❑ EVIDENTIEREA

SPORILOR
BACTERIENI,
CAPSULEI
DETERMINAREA
VIABILITATII
BACTERIILOR
Seminar 5
 ENDOSPORII

EVIDENTIEREA
SPORILOR
BACTERIENI
Bacteriile cilindrice:
Clostridium, actinobacterii,
Bacillus
Sporosarcina

Madigan et al., Brock Biology of microorganisms, 2011 (13th ed.) Endosporii la Clostridium pascui
 Metoda Schaeffer–Fulton

EVIDENTIEREA
SPORILOR
BACTERIENI

Endosporii la Bacillus subtilis

https://en.wikipedia.org/wiki/Schaeffer%E2%80%93Fulton_stain
 Metoda Schaeffer–Fulton

 Verde malachit 5%
 Fucsina diluata 1/10 / safranina (0.5%)
 Culturi bacteriene

EVIDENTIERE
A SPORILOR
BACTERIENI

https://microbeonline.com/endospore-staining-principle-procedure-results/
 Metoda Dorner

 Fucsina diluata
 Nigrozina
 Culturi bacteriene
EVIDENTIERE
A SPORILOR  Se pregateste o suspensie bacteriana
 Se adauga fucsina in suspensia bacteriana
BACTERIENI  Se incalzeste suspensia timp de 10 minute
 Se transfera o cantitate mica de bacterii pe lama de microscop cu
ajutorul unei anse/pipete
 Se amesteca cu nigrozina
 Se etaleaza suspensia pe suprafata lamei
 Se usuca si se examineaza la microscop

https://microbeonline.com/endospore-staining-principle-procedure-results/
  Capsula
 Invelis de natura polizaharidica, glicoproteica ce protejeaza celula
 Bacterii Gram negative: Haemophilus influenzae, Klebsiella
pneumoniae; Bacterii Gram positive: Bacillus anthracis,
Streptococcus pneumoniae

EVIDENTIEREA  Se poate evidentia prin coloratia Gram (zona luminoasa in jurul

nucleului)
CAPSULEI  Se coloreaza cu o solutie de albastru de metilen alcalin Loeffler
(albastru de metilen, KOH, apa distilata), albastru de toluidina, tus
de China

Cappuccino Welsh, Microbiology

  Capsula
 1% cristal violet
 20% sulfat de cupru

EVIDENTIEREA
CAPSULEI

Cappuccino Welsh, Microbiology

 Acridine orange (marker specific
pentru ADN)

 Microscopia optica de fluorescenta

 fluorofori, molecule care au proprietatea de a emite lumina atunci cand sunt
iluminate la lungimi de unda specifice
 domeniul spectral in care un fluorofor emite este intotdeauna plasat la lungimi
MICROSCOPIA de unda mai mari decat cel in care este iluminat
 fluoroforii sunt astfel construiti incat sa se lege pe tintele de interes
DE  fluoroforii trebuie sa aiba un coeficient de absorbtie cat mai mare, un randament
FLUORESCENTA de emisie cat mai bun si domeniul de lungimi de unda de emisie sa fie cat mai
distantat fata de cel de excitare
 fluoroforii uzuali sunt molecule mici cu grupari chimice susceptibile de a prezenta
fenomenul de fluorescenta
 Filtrul de excitatie permite selectia domeniului spectral care se foloseste pentru
excitarea fluoroforului; Filtrul de emisie selecteaza lumina emisa de fluoroforii
din proba si este captata de camera video si/sau vizualizata prin oculare.

Carl Zeiss Microscopy Deutschland GmbH - Filter Assistant - Overview of Dyes

  Microscopia confocala
 Lumina emisa este trecuta, inainte de a ajunge pe detector, printr-o apertura
circulara (pinhole) care reduce mult diametrul fasciculului astfel incat numai
lumina emisa de fluoroforii din planul focal al obiectivului trece prin apertura
MICROSCOPIA  Lumina nefocalizata (provenind de la fluoroforii din afara planului focal) este
CONFOCALA oprita de materialul opac din care este realizata apertura
 Calitatea imaginii creste, in schimb se reduce foarte mult cantitatea de lumina
care ajunge la detector. Pentru a se obţine o imagine observabila, este necesara
utilizarea unor surse de lumina mai puternice (laseri) si a unor detectori mai
sensibili
  Microscopia confocala cu baleiaj (confocal laser scanning microscopy –
CLSM)
 “plimbare” fasciculului laser focalizat pe suprafata probei (baleiaj - scanning)
MICROSCOPIA astfel incat excitatia fluoroforilor se face numai in zona in care se gaseste
fascicolul la un moment dat, lumina emisa fiind preluata de obiectiv si
CONFOCALA focalizata prin apertura pe detector
 Intensitatea luminii emise din fiecare punct al probei este memorata de un
CU BALEIAJ computer si (folosind un program adecvat) imaginea este reconstruita pe
ecran.
 calitatea imaginii achizitionate depinde de reglarea dimensiunii aperturii
(pinhole) si intensitatea/energia laserului (gain)
 scanarea probei cu achizitia de imagini in mai multe planuri succesive pe axa z
perpendiculara pe proba (z-stack) si reconstructia 3D a imaginii
 DETERMINARE
A VIABILITATII  SYTO 9 (480/500 nm)
 Iodura de propidium (490/635 nm)
BACTERIILOR  Afinitate pentru acizii nucleici

https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L7007#/L7007