C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote

C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote

I. Organizarea materialului genetic la procariote.

1. Caractere generale.
2. Cromosomul bacterian.
3. Plasmidele.

II. Replicatia la procariote.

1. Esenta replicarii ADN

2. Separarea celor 2 catene ADN si detensionarea acestora.
3. Construirea celor 2 catene de ADN pe cele 2 catene matrita
ale AND-ului mama.
4. Replicarea ADN ca sistem biochimic si enzimatic complex.

III. Fluxul informatiei genetice la procariote.

1. Transformarea celulara.
2. Transductia
3. Conjugarea
4. Importanta medicala a plasmidelor.
 C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote
I. Organizarea materialului genetic la procariote.
1. Caractere generale.

In celula procariota AND-ul este sub forma circulara si

se afla in 2 elemente genetice:

cromosomul (un inel mare de ADN)

plasmidele (inele mai mici de ADN)

Fiecare cromosom bacterian

este impachetat intr-o regiune
a celulei numita nucleoid
C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote
2. Cromosomul bacterian.

Supraspiralizarea este o stare fizica in care molecula de ADN se

pliaza prin rasucire in jurul propriei axe.

Diferite stari fizice ale cromosomului bacterian. a. Bucle multiple de ADN dintr-o
celula sparta prin soc hipotonic, raspandite pe suporul reprezentat de o proteina
bazica. b. Diagrama ADN supraspiralizat. In stanga sunt reprezentate 7 domenii
(numarul real este de circa 50) supraspiralizate, mentinute astfel de un set de
proteine, care stabilizeaza capetele unui domeniu. Buclele mici ale fiecarui domeniu
pot fi spiralizate in jurul unui set de proteine nucleosomale, reducand tensiunea in
dublul helix, creata prin supraspiralizare. c. In dreapta, doua domenii au fost incizate
la nivelul unei catene, permitand rotatia helixului si relaxarea supraspiralei (dupa
Pettijohn si Snider, 1985).
C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote
2. Cromosomul bacterian.
Cromosomul bacterian = gene esentiale
ca structura genetica esentiala poarta informatia genetica ce
asigura desfasurarea functiilor esentiale pentru existenta
celulei, adica setul de determinanti minim necesari pentru a
codifica arhitectura celulei si pentru a asigura metabolismul
energetic si de biosinteza, cresterea, diviziunea si reglarea
diferitelor activitati celulare.

Structurile genetice extracromosomale (plasmidele),

= gene optionale
poarta informatia genetica accesorie, "de confort", care
permite celulei o mai buna adaptare la conditii de mediu noi
sau modificate.

Genomul E. coli K12 este alcatuit din circa 4400 de gene.

Intr-o plasmida pot exista intre 3-200 de gene optionale.
C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote
2. Cromosomul bacterian.

Evidentierea nucleoidului
Pe micrografiile electrono-optice,
materialul nuclear este localizat, in
mod obisnuit, in partea centrala a
celulei si se distinge de citoplasma Imagine electrono-optica a
nucleoidului bacterian
inconjuratoare, prin densitatea sa
mai mica la fluxul de electroni, in Dupa hidroliza ARN,
contrast cu celula eucariota, la materialul nuclear apare
sub diferite forme: sferica,
care nucleul este mai ovalara, de haltera, de
electronodens, comparativ cu bastonas, reprezentand 5-
citoplasma. l6% din volumul celulei.

Celula procariota are un contrast invers al structurilor sale, in

raport cu celula eucariota, care se datoreaza atat faptului ca
ADN nu este asociat cu proteine, cat si densitatii foarte mari a
citoplasmei bacteriene.
C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote
2. Cromosomul bacterian.

Materialul nuclear poate fi izolat din celula

sub forma unui corpuscul dens si compact. Corpusculul
corespunde starii "impachetate" a cromosomului.

Dupa tratamentul moderat cu RNA-aza si proteaze, din structura

compacta se izoleaza molecula de ADN sub forma cromosomului
circular inchis covalent (60%), ARNm , ARNt (30%) si ARN-
polimeraza (l0%).

Cromosomul are o lungime de l400 µm si diametrul de 2,5 nm,

corespunzator diametrului moleculei de ADN dublu catenar.
Circularitatea este o conditie a existentei sale. Sub aceasta forma,
molecula de ADN este rezistenta la actiunea exonucleazelor
citoplasmatice, active asupra moleculelor lineare de ADN.
C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote
2. Cromosomul bacterian.

Cromosomul bacterian este cea mai mare molecula biologica.

Prin lungimea sa (l400 µm), molecula de ADN cromosomal
depaseste de circa l000 de ori lungimea celulei bacteriene.

- In cromosomul bacterian nu exista proteine de inpachetare

(histone).
- In genele procariotelor nu este intalnit fenomenul de
dominanta sau recesivitate si nu prezinta introni.
C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote
3. Plasmidele.

Plasmidele sunt molecule circulare autoreplicatoare

situate in citoplasma, contin expresia genica a unor procese
care nu tin de supravietuirea celulei.

•Plasmide conjugative: purtatoare a genelor pentru sex

pili si transferul plasmidului

• Plasmide de disimilatie: codifica activitatea catabolica a

unor compusi proteici toxici, bacteriocine – toxice pentru alte
bacterii si pentru celula de la om

• R factors: codifica rezistenta la antibiotice

C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote
II. Replicatia la procariote.
1. Esenta replicarii ADN.
Intelegerea replicarii presupune cunoasterea structurii AND-ului.

O gena este alcatuita din cateva sute pana la cateva mii de nucleotide, care
sunt unitati de structura a AND-ului.
Nucleotidul ? nucleotid
Pentoza (dezoxiriboza)
rest de acid
fosforic

baza azotata

Purinica - adenina
Pirimidinica - timina
- guanina
- citozina
C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote
1. Esenta replicarii ADN.
C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote

1. Esenta replicarii ADN.

In anul 1953 biochimistul american James

D.Watson si britanicul biofizican Francis
Crick au publicat prima descriere a
structurii ADN-ului. Modelul lor s-a dovedit
atat de important pentru intelegerea
sintezei ADN-ului incat in 1962 au primit
premiul Nobel pentru medicina.
C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote
1. Esenta replicarii ADN.

La cromosomii de la E. coli poate fi observat

la microscopul electronic o singura origine a
replicarii, acesta fiind locul din care pleaca 2
furci de replicare in sens opus.
Cand furcile se intalnesc, replicarea se termina
si se despart cei doi cromosomi.
Viteza desfacerii celor 2 benzi este de 1000
de nucleotide|s la procariote si 100 nucleotide
|s la eucariote.Acest proces de desfacere este
urmat de sinteza unui lant nou complementar
de ADN.
C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote
2. Separarea celor 2 catene ADN si detensionarea acestora.
Initierea replicarii incepe prin desfacerea legaturilor de hidrogen dintre
nucleotidele de pe cele doua catene ale ADN-ului mama, in punctul de origine
(reamintim ca adenina se leaga de timina prin 2 legaturi de hidrogen si guanina de
citozina prin 3 legaturi de hidrogen, conform principiului complementaritatii;A=T,
G=C).
1. Separarea celor 2 catene si detensionarea acestora
Enzimele implicate in acest proces se numesc helicaze.
Deci in fata enzimelor care realizeza replicarea se afla aceste helicaze care separa
cele 2 catene.
Prin separarea celor 2 catene dubla elice a ADN-ului devine din ce in ce mai tensionata,
exista topoizomerazele care detensioneaza ADN-ul:

Topoizomeraza 1 detensioneaza ADN-ul suprahelicat pentru ca poate sa desfaca o

legatura fosfodiesterica de pe o catena a ADN-ului permitand relaxarea elicei .

Topoizomeraza 2 numita si ADN giraza poate induce tensionari negative, inverse

tensionarilor produse de helicaza permitand continuarea procesului.

2. Construirea celor 2 catene de ADN pe cele 2 catene matrita ale AND-ului mama
Construirea celor 2 catene ale noului ADNse realizeaza cu mici molecule de ARN
numite primeri sau initiatori (5-10 nucleotide) in prezenta ADN primazei.
C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote
3. Construirea celor 2 catene de ADN pe cele 2 catene matrita ale AND-ului mama.
De la capatul 3` al ARN-ului initiator pleaca sinteza ADN-ului propriu zis prin
adaugarea succesiva a deoxinucleotidelor care se unesc prin legaturi
fosfodiesterice. Molecula fiica nou constituita respecta cu strictete ADN-ul matrita,
conform principiului complementaritatii. Enzima necesara este ADN polimeraza III.
Finalul replicarii necesita eliminarea ARN-ului initiator si asigurarea continuitatii
catenei nou formate. Enzima necesara este ADN polimeraza 1 care este deci si
polimeraza si exonucleaza. Asta inseamna ca ribonucleotidele din ARN-ul initiator
sunt inlocuite pe rand cu deoxinucleotidele necesare noului ADN.
Acest mecanism explica foarte bine sinteza
lantului polinucleotidic cu directia 5`-3`.
Cealalta catena poate fi copiata cu ajutorul aceleiasi ADN polimeraze printr-un
mecanism asemanator dar care pleaca in sens invers.
Deci de data asta punctul de plecare a polimerazei este bifurcatia de replicare
construindu-se astfel catena in directia 5`-3`.
Procesul este discontinuu, pentru ca dupa ce punctul de bifurcatie avanseaza
suficient de mult o noua sinteza pleaca din dreptul noului punct de bifurcatie.
Astfel se vor forma mai multe fragmente mici de ADN numite fragmente Okazaki.
Fragmentele Okazaki au o lungime de cateva sute de nucleotide la eucariote si
cateva mii la procariote. Fragmentele vor fi reunite dupa excizia fiecarui fragment
de ARN initiator care insoteste lanturile Okazaki. Cu excizia ARN-ului se ocupa tot
ADN polimeraza 1 iar cu unirea lanturilor de ADN ramase se ocupa ADN ligaza
(necesita cosum de ATP).
C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote
3. Construirea celor 2 catene de ADN pe cele 2 catene matrita ale AND-ului mama.

Reprezentarea structurii
replisomului in timpul
replicatiei ADN

ADN polimerazele pot actiona doar in directia 5` - 3`

De aceea pe lantul cu capatul 3` liber sinteza ADN se face continuu =
acesta este lantul conducator (engl. “leading strand”)
capatul 5` liber sinteza ADN se face discontinuu =
pe fragmente Okazaki, acesta este lantul intarziat sau succesor (eng.
“lagging strand”
C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote
3. Construirea celor 2 catene de ADN pe cele 2 catene matrita ale AND-ului mama.

In final de pe fiecare catena a ADN-ului mama se construieste cate o catena

noua rezultand 2 molecule polideoxinucleotidice bicatenare cu un lant vechi
(matrita sau mama) si un lant nou sintetizat de complexul enzimatic numit
replicare.
Intregul mecanism este extrem de fidel astfel incat erori nu apar decat cu o
frecventa de una la un milion -zece miloane de nucleotide. ADN polimeraza
are o extraordinara capacitate de autocontrol astfel incat daca o nucleotida nu
este pusa conform principiului complementaritatii aceasta este imediat
eliminata si inlocuita cu nucleotidul corespunzator.
C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote

4. Replicarea ADN ca sistem biochimic si enzimatic complex

Replicarea ADN ca sistem biochimic si enzimatic complex format din:

-         ADN matrita (ADN-ul mama)

-         Deoxinucleotidele necesare sintezei (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
-         Ribonucleotidele necesare sintezei unui ARN care va folosi ca punct de
……...plecare pentru sinteza ADN (ATP, GTP, CTP, UTP)
-         Ioni de magneziu
-         Un sistem multi enzimatic compus din:

a.       topoizomeraze - enzime care detensioneaza elicea ADN-ului in timpul

replicarii.
b.      ADN primaza - enzima care produce mici fragmente de ARN, necesare
inceperii procesului de replicare.
c.       ADN polimeraza ADN dependenta si care are o serie de caracteristici:
sintetizeaza ADN in directia 5`-3`, are si activitate exonucleazica pentru ca
elimina unele nucleotide in timpul replicarii, are o inalta fidelitate pentru ca
exercita un control strict al replicarii. La procariote existe 3 ADN polimeraze.
d.      ADN ligaza - enzima care reuneste fragmentele de ADN rezultate in
timpul replicarii.
Intregul complex de factori care participa la acest proces se mai numeste
replizom.
C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote

III. Fluxul informatiei genetice la procariote.

Transfer orizontal de gene.

Transfer vertical de gene.

 C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote

III. Fluxul informatiei genetice la procariote.

1. Transformarea celulara.

Transferul orizontal al genelor:

transferul genelor intre celule ce
apartin aceleasi generatii

Transformarea celulara
-reprezintă transferul de
material genetic de la o
celulă donor la una
receptor sub forma de
ADN pur, eliberat fie
prin liza celulei donor,
fie prin extracţie
chimică
C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote
III. Fluxul informatiei genetice la procariote.
2. Transductia
Transducţia : transfer de gene cromozomiale de la
o celulă bacteriană la alta, mediata de
bacteriofagi(microorganisme ce distrug bacteriile)
Transducţia generalizată
 este mediată de fagii virulenţi, litici, care după
pătrunderea în celula bacteriană se multiplică şi
determină liza celulei gazdă.
 în timpul lizei celulei bacteriene cromozomul
acesteia se fragmentează
 ocazional: un fragment cu o dimensiune apropiată de
cea a genomului fagic se integrează în capsida
bacteriofagului, în locul genomului fagic.
 aceşti fagi pot pătrunde în alte celule bacteriene
injectîndu-le ADN-ul, ce provine de fapt din genomul
celulei donoare. ADN-ul se va integra în cromozomul
celulei receptoare prin recombinare, conferindu-i
acesteia caractere noi:
 rezistenţa la chimioterapice,
C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote
III. Fluxul informatiei genetice la procariote.
3. Conjugarea
 transferul de material genetic de la o bacterie donoare la una
receptoare printr-un proces de împerechere, ce se realizează
prin contactul direct dintre cele două celule.
 Prin conjugare se pot transmite plasmide, precum şi gene
cromozomiale (prin intermediul factorului F+)

Necesita contactul intre celule vii

•Tipul genetic de celula donor este denumita F+
•Celule receptoare sunt numite F–
•Celulele F contin plasmide numite F (fertilitate) ce sunt transferate catre
celule F- in timpul conjugarii
 C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote

4. Importanta medicala a plasmidelor.

1. Plasmidele constituie vehicule (vectori) pentru ADN in tehnologia AND-ului recombinat.

2. In plasmide se afla genele care dau rezistenta bacteriei la antibiotice.

Prin liza bacteriana urmata de centrifugare se obtin plasmidele si in ele se introduc

gene straine bacteriei.

Plasmidele astfel modificate se reintroduc in alte celule bacteriene, iar acestea incep sa
Sintetizeze proteina codificata de gena straina si in final din mediul de cultura al
bacteriei se purifica proteina respectiva.

Exemple de proteine de interes medical:

interferonii
(proteine sintetizate de celulele infectate cu virusuri si care sunt eliberate in mediul
inconjurator si apara alte celule de invazia virala)
insulina umana
hormoni de crestere umana
proteina antihemofilica
eritropoetina
C9 – Organizarea si exprimarea materialului genetic la procariote

4. Importanta medicala a plasmidelor.

Plasmidele necesare pentru

transferul de gene trebuie sa
posede un numar restrâns de
regiuni sensibile la actiunea
enzimelor de restrictie. În acest
caz, se poate realiza ruperea si
apoi insertia de ADN exogen în
plasmid.
Primul plasmid bacterian, folosit ca
vector pentru transferul de gene, a
fost cel notat pSC 101, realizat de
S.Cohen(1973).