Cunoasterea principalelor tehnici, metode si aparate cu aplicaii

în Laboratorul Clinic
de Biochimie

- metode de masura (spectrometrice, optice, etc)

- tehnici de separare (cromatografice, electroforetice)
- tehnici chimice, enzimatice si imunologice de recunoastere si dozare
- sisteme analitice automatizate, mono si multiparametrice
 Spectroscopia moleculara

• Metoda optica de analiza care are la baza interactiunea radiatiei

electromagnetice (se caracterizeaza prin lungime de unda si frecventa) cu
substanta.

• Majoritatea testelor de chimie clinica realizate pe analizorul automat sunt teste

colorimetrice, concentratia unui anumit analit fiind determinata
spectrofotometric

diferitelor componente
• ROL: biochimice din tesuturi si
– Identificarea lichide biologice

– Dozarea
– Stabilirea formulei moleculare
 Spectroscopia moleculara
Domeniul optic al spectrului electromagnetic
Λ (nm) Domeniul spectral Culoare

180-400 UV Invizibila

400-440 vizibil Violet

440-500 vizibil Albastru

500-580 vizibil Verde

580-600 vizibil Galben

600-620 vizibil Portocaliu

620-760 vizibil Rosu

760-2000 IR Invizibila
 Tipuri de spectre
• Spectru = reprezentarea grafica a cantitatii de
energie absorbita sau emisa de un sistem in functie
de lungimea de unda a radiatiei electromagnetice.

• Spectrele - de emisie
- de absorbtie
Spectrofotometrul = aparat cu ajutorul caruia se poate masura
extinctia/absorbanta unei probe

Componente:

1. Sursa de lumina,
2.Monocromator (sisteme optice care separa un fascicul alcatuit din radiatii cu lungimi de unda diferite
in fascicule cu o singura lungime de unda ; ex:prisme, sisteme de difractie),
3. Celulele fotoelectrice si tuburile fotomultiplicatoare,
4. Cuvele (sticla/plastic/cuart),
5. Dispozitive de afisare a rezultatelor.
• Radiatia monocromatica

• Majoritatea substantelor chimice prezinta

proprietatea de a absorbi selectiv energia
radianta de o anumita lungime de unda (ex. O
solutie colorata absoarbe toata energia radianta
cu exceptia aceleia pe care o percepe ochiul)
 Spectroscopia moleculara

• Spectrofotometria se bazeaza pe un model simplu de trecere a

luminii cu o lungime de unda cunoscuta printr-o proba si masurarea
cantitatii de energie luminoasa care este transmisa (cu ajutorul
fotocelulelor) .

• O raza de lumina este formata din fotoni analit absorbtie fotoni

scade intensitatea luminoasa.
 Spectroscopia moleculara

Legile care guverneaza spectroscopia:

1.LEGEA ABSORBTIEI RADIATIEI

2. LEGEA LUI LAMBERT
3. LEGEA LUI BEER
• Legea Beer-Lambert

I 
log   cl
I 
 o

Io = intensitate luminii incidente

I = intensitatea luminii transmise
 = coeficientmolar extinction coefficient
c = concentratia mediului absorbant (mol/L)
l = latimea mediului absorbant (cm)
 Spectroscopia moleculara

TRANSMITANTA = marimea care exprima procentual, proportia de radiatie care

traverseaza stratul absorbant

ABSORBANTA (A)/EXTINCTIA (E) = proportia de radiatie absorbita de mediul absorbant

SOLUTIA BLANK =solutia de referinta, a carei extinctie trebuie sa fie 0, in acest caz
aparatul fiind ETALONAT (la o anumita lungime de unda).
= solvent + ceilalti reactivi implicati FARA substanta de interes
(frecvent H2Od).

STANDARD (ETALON) = solutie de concentratie cunoscuta a substantei de analizat

= reactivi + solutia standard

!!!! Cp=Csx (Ep/Es) !!!!

 Spectrometria de masa (MS)

Separa ionii pe baza raportului masa/sarcina (m/z).

Sarcinile se aplica proteinelor sau peptidelor prin ionizare;
Proteinele/fragmentele sunt accelerate in vid, prin aplicarea unei diferente de potential

Tipuri de ionizare:
Desorbtia – Ionizarea cu Laser Asistata de Matrice (Matrix-Assisted Laser
Desorption Ionization.) - De regula, MALDI poate provoaca fragmentarea
proteinelor in timpul ionizarii. Mai simpla decat ESI.
Desorbtia-Ionizarea cu Laser Amplificata de Suprafata (Surface Enhanced
Laser Desorbion Ionization) - SELDI
Ionizarea in jet de electroni (Electrospray ionization - ESI) - ESI poate da mase
ale proteinelor intacte sau mase ale fragmentelor.
 MS – Analizoare de masa

• Parametri importanti:
– Sensibilitatea: cat de putini ioni se pot detecta
– Rezolutie: cat de bine se pot determina masele
diferite
– Acuratetea de masa: cat de corecte sunt masele
determinate
 Fotometria cu flacără

• Principiul fotometrului cu flacără se bazează pe măsurarea intensității

luminii emise atunci când un metal este introdus în flacără. Lungimea de
undă a culorii oferă informații despre element, iar culoarea flăcării oferă
informații despre cantitatea de element prezentă în eșantion.
• Pentru ce se folosește fotometria cu flacără?
• Un fotometru fotoelectric cu flacără este un dispozitiv utilizat în analiza
chimică anorganică pentru a determina concentrația anumitor ioni metalici,
printre care sodiu, potasiu, litiu și calciu.
• Odată cu dezvoltarea electrozilor selectivi de ioni (ISE) pentru acești
analiți, fotometrele cu flacără nu mai sunt utilizate în mod obișnuit în
laboratoarele de chimie clinică.
 Spectrofotometru de fluorescență

• Fluorescența apare atunci când o probă excitată (iradiată) cu

lumină de o lungime de undă emite lumină de altă lungime de
undă, de obicei mai lungă.
• Un fluorometru (uneori fluorimetru) este un spectrometru
conceput pentru a măsura acest fenomen.
• Prima parte a fluorometrului este foarte asemănătoare cu
spectrofotometrul și constă dintr-o sursă de lumină și un filtru
sau monocromator pentru a selecta un grup definit de lungimi
de undă de excitație, care sunt apoi direcționate într-o probă.
 Spectrofotometru de fluorescență

• Lumina emisă de probă este apoi trecută

printr-un alt filtru sau monocromator care
selectează lungimea de undă de emisie de
interes, precum și elimină cea mai mare parte a
luminii de excitație, înainte de a fi măsurată de
un detector.
• Există multe variante ale acestui plan de bază,
în funcție de aplicație și de natura eșantionului.
 Chemiluminescenta

• În reacțiile de chimioluminiscență, o parte din energia chimică

generată produce intermediari excitați care se degradează la o stare
fundamentală odată cu emisia de fotoni.
• Radiația emisă este măsurată cu un tub PM, iar semnalul este legat de
concentrația analitului.
• Chemiluminescența este diferită de fluorescență prin aceea că nu este
necesară nicio radiație de excitație și nu sunt necesari monocromatori,
deoarece chemiluminiscența provine de la o singură specie.
 Chemiluminescenta

• Cel mai important, reacțiile de chemiluminiscență sunt reacții de

oxidare a luminolului, esterilor de acridiniu - caracterizate printr-o
creștere rapidă a intensității luminii emise urmată de o
descompunere treptată.
• Avantajele testelor de chimioluminiscență includ limitele de detecție
subpicomolară, viteza (cu reacții de tip flash, lumina este măsurată
doar timp de 10 secunde), ușurința de utilizare (majoritatea testelor
sunt proceduri într-o singură etapă) și instrumentare simplă.
Principalul dezavantaj este că impuritățile pot provoca un semnal de
fundal care degradează sensibilitatea și specificitatea.
 Turbidimetria

• Măsurătorile turbidimetrice se fac cu un spectrofotometru

pentru a determina concentrația de particule într-o probă.
• Cantitatea de lumină blocată de o suspensie de particule
depinde nu numai de concentrație, ci și de dimensiune.
• Deoarece particulele au tendința de a se agrega și de a se
depune din suspensie, manipularea probei devine critică.
Funcționarea instrumentului este aceeași ca pentru orice
spectrofotometru.
 Nefelometria

• Nefelometria este similară, cu excepția faptului că lumina împrăștiată

de particulele mici este măsurată la un unghi față de fasciculul incident
pe cuvetă.
• Lumina monocromatică obține o împrăștiere uniformă și minimizează
încălzirea probei.
• Anumite instrumente folosesc lasere ca sursă de lumină
monocromatică; cu toate acestea, poate fi utilizat orice monocromator.
 Cromatografia

Metoda de identificare, purificare si dozare a compusilor, bazata

pe separarea lor intre doua faze:
• Una stationara (lichida/solida)
• Una mobila (gaz/lichid)

Rol:
• Se utilizeaza la obtinerea substantelor foarte pure certificatul de
calitate “substanta cromatografic pura”,
• Este o metoda foarte sensibila, putandu-se detecta cantitati de ordinul
nanogramelor.
Cromatografia
 GAZ CROMATOGRAFIA
• Se aplica compusilor organici volatili

• Daca faza stationara este :

– Lichid gaz-lichid cromatografia
– Solid gaz-solid cromatografia
 LICHID CROMATOGRAFIA
• Permite separarea proteinelor in functie de marimea
lor
• Proba supusa separarii, poate
– 1. trece printr-o coloana ce contine gel
(CROMATOGRAFIE DE EXCLUDERE)
– 2. trece printr-un material anorganic absorbant
(CROMATOGRAFIE DE ADSORBTIE)
– 3. trece printr-o rasina schimbatoare de ioni
(CROMATOGRAFIE DE SCHIMB IONIC)
 Cromatografia de excludere moleculara
(gel filtrarea)

• Separarea moleculelor din solutie se face in functie de marimea lor pe

masura ce trec printr-o coloana de bile (agaroza, dextran acrilamid) legate
intre ele intr-o retea tridimensionala, formandu-se astfel pori de diferite
dimensiuni (sita molexulara)

• In lichidul care paraseste coloana apar intai moleculele cu dimensiuni mari

si mai tarziu acelea cu dimensiuni mici.
 Cromatografia de schimb ionic
• Se bazeaza pe stabilirea unor legaturi ionice intre sarcinile electrice ale
moleculelor ionizate din amestecul de separat si sarcinile ionice de semn
contrar ale rasinii schimbatoare de ioni cu care este umpluta coloana (faza
stationara).
• Faza mobila este reprezentata de o solutie tampon (pH-ul acestei solutii
fiind extrem de importanat!!!).
• Cand o proteina trece prin coloana se poate lega de matrice si poate fi in
continuare eluata prin cresterea concentratiei ionice a solutiei tampon.
 Cromatografia de inalta performanta
(HPLC)
• Metoda cu mare putere de rezolutie si reproductibilitate.

• O solutie care contine un amestec de compusi care urmeaza sa fie

identificati/purificati, este trecuta printr-o coloana umpluta cu granulele
unor rasini insolubile, cu diametru mic.

• Materialul care umple coloana este f. dens – solutia pompata in coloana

sub presiune mare.
 2.Electroforeza

Metoda de separare a componentelor unui amestec pe baza diferentelor intre vitezele de migrare in camp
electric.

Viteza de deplasare aparticulei in camp electri este:

- DIRECT PROPORTIONALA CU: sarcina si intensitatea campului
electric
- INVERS PROPORTIONALA CU: raza particulei si vascozitatea
mediului
Incarcarea electrica a proteinelor este determinata de numarul de aa cu catene laterale acide (ac.glutamic,
ac. aspartic) sau cu catene laterale bazice (histidina, tirozian, arginina).

La un anumit pH, numit punct izoelectric (pI), proteina are:

- numarul gruparilor incarcate + egal cu numarul gruparilor incarcate -,
- sarcina 0, solubilitate minima si nu migreaza in camp electric.

Daca pH-ul mediului>pI, proteinele sunt incarcate NEGATIV (ANIONI) si vor migra spre ANOD
Daca pH-ul mediului<pI, proteinele sunt incarcate POZITIV (CATIONI) si vor migra spre CANOD
2.Electroforeza – componentele necesare

Suporturi de migrare:

- hartia de filtru

- acetat de celuloza

- gel de agaroza

- gel de poliacrilamida (PAGE)

 2.Electroforeza – componentele necesare

Gelul de poliacrilamida se formeaza prin polimerizarea vinilica a monomerilor de acrilamida

rezultand lanturi lungi, acestea vor fi reticulate de catre N,N‘metilen-bis-acrilamida,
formandu-se legaturi covalente intre lanturi (“sita moleculara”)

Se mai utilizeaza:
1. Un catalizator-initiator al polimerizarii –
persulfatul de amoniu , S2O8(NH4)2
2. Un agent care realizeaza o polimerizare
regulata – TEMED, tetrametilendiamina
2.Electroforeza – componentele necesare
2.Electroforeza – componentele necesare
2.Electroforeza – componentele necesare
2.Electroforeza – componentele necesare
2.Electroforeza – componentele necesare
2.Electroforeza – componentele necesare
2.Electroforeza – componentele necesare
2.Electroforeza – componentele necesare
2.Electroforeza – componentele necesare

Proba - amestecul de proteine plasmatice - se afla intr-un tub Eppendorf,

impreuna cu:
– Reactivul de culoare (Albastru de bromfenol)

– Uree (denaturant pt leg de H)

– SDS (dodecilsulfat de sodiu)

– Mercaptoetanol (denaturant pentru leg de S)

– Glicerol (densitate mare)

2.Electroforeza – componentele necesare
2.Electroforeza – componentele necesare
2.Electroforeza – componentele necesare

Dupa migrare:

– Se dezasambleaza aparatul

– Se indeparteaza gelul (inclusiv cel de concentrare) de pe placute si se

marcheaza pozitia 1, taind un colt superior al gelului

– Se introduce gelul in solutia de colorare (Coomassie Brilliant Blue) –

20 min

– Se introduce gelul in solutia de decolorare – se lasa cateva ore

 2.Electroforeza

• Identificarea:
1. Compararea benzilor in functie de un marker cu greutatea moleculara cunoscuta (pipetat in
primul godeu)

2. Western Blot
 2.Electroforeza

• Cuantificarea benzilor proteice

Prin densimetrie (majoritatea densiometrelor, atasate aparatelor de electroforeza, pot
integra automat fiecare banda obtinuta si prezenta procentual rezultatele
 2.Electroforeza

Se obtin 5 (6) benzi:

Albumina : 55-65%

Alfa-1-globulinele (fractiunea majora este alfa-1-antitripsina): 2- 4%

Alfa-2-globulinele (alfa-2-macroglobulina) : 6-12%

Beta-globulinele (lipoproteinele cu densitate joasa – LDL) : 8-12%

Gamma-globulinele (contin anticorpii): 12-22%

Albumina este o fractiune omogena, avand cea mai mare mobilitate electroforetica.
Globulinele prezinta mobilitatea cea mai mica, iar fractiunile alfa si beta, au o mobilitate intermediara
 HIPOPROTEINEMIA

Scaderea concentratiei proteinelor plasmatice <5,5 g/dL

ƒ

Hipoproteinemia RELATIVA: semnifica hemodilutie

Cauze:
- hiperhidratare (falsa hipoproteinemie)

- sarcina - situatie fiziologica

- perfuzii masive

- retentii hidrosaline
 HIPOPROTEINEMIA

Hipoproteinemia ABSOLUTA:
Cauze:
1.Pierderi de proteine
- pe cale renala (sdr. nefrotic)
- pe cale digestiva (enteropatie exudativa)
- cutanata (arsuri)
- respiratorie (bronsiectazii)

2. Scaderea sintezei de proteine

- primara:defecte genetice ale metabolismului aminoacizilor
- secundara unor carente de aa – malnutritie, malabsobtie
- secundara unor afectiuni hepatice

3.Cresterea catabolismului proteinelor

- Traumatisme, septicemie, neoplazie
 HIPERPROTEINEMIA

Definitie: cresterea concentratiei proteinelor plasmatice >8 g/dL

Hiperproteinemia RELATIVA: semnifica hemoconcentratie (deshidratarea extracelulară) ‫܈‬

Cauze:
- transpiratii profuze
- varsaturi severe, diaree
- nefropatii tubulo-interstitiale
- diabet zaharat
- diabet insipid
 HIPERPROTEINEMIA

Hiperproteinemia ABSOLUTA
Cauze:
1. Cresterea productiei de Ig
1. Gamapatii policlonale (cresteri difuze) - infectii, boli autoimune
2. Gamapatii monoclonale (peak omogen) - productie de paraproteine (sunt Ig
normale ca structura, dar produse in exces de catre o singura clona celulara, in curs
de multiplicare anarhica):
- Plasmocitom (mielom multiplu)
- LLC
- Limfoame cu celula B
- Gamapatie idiopatica

3. Gamapatii oligoclonale (mai multe benzi omogene) – boli autoimune, artrita

reumatoida, LED