Alte tipuri de microscopie

Microscopia pe fond întunecat și ultramicroscopia

Microscopia de fluorescență
Microscopia în contrast de fază
Microscopia în lumină polarizată
 Microscopia pe fond întunecat și
ultramicroscopia

• Se bazează pe fenomenul Tyndall – constă în dispersia luminii de către particule foarte mici
aflate în suspensie și care devin astfel vizibile, analog particulelor de praf aflate într-o rază de
lumină puternică.
• Fascicolul de lumină care servește la iluminarea preparatului nu pătrunde direct în microscop.
• Proba este iluminată cu raze oblice printr-un condensor special (cardioid/ paraboloid) iar în
obiectiv pătrund razele dispersate de particulele suspendate din preparat
• Fascicolul incident este limitat de o diafragmă (D) cu deschideri convenabil alese – apar
puncte strălucitoare pe fond negru (de aprox 1000 X mai mici decât limita de rezoluție a
microscopului optic)
• Se pot observa particule din citoplasma celulelor vii, invizibile la microscopia optică obișnuită
• Se folosește pentru studiul celulelor vii: microbi, protozoare, celule în
diviziune, studiul spirochetelor, permițând diagnosticul unor boli printre
care și sifilis
• Se practică și pentru preparate cu contrast slab.
• Imaginea apare luminoasă pe un fond întunecat, efect produs de un
condensor special, datorită fenomenului de difracție în preparatul care este
iluminat lateral.

• Se poate efectua și la microscop obișnuit la care preparatul cu particulele în

suspensie se plasează într-o cuvă de sticlă iluminată lateral – procedeul se
numește ultramicroscopie.
• * pe măsură ce ne apropiem de limita de rezoluție a microscopului dispare
asemănarea dintre obiect și imagine din punct de vedere geometric. Se
aplică și la microscopia pe fond întunecat și la ultramicroscopie.
 Principiu ultramicroscopie

Ultramicroscopul de la Universitatea din Birmingham

Preparat: celule cultivate de Spirulina platensis
(algă verde-albastră)
 De observat: celulele unite între ele
printr-o strucură spiralată, strălucitoare
pe fond negru, care se rotește în jurul
axei sale

 https://www.youtube.com/watch?v=R99
T08FjTkc
 Microscopia de fluorescență

• Prin absorbția energiei luminoase, moleculele trec din starea fundamentală în starea
excitată. Revenirea moleculei la starea inițială se face cu pierderea energiei. În cazul
fluorescenței, revenirea este însoțită la emisia unei radiații luminoase cu o energie
inferioră radiației absorbite, ca urmare lungimea de undă a razei emise este mai mare.
• Substanțele ce prezintă fluorescență puternică se numesc fluorocromi.
• Preparatele din microscopia de fluorescență conțin fluorocromi.
• Prin iradierea cu UV se produce excitarea fluorocromilor și rezultă fluorescența
zonelor ce conțin fluorocromi.
• Sursa de lumină: o lampă cu vapori de mercur ce emite
radiații UV
• În calea razelor se așează filtre de excitație (colorate în
albastru până la violet) ce opresc o parte din radiațiile sursei,
lasă să treacă doar cele cu lungimi de undă ce excită
fluorocromul
• Radiația trece printr-un condensor, apoi obiectiv, lama cu
preparatul, toate din sticlă de cuarț (sticla obișnuită absoarbe
razele UV)
• După trecerea prin obiectiv, lumina este filtrată prin filtre de
baraj care opresc lumina ce vine de al sursă și permit trecerea
luminii emise de fluorocrom. Imaginea e observată după
trecerea prin ocular
• Zone fluorescente apar pe fond întunecat
• Se folosește pentru: observarea unor preparate colorate vital, lizozomi ce au
acumulat coloranți fluorescenți (acridin oranj), cromozomi (benzi
fluorescente sau detectarea cromozomului Y), imunologie
(imunofluorescență), histochimie și citochimie
• Utilizată în biologia celulară în studiul mobilității proteinelor membranare
după fuziunea celulelor umane și de șoarece, experiența dovedește
fluiditatea membranei

Nu se privește niciodată la microscopul cu fluorescență până nu ne

asigurăm că filtrele ne baraj sunt la locul lor, deoarece razele UV produc
leziuni retiniene severe!
La pornirea lămpii microscopului cu fluorescență se așteaptă cel puțin 15
minute, iar după oprirea lămpii este necesară o răcire de circa 2 ore înainte
de a o aprinde!
 Tehnica examinării în fluorescență

• Prin transmisie sau prin reflexie (iluminarea de sus prin obiectiv)

• Procedeul de examinare prin transmisie presupune preparate transparente sau
secțiuni pe care lumina le poate străbate
• Fluorescența este indusă în toata masa preparatului, permite observarea zonelor
fluorescente față de cele nefluorescente
• Se poate combina cu observarea structurii (imaginii) prin absorbție (transparență) în
lumină policromă din spectrul vizibil pentru identificarea structurii și zonelor de
interes
 Tehnica examinării în fluorescență

• Procedeul de examinare prin reflexie presupune inducția fluorescenței pe

suprafața preparatului
• Se combină cu examinarea preparatului în lumină policromă din spectrul
vizibil prin procedeul de transmisie pentru studiul structurii
• Se poate și examinarea combinată la aceste tipuri speciale de microscoape
• Preparatele se impregnează cu fluorocromi, zonele sau detaliile de interes
devenind fluorescente în lumină UV în cadrul spectrului de absorbție.
• Microscoapele de cercetare au condensori speciali pentru UV și obiective
speciale
• Pentru iluminarea prin obiectiv (procedeul prin reflexie) există microscoape
speciale
• Sursa de iluminare: lampă cu vapori de mercur (Hg), Xenon (Xe) cu puterea
de 200-1000 W
• Preparatele se pun pe lame de sticlă nefluorescente, iar la procedeul cu
imersie, uleiul trebuie să fie nefluorescent
 Lumina de
Filtrul de baraj se
Filtrul de excitație cade pe
aplică sub ocular
excitație ce o prismă cu Lumina emisă de și lasă să treacă
selectează reflexie totală
Raze UV emise preparat ajunge doar lumina
lungimea de inclusă în
de o sursă la obiectiv apoi la fluorescentă,
undă ce excită obiectiv special
ocular fără lumina de
fluorescența ce focalizează
excitație care ar
preparatului raza pe suprafața
leza retina
preparatului

 Zonele fluorescente apar luminoase pe fond întunecat.

 Metoda se poate combina cu observarea prin transmisie pentru studiul
structurii, preparatul fiind dotat în acest caz cu o sursă policromă în
spectru vizibil, completată cu elementele sistemului de transparență
 Aplicații practice
• Cu fluorescența primară pot fi identificați:
Pigmenții (porfirinele, lipocromii sau pigmenții carotenoizi, cromolipidele, lipofuscina
Acizii aminați (fenilalanina, tirozina, triptofanul)
Unele virusuri și bacilul Koch
Dintele natural este autofluorescent, deosebindu-se de cel artificial
Aminele biogene: adrenalina, noradrenalina, serotonina
• Cu fluorocromarea cu acridin oranj se pot identifica:
Acizii nucleici (ARN, ADN)
Fibrele de colagen, elastice și de reticulină
Nucleii leucocitelor
Mucinele
 Preparate de examinat în microscopia de
fluorescență
Acizii nucleici în celulele hepatice (colorare cu acridin oranj)
• Acridin oranjul colorează ADN-ul în verde iar ARN-ul în roșu. Nucleu cu ADN se colorează în
verde iar citoplasma și nucleolii care conțin ARN se colorează în roșu
• Tehnica:
2. Acid
Se presează Se introduce Se colorează
Recoltare ascorbic 0,1 Se aplică o
în mai multe în soluție cu acridin
ficat de M, 20 min picătură de
locuri pe o fixatoare de oranj prin 1. Apă 3. Acridin 4. Apă
șobolan (are rolul de a apă cu pH 4,5,
lamă alcool metilic: introducerea distilată, 2 oranj 0,01% în distilată, 2
proaspăt. Se prelungi se acoperă cu
degresată acid acetic lamei succesiv minute apă, 5 min. min.
taie în bucăți fluorescența o lamelă și se
care se usucă glacial (3:1) în pahare
de 1 cm cub în timpul examinează
la aer 10-15 min. Berzelius cu
examinării)

• Celulele hepatice izolate sau în grupuri mici, care prezintă un contur neregulat (cu franjuri) roșu
intens, 1-2 nuclei verzi și nucleoli roșii.
• Între celulele hepatice se mai obs. Celule albe sangvine cu nucleu de formă neregulată, verde, și
citoplasmă ușor roșie
 Preparate de examinat în microscopia de
fluorescență
• Cromozomul Y (corpusculul F) în nucleii celulelor din mucoasa bucală (colorat
cu clorhidrat de chinacrină)

Se prepară
un frotiu de Se colorează Se
celule din cu soluție de montează
1. Acool
mucoasa chinacrină 5. 3 băi de pe lamă cu
metilic și 2. Apă 3. Acid 4. Chinacrină
bucală după prin apă distilată, 6. Se usucă apă pH 4,5 și
acid acetic distilată, 2 ascorbic 0,1 0,5%, pH
protocolul introducerea 10 minute în la aer se acoperă
(3:1), 10-15 min. M, 20 min. 4,5, 15 min.
de la lamei în total cu o lamelă
min
determinare pahare după care se
a cromatinei Berzelius cu: examinează
sexuale
 Preparate de examinat în microscopia de
fluorescență
• Autofluorescența clorofilei în cloroplastele de Hydrilla sp.
• Autofluorescența este propietatea unor substanțe naturale de a emite radiații în
spectrul vizibil atunci când sunt iluminate cu radiații UV
• Tehnica:
• Se pune o frunză de Hydrilla pe o lamă într-o picătură de apă și se acoperă cu o lamelă.
• În lumina albă cloroplastele au o culoare verde; în lumină UV, ele emit o fluorescență
roșie
 Cromosom Y în celule
endoteliale, colorat cu CD31
(verde). Cromosomul X colorat
cu roșu. ADN colorat cu DAPI

Autofluorescența roșie a cloroplastelor la

Hepatocite - Colorație cu acridin oranj – nucleu cu verde, citoplasma și Aetokthonos hydrillicola
nuclelii cu roșu
 Sistem nervos central la specii de melci (Lymnea, Helix),
Astrocite de șoarece - Mitocondrii fixate cu glutaraldehidă și colorare cu acridin oranj. Galben – ADN, roșu – ARN, verde –
colorate NAO autofluorescență –pericarya.
Macrofage umane. Albastru – Nucleu (DAPI), Verde – Vimentin (Alexa Fluor 488), Roșu – Actină (Sir-Actin). Imaginile separate
sunt suprapuse cu ajutorul unui software dar examinarea are loc separat.
 Microscopia în contrast de fază

• Majoritatea obiectelor biologice obs. la microscop sunt transparente și necesită

colorare în prealabil (contrastate), elemente structurale diferite fiind colorate diferit
astfel încât să le putem distinge.
• Și țesuturile sau structurile necolorate sunt optic neomogene, deoarece au un
indice de refracție a luminii diferit. Între razele care traversează partea structurii
cercetate cu indice de refracție n1 și zona cu indice de refracție n2 apare o anumită
diferență de fază.
• Această diferență nu se manifestă direct, deoarece diferențele de drum optic sunt
prea mici pentru a fi detectate de ochi sau pe fotografie.
• În microscopia de fază, aceste diferențe de drum optic sunt amplificate, razele
refractate sunt defazate la trecerea printr-un dispozitiv special numit placă de fază.
 Microscoapele cu contrast de fază

• Au în componență o trusă specială cu elemente necesare examinării în

contrast de fază:
• Condensori pentru contrast de fază (conțin și placa de fază)
• Obiective pentru contrast de fază
• Microscop ocular pentru centrarea condensorilor față de obiective
• Chei speciale pentru reglarea (centrarea) condensorilor
 Utilizare
• Microscopia cu contrast de fază se folosește pentru studiul celulei vii, ce permite
observarea nucleului, distribuția organitelor în citoplasmă, modificările din timpul
diviziunii celulare, mișcările celulare.
• Adesea se filmează prin cuplarea la microscop a unui aparat destinat acestui scop.
• Metodă specială utilizată la microscoapele moderne, este adecvată observării
preparatelor transparente care nu absorb lumina, ci doar introduc în razele de lumină
diferențe de drum optic.
• Aplicații practice:
• Studiul celulelor vii (nefixate, necolorate)
• Detalii de structură ce nu pot fi obs. la micoscopul fotonic obișnuit ca endocitoza,
mișcarea cililor și flagelilor, diviziunea celulară
• Reacții celulare la diferiți agenți fizici sau chimici
• Benzile cromosomilor
 Preparat de examinat în contrast de fază

• Material: frotiu de mucoasă bucală, cultură de celule în monostrat sau suspensie

de protozoare pe o placă Petri
• Studiu:
• Se plasează materialul de studiu pe platina microscopului
• Se observă preparatul atât la microscopul obișnuit cât și la cel în contrast de fază
• La frotiul cu mucoasa bucală se observă celule izolate sau în grupuri de 2-4, cu
nucleu central, rotund sau ușor alungit, cu heterocromatina închisă la culoare, mai
la periferie. În citoplasmă se obs. Granule de diferite forme și mărimi dispuse în
jurul nucleului, sub plasmalemă un inel mai clar din care lipsesc granulele.
Celule ale epiteliului bucal văzute
la microscop fotonic și cu
fluorescență. La D, cu portocaliu
apar și bacterii atașate

Celule ale epiteliului bucal văzute

la microscop cu contrast de fază
Celule epiteliale vii sub microscop

Ciliat (Oxytricha saprobia) în camp luminous (stânga) iluminare în

contrast de fază (dreapta)
Hotă cu flux laminar
Prepararea culturilor de celule pentru vizualizare

Realizată în diferite scenarii, în funcție de gradul de

contagiozitate a preparatului
 Microscopia în lumină polarizată
• Se obțin imagini ale unor constituenți în care structurile examinate sunt anizotrope – acestea facând ca viteza
de propagare a luminii polarizate să varieze cu direcția de propagare. Mediile respective se numesc
birefringente.
• Clasificări ale birefringenței:
1. În structurile fibrilare (colagen, mielină, fibre musculare striate) poate fi o birefringență pozitivă când
indicele de refracție este mai ridicat în lungime decât în plan perpendicular; birefringență negativă în caz
contrar (fibre nucleoproteice)
2. Birefringență cristalină/intrisecă – la sistemele/moleculele în care ionii au aranjament asimetric regulat,
independentă de indicele de refracție a mediului de montare; le structuri proteice sau lipidice
3. Birefringență de formă/de structură la particulele submicroscopice orientate regulat într-un mediu cu indice
de refracței diferit
4. Birefringența de tensiune la structuri izotrope supuse unei constrângeri mecanice, la nivelul mușchilor sau în
țesuturi embrionare
5. Dicroismul când absorbția unei lungimi de undă dată de lumina polarizată variază în funcție de orientarea
obiectului examinat (variația datorată diferențelor de intensitate, coloranți organici ca roșul de Congo pot
induce dicroism la unele structuri biologice)
 Microscopul cu lumină polarizată

• Are 2 dispozitive speciale: polarizor și analizor, constituite dintr-o peliculă de

film polaroid și o prismă Nicol
• Polarizorul se află sub condensator iar analizorul deasupra obiectivului
• Dacă planul de polarizare al analizorului este perpendicular pe cel al
polarizorului, lumina nu va fi transmisă.
• Punând pe platina microscopului un preparat birefringent, planul de polarizare
va devia datorită întârzierii provocate de întreruperea probei de examinat.
• Învârtim preparatul până când apar puncte de luminozitate maximă și minimă în
câmpul microscopului
 Tehnica

• Se coboară tubul microscopului, apropiind obiectivul de condensor până la

obținerea unei iluminări maxime și uniforme
• Se rotesc analizorul și polarizorul până când se obține întunecarea maximă
în câmpul ocularului
• Se așează lama cu preparatul pe platină (preparate de rinichi, intestin, ficat
colorate după metoda topo-optică Romanyi)
• Metoda topo-optică Romanyi: materialul se fixează în formol; se
secționează la criomicrotom; secțiunile se colorează cu o soluție de albastru
de toluidină la pH 4,5; post-fizare cu fericianid de potasiu ce leagă lipidele și
glicoproteinele din structura biomembranelor
 Formarea cristalelor in rinichi de
șoarece cu hiperoxalurie

A- Secțiune transversală prin tulpina

de grâu
B- Amidon de cartof
C- lână
D- fire de păr uman
 Aplicații practice

• Studiul structurilor a căror compoziție chimică macromoleculară are aspect

liniar – fibre de colagen, mielină, fibre musculare striate
• Studiul strcturilor: membrane biologice
• Evidențierea structurilor cu simetrie radiară: granule proteice, lipide,
colesterol