Microscopie SMI (Spatially Modulated Illumination) și aplicații la nivelul nucleului celular

Iluminarea verticală modulată spațial (Vertico-SMI) este o tehnică de microscopie de

fluorescență în câmp larg, utilizată pentru analiza 3D a celulelor la nivel nanometric, oferind
informații suplimentare despre dimensiunile și pozițiile relative ale regiunilor țintă marcate
fluorescent, permițând astfel măsurări de înaltă precizie a distanțelor dintre ele.
SMI reprezintă o metodă de iluminare modulată spațial ce folosește o sursă laser, iar Vertico
reflectă aranjamentul vertical al axei microscopului, ceea ce face posibilă analiza celulelor fixe,
dar și a celulelor vii cu o rezoluție optică sub 10 nanometri. De asemenea, permite analiza
noninvazivă a aranjamentelor spațiale complexe în eșantioane transparente relativ groase, cum
ar fi nucleul celular.

Vertico-SMI are la bază două metode optice:

1. SMI (iluminare modulată spațial)
In cadrul microscopiei SMI apar modificări ale funcției de dispersie a punctului (PSF), ce
reprezintă de fapt răspunsul impuls al unui sistem optic focalizat. Gradul de dispersie
(estompare) al obiectului punct este o metodă de determinare a calității unui sistem imagistic.
În sistemele de imagini non-coerente, cum ar fi microscoape fluorescente, telescoape sau
microscoape optice, procesul de formare al imaginii este liniar, ceea ce înseamnă că atunci când
două obiecte A și B sunt imaginate simultan, imaginea rezultată este egală cu suma obiectelor
imaginate independent. Cu alte cuvinte: imaginea lui A nu este afectată de imaginea lui B și
invers, datorită proprietății care non-interacție a fotonilor. În sistemul spațial-invariant, unde
PSF este același pretutindeni în spațiul imagistic, imaginea unui obiect complex este convoluția
obiectului real și a PSF.
Sunt procese care modifică funcția de dispersie a punctului (PSF) unui microscop într-o manieră
adecvată, fie pentru a crește rezoluția optică, fie pentru a maximiza precizia măsurătorilor
distanțelor dintre obiectele fluorescente mici în raport cu lungimea de undă a fasciculului de
lumină, fie pentru a extrage diferiți parametri structurali de ordin nanometric, așa cum este și
în cazul microscopiei SMI.
Microscopul SMI dezvoltat la Institutul de Fizică Kirchhoff de la Universitatea Heidelberg
realizează acest lucru în felul următor: Intensitatea fasciculului laser nu este uniformă, spre
deosebire de microscoapele convenționale de fluorescență în câmp larg, dar este modulată
spațial într-o manieră precisă, prin utilizarea a două fascicule laser care interferează de-a lungul
axei, formând un câmp cu undă permanent; principiul câmpului de unde modulat spațial a fost
dezvoltat în 1993. Abordarea de microscopie SMI folosită în aplicația Heidelberg mișcă
obiectul cu mare prezicie în câmpul de undă, sau câmpul de undă în sine este mutat în raport
cu obiectul prin deplasarea de fază. Rezultă o dimensiune axială îmbunătățită și o rezoluție la
distanță.
SMI poate fi combinat cu alte tehnologii de super rezoluție, de exemplu cu 3D LIMON sau
LSI-TIRF, ca interferometru de reflexie internă totală cu iluminare structurată lateral. Această
tehnică SMI a permis achiziționarea de imagini ale distribuțiilor autofluorofore în secțiuni din
țesutul ochiului uman cu o rezoluție optică neegalată anterior. Utilizarea a trei lungimi de undă
de excitație diferite (488, 568 și 647 nm), permite colectarea informațiilor spectrale despre
 semnalul de autofluorescență. Aceasta a fost utilizată pentru țesutul ocular uman afectat de
degenerarea maculară AMD.

2. SPDM (microscopie la distanță spectrală).

SPDM este o microscopie de localizare care atinge o rezoluție optică eficientă de câteva ori mai
bună decât rezoluția optică convențională (aprox. 200-250 nm). Un domeniu important de
aplicare al acestei tehnici este cercetarea genomului (studiul organizării funcționale a
genomului). Un alt domeniu important de utilizare este cercetarea structurii membranelor.