promotorul metalotioninei.
S-au nregistrat creteri n
greutate n medie de 11 ori mai mari
comparativ cu specia slbatic.

Peti tilapia transgenici Pentru

mbuntirea ritmului de
cretere la tilapia au fost
efectuate numeroase experiene
de transgenez ce au vizat
transferul genei hormonului de
cretere fie de la somonul
coho, fie de la om.

n toate cazurile experimentele

au dus la integrarea stabil a

transgenei n genomul gazdei i la
transmiterea n descenden
dup schemele mendeliene
Precauii impuse de prezena petilor
transgenici n cresctorii
Pasajul accidental n ruri
Modelele transgenice destinate
studiului de laborator sunt dezvoltate
pe specii de origine tropical
(medakas, petele zebr) care
necesit temperaturi ridicate pentru a
supravieui i a se putea reproduce.
Astfel, pasajul accidental n
habitate naturale nu poate avea
dect efecte limitate sau tranzitorii n
apele zonei temperate sau a celei
reci.

Prdtorismul psrilor - poate fi

eliminat

prin amplasarea de plase de

protecie.
Alte msuri de precauie la
speciile acvacole transgenice
sunt:
sisteme de cretere nchise, riscuri
mai ridicate pot fi nregistrate la
creterea petilor transgenici n
sisteme seminaturale.
sistemele de tratare a apei etc, prin
care se poate evita pasajul
speciei transgenice n ape
naturale.

Producerea de peti
transgenici sterili
La

majoritatea speciilor transgenice

acvatice fecunditatea este cel mai
important factor de risc pentru
diseminarea transgenei, deoarece
numrul de ou depus de o specie

acvatic variaz de la cteva sute ou

pe kg (tilapia) la 1500-2000 la
salmonide i la cteva sute de mii la
speciile marine.
Dac aceast fecunditate se traduce
prin producia de ou transgenice (un
stoc genetic identic), aceasta se traduce
i printr-o posibilitate mult mai ridicat
de diseminare a transgenei n populaia
slbatic.
Modelul matematic Muir- explic
dispariia ambelor specii n 40 de
generaii dac specia slbatic ajunge
n competiie cu specia transgenic

laboratoarele de la INRA Frana

s-a dezvoltat o metod de sterilizare
prin dubla transgenez.
Metoda se refer la transferul
genei de interes pentru obinerea de
peti transgenici i, n plus,
inactivarea unei gene ce codific un
factor
n

cerebral implicat n controlul

reproduciei care las funcionale
gonadele.
Metoda dublei transgeneze duce
la obinerea de animale sterile dar
care produc tranzitoriu sperm ce
poart caracterul de sterilitate.

Clonarea animalelor prin

transfer nuclear: clonarea

embrionar

Clonarea animalelor
punct de vedere biologic, prin clon
se poate nelege:
un grup de indivizi identici din punct de
vedere genetic, rezultai de la acelai
printe prin reproducere asexuat.
Reproducerea asexuat este ntlnit n
mod natural la organismele inferioare
Din

unicelulare (bacterii, protozoare, alge,

ciuperci microscopice), nevertebrate
coloniale (hidre, madrepori etc.) sau n
lumea vegetal.
un grup de celule identice genetic cu
celula mam rezultate n urma diviziunii
mitotice. Diviziunea mitotic este
caracteristic celulelor somatice n care
dintr-o celul cu 2n cromozomi rezult 2
celulele fiice cu acelai numr de
cromozomi i aceeai informaie genetic
cu celula original. o populaie de

molecule de ADN identice produse

de bacterii sau virusuri care au primit
prin tehnici de biologie molecular
(tehnologia AND recombinant) un
fragment de ADN strin poart
numele de clone ADN.
producerea de animale identice
genetic prin secionarea unui embrion
tnr. Un embrion tnr este un
embrion la care celulele nu sunt
nc difereniate n celule epiteliale,
hepatice, musculare, nervoase etc.

La vac, dup secionarea

embrionului n stadiul de 4-8 celule,
fiecare fragment embrionar
transplantat ntr-o mam adoptiv a
dat natere unui viel, toi produii
rezultai fiind identici din punct de
vedere genetic (clone). Procedeul se
practic cu succes la vac de mai
bine de 10 ani dar se obin foarte
puini descendeni identici (2-3).
Producerea unuia sau mai multor

animale identice din punct de

vedere genetic prin transferul
nucleului unei celule
somatice de adult sau de
embrion ntr-o ovocit
enucleat.
Aceast
tehnologie(transferul

nuclear ) a strnit cele mai

multe controverse dup ce n
1996 a fost obinut oaia
Dolly (Wilmut i colab., 1997)
prin transferul nucleului unei
celule somatice de adult.

Clonarea animalelor prin

transferul nuclear
Clonarea

animalelor prin
transfer nuclear se poate realiza
prin dou metode:
a) Clonarea embrionar
b) Clonarea unui individ adult

Clonarea embrionar
transferul

unor nuclei diplozi (2n)

prelevai din celule embrionare (n stadiul
de 8, 16, 32 sau 64 celule) n ovocite
enucleate.

1954 Robert W. Briggs i Thomas

King au reuit obinerea de broate adulte,
iar n 1980 tehnica a fost utilizat pentru
clonare la vac i la oaie prin transferul
nucleului din celulele unui embrion tnr. n
1995, Ian Wilmut i Keith Campbell
mpreun cu colaboratorii lor de la Institutul
Roslin (Edinburgh) obin primii miei vii
(Megan i Morgan) pornind de la nucleii
celulelor derivate din embrion cultivate mai
multe sptmni n laborator.

Etape de lucru
Clona

se obine pornin de la un singur

embrion
Din aceste celule se extrag nucleii;
n paralel se utilizeaz ovocite enucleate
receptoare, prelevate din ovare de la
abator.
Nucleul diploid (2n) al celulei embrionare
este transferat
n ovocita enucleat i apoi fuziunea se
face cu stimuli electrici.
Noul ou (zigot) cu 2n cromozomi se
divide i poate fi transferat n uterul unei
femele receptoare.

Randamentul

clonrii embrionare la
mamiferele domestice este nc foarte slab:
circa 5% la bovine i iepure deoarece
aproximativ 30-40% din oule
reconstituite se dezvolt pn la stadiul de
cteva celule dup care apare moartea n
diferite stadii ale dezvoltarii ontogenetice.
Au fost clonate prin aceast metod
oaia, vaca, porcul, iepuroaica i pastrvul.

Clonarea animalelor prin transfer

nuclear: clonarea unui individ
adult

Clonarea unui individ

adult
Clonarea

unui individ adult presupune

transferul unor nuclei diploizi prelevai din
celulele somatice de individ adult, n
ovocite enucleate nefecundate.

Depirea

impedimentului prezentat de
faptul c n celulele adulte doar o mic
parte din gene se exprim,
restul fiind inactive, s-a realizat prin crearea
condiiilor de stopare a ciclului celular al
celulelor somatice donoare n faza Go
n faza Go celulele se afl n starea de
repaus naintea pregtirii unei noi diviziuni
mitotice.
Intrarea n faza Go s-a realizat prin
nfometarea celulelor aflate n culturi n
care s-a redus serul fetal de viel.

Cum a fost clonat oaia

Dolly ?
Celulele

donoare de nuclei:

1. au fost recoltate celule din epiteliu

glandei mamare al unei oi din rasa Finn
Dorset (cu capul alb) aflat n ultimul
trimestru de gestaie, cnd celulele prezint
un grad maxim de difereniere i se
multipic activ;
2. celulele au fost cultivate n laborator
cinci zile pe un mediu complet, dup care

au fost trecute pe un mediu srac pentru

nfometare i intrarea lor n faza ciclului
celular Go. Aceste celule au numrul de
cromozomi 2n.
3. de la aceste celule s-au recoltat nucleii
cu ntreaga zestre ereditar i o parte din
coninutul citoplasmatic

Celulele receptoare:
1. ovocitele au fost recoltate chirurgical de
la o oaie din rasa Scotish blackface (cu cap
negru). Aceste celule sexuale au numrul
de cromozomi redus la jumtate.
Nucleul lor i globulul polar adiacent s-au
extras cu pipeta rezultnd un carioplast,
supus iradierii pentru inactivarea genomului
mitocondrial.
2. Fuziunea nucleului cu ovocita enucleat:
nucleii celulelor glandei mamare au fost
transferai n ovocita enucleat;
celulele ou astfel manipulate au fost
stimulate electric pentru a permite fuziunea
nucleului (2n) cu citoplasma celulei
receptoare;

n urma electrofuziunii celula ou a nceput

s se divid mitotic.(rezultnd un
blastocist);

Transferul blastocistului n mama

receptoare:
Blastocistul a fost transferat ntr-o
oaie receptoare i astfel s-a nscut
prima oaie clonat din celule
somatice de adult oaia Dolly.
Oaia Dolly este copia fidel a oii
din rasa Finn Dorset (cap alb) de la
care s-a prelevat nucleul cu ntreaga
zestre genetic .

Hibridareaicibridareacelulel
orsomatice definiie, mod de
realizare, selecia celulelor
hibride

Hibridarea celular
Tehnicile de inducere a
fuziunilor celulare

aplicate la om, animale i plante

s-au
dezvoltat foarte mult n ultimii
ani, datorit
aplicaiilor pe care le au hibrizii
celulari n
medicin, zootehnie i
agricultur.

Definiie

Tehnica hibridrii celulelor

somatice
presupune:

realizarea spontan sau

indus a unei

fuziuni ntre dou (sau mai

multe)
celule somatice diferite
rezultnd o
celul hibrid care nglobeaz
cromozomii celulelor parentale.

Istoric

n 1960, n Frana, G. Barski i colab. au

realizat culturi
celulare mixte cu dou linii celulare de
oarece, una
avnd numrul modal (majoritar) de 55
cromozomi i alta
cu 62 cromozomi, constatndu-se c celulele
hibride
nglobeaz aproximativ cromozomii celor
dou linii, avnd
115 - 116 cromozomi.
Prima mbuntire tehnic a metodei de
hibridare, avnd
ca scop principal mrirea frecvenei celulelor
care

fuzioneaz, a fost realizat de ctre

cercettorul japonez
Y. Okada, n anul 1962.
El a constatat c prin adugarea la cultura
celular mixt
a virusului Sendai inactivat cu ajutorul
radiaiilor UV,,
fuziunea ntre celule se realizeaz cu o
frecven mult mai
mare.
Ali ageni inductori ai fuziunii celulare,
descoperii
ulterior, sunt polietilen-glicolul, virusul
leucozei bovine,
ionii de calciu (Ca2+), derivai ai unor lipide,
electrofuziunea etc.

Hibridarea poate fi:

- intraspecific, cnd se poduce
ntre celule diferite aparinnd
aceleeai
specii (de exemplu ntre limfoblast x
fibroblast murin);
- interspecific, cnd se

realizeaz ntre celule aparinnd

unor specii
diferite (de exemplu: om x oarece,
oarece
x gin, obolan x oarece, om x
nar,
eritrocite de gin x protoplati de
drojdie,
celule umane de tip Hela x protoplati
de
morcov, celule tumorale umane x
protopati
de tutun etc.).
Fuziunea se poate produce ntre dou
sau mai
multe celule de acelai fel, astfel c apar
celule ce
nglobeaz cromozomii de la dou sau
mai multe
celule de acelai fel, celule denumie

homocarioni.

Dac fuzioneaz celule diferite atunci

se formeaz
celule cu cromozomi de la doi sau mai
muli nuclei
diferii i care poart denumirea de

hetrocarioni.
Celulele hibride sunt produse doar
de heterocarioni.

Aceti heterocarioni fie nu se divid i

dispar sau
ncep s se divid i nucleii lor
fuzioneaz dnd
natere unor celule hibride
mononucleate.
Celula mononucleat care
nglobeaz
materialul genetic al ambelor linii
parentale
este un sincarion sau o celul

hibrid

ZOLAREA CELULELOR

HIBRIDE
Etape: distribuirea celulelor din
cultur,
imediat dup fuziune, n plci de
cultur cu
96 godeuri, deoarece fiecare
heterocarion va
da natere unei clone celulare
hibride.
La circa dou sptmni godeurile
se
examineaz la microscop pentru a se
constata proliferarea clonal a
celulelor
hibride.
metode principale de izolare a
celulelor
hibride:
Metoda neselectiv i izolarea
selectiv

Izolarea neselectiv este o

metod foarte
laborioas, nu se utilizeaz n mod
curent n
practic, deoarece presupune
identificarea
morfologic a celulelor hibride i este
posibil atunci cnd ntr-o anumit
cultur,
proporia celulelor hibride formate
este mare
comparativ cu cea a liniilor parentale,
iar
hibrizii au potenial proliferativ mai
bine
exprimat fa de oricare din celulele
parentale.

Izolarea selectiv
Izolarea selectiv:

se bazeaz pe utilizarea unor

medii de
cultur selective, care
favorizeaz
proliferarea celulelor hibride i
inhib
creterea sau chiar omoar
specific celulele
parentale. Un astfel de mediu
selectiv este
mediul HAT, n care celulele
hibride triesc
i se multiplic, n timp ce
celulele
parentale sunt eliminate.

38. Aplicaiile hibridrii

celulare: Cartografierea

genelor cu ajutorul hibrizilor

celulari

Aplicaiile celulelor
hibride

celulele hibride pot fi utilizate

pentru:
cartarea genelor,
studii asupra replicrii
cromozomilor la
hibrizi,
studii asupra hibridrii
celulelor
mutante,
producerea de anticorpi
Monoclonali
Aplicaiile hibridrii
celulare

I.CARTOGRAFIEREA GENELOR CU
AJUTORUL HIBRIZILOR CELULARI
a fost demonstrat ntia oar n
studiile
efectuate asupra hibrizilor dintre
celule
umane i celule de oarece.
1967, cercettorii francezi B.

Ephrusi, M.
Weiss i E. Green au descoperit c
prin
cultura celulelor hibride timp
ndelungat se
observ eliminarea preferenial a
cromozomilor unei specii.
n cazul celulelor hibride om x oarece are
loc
eliminarea cromozomilor umani , fenomen
care a
fost apoi folosit cu succes pentru ntocmirea
hrii

genetice la om, adic pentru plasarea

genelor n
anumite locusuri pe cromozomii umani.
Etapele metodei pentru
cartografierea
genelor umane :
se realizeaz hibrizi celulari om x oarece
i se
cultiv celulele hibride timp mai ndelungat
pentru
ca ele s elimine cromozomi umani.
Folosind diferite medii selective, se
selecioneaz
celulele hibride care conin toi cromozomii
de
oarece i numai cte un cromozom uman
(cromozomul 1,2,3,........23
Pentru obinerea hibrizilor celulari om x
oarece
au fost utilizate celule de oarece TK(rezistente
la 5-bromdeoxiuridin) .
Din cauza deficienei lor enzimatice,
celulele de

oarece nu se puteau dezvolta n mediu

HAT
(hipoxantin, aminopterin i timidin).
Hibrizii celulari care conineau gena
uman TK+
pentru enzima timidin-kinaz au fost
capabile s
se dezvolte n mediu HAT i s-a observat c
un
cromozom uman specific a fost reinut n
celulele
hibride (care au continuat s se dezvolte n
acest
mediu).
Cromozomul uman reinut i a crui
prezen a
fost asociat cu capacitatea hibrizilor de a
dezvolta n mediu HAT, a fost cromozomul
numrul 17, ceea ce a indicat c gena
uman
care controleaz sinteza enzimei timidin kinaza
(TK) este localizat pe acest cromozom.

In mod similar, prin hibridarea

celulelor
umane cu celulele de oarece
HGPRT,rezistente la 8 azaguanin , s-a
observat
c hibrizii celulari rein cromozomul
uman
X i pot fi selecionai n mediu HAT.
Acest lucru indic faptul c gena
uman
care controleaz sinteza enzimei
HGPRT
este localizat pe heterozomul x

39. Aplicaiile hibridrii

celulare: Sinteza de anticorpi
monoclonali cu ajutoul
celulelor hibridoma.
Anticorpii sunt substane proteice
sintetizate de organismul animal,
care au capacitatea de a se cupla n
mod specific cu anumii
determinani antigenici.
O molecul de antigen fiind
purttoarea mai multor determinani
antigenici, (diferii chimic), nseamn
c mpotriva ei organismul produce
molecule de anticorpi cu mai multe
specificiti diferite.

Tesutul limfoid asigur protecia

organismului prin dou
mecanisme de aprare:
a) imunitatea umoral prin
anticorpi;
b imunitatea de tip celular (cu
ajutorul limfocitelor T-celule
ucigae).

Se cunosc populaii variate de

limfocite cu caracteristici funcionale
i structurale
diferite. Unele, denumite limfocite B precursorii plasmocitelor sunt
celulele care sintetizeaz anticorpi.

Limfocitele T

limofocite T, au mai multe

subpopulaii, unele cu rol
efector, ndeplinind direct
funciile de imunitate celular
(limfocite T cu memorie), altele
cu rol de control al calitii
rspunsului imun (limfocitele T
ajuttoare) i limfocitele T
supresoare care amplific sau
scad amplitudinea funciilor
celulelor efectoare care dau
rspunsul imun).
In organismul animal n cursul
dezvoltrii perinatale, printr-un
proces genetic specific, sunt
generate o multitudine de
specii de limfocite, fiecare

programat genetic n
producerea unui anumit
anticorp.
Fiecare asemenea specie
este o clon.
Fiecare clon celular va
produce un singur tip de
anticorpi identici (anticorpi
monoclonali).

Celulele hibridoma
(1975) Kohler i Milstein au
realizat primele hibridoame
productoare de anticorpi
monoclonali
Hibridoamele sunt celule
hibride rezultate din fuziunea
celulelor tumorale
mielomatoase cu celule
limfoide izolate de la oareci
imunizai n prealabil cu un
antigen dat (hematia de oaie).
Intr-un asemenea hibrid
celular sunt exprimate att
genele din celulele mielomice
care asigur reproducerea
celular indefinit, ct i genele
din limfocitele oarecilor

imunizai care asigur

specificitatea produciei de
anticorpi. Linii de celule tumorale
folosite pentru obinerea
hibridoamelor/
Pot fi folosite numai acele linii
mielomatoase mutante
caracterizate prin prezena unui
defect metabolic indus
experimental (lipsa unei anumite
enzime).
Aceste celule pot fi ntreinute
n cultur i pot fi eliminate cu
uurin dintr-un amestec n
care sunt prezente i altetipuri
de celule care nu posed
deficiena metabolic.

Limfocite folosite
pentru
obinerea hibridoamelor
Pentru obinerea unor anticorpi monoclonali
de natur murin se pot folosi celule limfoide
izolate din splina oarecilor imunizai intravenos
cu antigenul mpotriva cruia vor fi produi
anticorpii.
Pentru obinerea hibridoamelor de natur
uman, uneori pot fi folosite celulele limfoide
din splin sau din ganglioni limfatici. Cea mai
facil surs de limfocite umane este sngele
periferic. Pentru creterea numrului de
limfocite din snge este necesar imunizarea
donatorilor nainte de recoltarea acestora
(metod nociv prin introducerea unor doze
mari de antigene potenial nocive organismului
uman). O soluie alternativ const n
imunizarea in vitro, adic cultivarea limfocitelor
periferice, izolate din snge i purificate prin
nlturarea limfocitelor T supresoare, n
prezena antigenului dorit.

UTILIZARI
Anticorpii monoclonali
antiinterferon

sunt obinui cu ajutorul celulelor

de tip hibridoma cultivate in
vitro i sunt folosii la purificarea
interferonului care apoi este
comercializat n scopul
combaterii unor boli virale.

Anticorpii monoclonali sunt

utilizai pentru combaterea
unor boli parazitare. Anticorpii

monoclonali pot fi utilizai n

tratamentul unor forme de cancer.
unele forme de cancer: tipuri de
leucemii, unele limfoame (tumori ale
celulelor limfocitare), unele tumori

ale colonului, ale snului sau ale

pancreasului etc. Prezint antigene
specifice la suprafaa membranelor
celulare tumorale i ca urmare ele
pot fi inte pentru anticorpii
monoclonali specifici acestor
antigene.

Anticorpii monoclonali pot fi

folosii pentru diagnosticul
precoce n tumori maligne sau
metastaze
Anticorpii monoclonali pot fi
utilizai pentru a testa
compatibilitatea ntredonor i
receptor n cazul grefelor.