Microscopia STED

Andrei Diana Alexandra

Data 11.12.2019

Microscopia STED (Stimulated Emission Depletion = „Microscopia stimulată de epuizare a

emisiilor”) ste una dintre tehnicile care alcătuiesc microscopia de super-rezoluție. Creează
imagini de super-rezoluție prin dezactivarea selectivă a fluoroforilor, minimizând aria de
iluminare în punctul focal și îmbunătățind astfel rezoluția realizabilă pentru un sistem dat.
Microscopia STED este una dintre mai multe tipuri de tehnici de microscopie de super rezoluție
care au fost dezvoltate recent pentru a ocoli limita de difracție a microscopiei optice pentru a
crește rezoluția. Aceasta a fost dezvoltată de Stefan W. Hell și Jan Wichmann în 1994, și a fost
demonstrat experimental de către Hell și Thomas Klar în 1999. Hell a primit premiul Nobel
pentru chimie în 2014 pentru dezvoltarea sa.

Fig. 1. Microscopia STED oferă îmbunătățiri semnificative ale rezoluției față de cele posibile cu
microscopie confocală
STED este o tehnică funcțională deterministă care exploatează răspunsul neliniar al fluoroforilor
utilizați în mod obișnuit pentru etichetarea probelor biologice pentru a obține o îmbunătățire a
rezoluției, adică STED permite luarea de imagini la rezoluții sub limita de difracție. Aceasta
diferă de tehnicile funcționale stocastice, cum ar fi microscopie de localizare fotoactivată
(PALM) și microscopie de reconstrucție optică stocastică (STORM), deoarece aceste metode
folosesc modele matematice pentru a reconstrui o limită de sub difracție din multe seturi de
imagini de difracție limitate.

Fig. 2. (a) Diagrama Jablonski care ilustrează procesul de excitație, emisiile stimulate și fluorescența. (b)
Când două spoturi STED limitate de difracție sunt suprapuse cu un punct de excitație limitat cu difracție
și atunci când intensitatea STED este suficient de mare, fluoroforii din regiunea exterioară a punctului de
excitație sunt epuizați efectiv la starea ground prin emisie stimulată. Ca urmare, punctul de fluorescență
efectiv este redus sub limita de difracție, dar numai în direcția decalării.

Aplicații
În ultimii câțiva ani, STED s-a dezvoltat de la o tehnică complexă și extrem de specifică la o
metodă generală de fluorescență. Drept urmare, au fost dezvoltate o serie de metode pentru a
extinde utilitatea STED și pentru a permite furnizarea mai multor informații.
1. Analiză structurală (vizualizarea celulelor si a componentelor sale, a proteinelor, etc)
2. Metode corelative. Datorită funcției sale, microscopia STED poate fi folosită cu alte
metode de înaltă rezoluție. Rezoluția microscopiei electronice cât și cea de forță atomică
este chiar mai bună decât rezoluția STED, dar prin combinarea forței atomice cu STED,
Shima și colab. au putut vizualiza citoscheletul de actină a celulelor canceroase umane
ovariene, observând modificări ale rigidității celulare.
3. Multicolor. Folosind doi coloranți fluorescenți, imaginea colocalizată a grupurilor de
proteine sinaptice și mitocondriale este posibilă cu o rezoluție de până la 5 nm. STED
multicolor a fost, de asemenea, utilizat pentru a arăta că diferite populații de proteine
veziculare sinaptice nu se amestecă cu butoanele sinaptice de scăpare.
4. Studiul celulelor vii
Componentele esențiale ale unui microscop STED sunt:
 sursă laser pulsată pentru excitare și epuizare
 detector sensibil la un singur foton
 oglindă dicroică (pentru a suprapune laserele de excitare și de epuizare și pentru a separa
semnalul de fluorescență de lumina de excitație)
 obiectiv
 placă de fază pentru transformarea pulsului STED într-o formă de gogoșă
 unitate de achiziție de date, de exemplu, un modul TCSPC
 sistem de scanare adecvat

Fig. 3. Schema unui microscop STED

Bibliografie:

1. https://en.wikipedia.org/wiki/STED_microscopy
2. https://www.picoquant.com/applications/category/life-science/sted
3. https://svi.nl/STEDMicroscopy