Lucrarea nr.

5
Metode spectrofotometrice de dozare

Cluj-Napoca
Metode spectrofotometrice de dozare

 Metodele spectofotometrice se bazează

pe absorbţia radiaţiilor electromagnetice
 Radiaţia electromagnetică este
caracterizată de: viteza de
propagare, lungime de undă,
frecvenţă etc.
 Energia unei unde elecromagnetice
este direct proporţională cu
frecvenţa şi invers proporţională cu
lungimea de undă
Metode spectrofotometrice de dozare

 Spectrofotometria
 Se ocupă cu măsurarea cantitativă a proprietăților de reflexie sau de transmisie ale unui material
(substanță) în funcție de lungimea de undă
 Termenul de spectrofotometrie este specific măsurătorilor în care este utilizată radiația
electromagnetică din spectrul infraroșu (IR), vizibil (VIS) și ultraviolet (UV), ea făcând astfel parte
din spectroscopia electromagnetică
 În practică, metoda se bazează pe proprietatea de absorbție sau de transmisie a compușilor
chimici la diverse lungimi de undă
 Metodă calitativă pentru identificarea prezenței unei substanțe într-o soluție
 Metodă cantitativă pentru identificarea concentrației unei substanțe dintr-o soluție
 Orice compus chimic absoarbe, transmite sau reflectă lumină (radiație electromagnetică) în
cadrul unui interval de lungimi de undă iar aparatele destinate acestor măsurători se numesc
spectrofotometre
Metode spectrofotometrice de dozare

 Spectrofotometrul
 Utilizează transmiterea luminii printr-o soluție →
determinarea concentrației unui solut în soluția
respectivă
 Utilizează o prismă pentru separarea luminii
 Se bazează pe un model simplu de trecere a luminii
de lungime de undă cunoscută printr-o probă și
măsurarea cantității de energie luminoasă care e
transmisă
 Se realizează prin plasarea unei fotocelule în
partea opusă a probei respective
Metode spectrofotometrice de dozare

 Spectrofotometrul
 O rază de lumină este formată din fotoni
 Când un foton întâlnește o moleculă de analit → analitul absoarbe fotonul

Fluctuațiile voltmetrice
Sursă de lumină sunt proiectate pe o scală
Prismă metrică/digital sau sunt
Un suport pentru probe înregistrate într-un
Fotocelulă computer
Metode spectrofotometrice de dozare

 Spectrofotometrul
 O sursă ideală ar trebui să emită o radiaţie continuă cu intensitate uniformă pe un domeniu
larg de lungimi de undă
 Sistemul de selectare a lungimii de undă poate fi format din filtre colorate, monocromatoare cu
reţea de difracţie sau cu prismă
 Cuvele trebuie să aibă feţele paralele şi curate
 În funcţie de domeniul de utilizare pot fi din sticlă sau material plastic pentru domeniul VIS, respectiv
din cuarţ pentru domeniul UV
 Detectorul este o celulă fotoelectrică ce converteşte fluxul luminos într-un curent electric
măsurabil cu un microampermetru.
Metode spectrofotometrice de dozare

Denumirea metodei Principiul metodei Sensibilitatea

Warburg-Cristian AA aromatici absorb radiația cu λ = 280 nm 10 µg

Tombs și colaboratorii Legăturile peptidice absorb radiația cu λ = 210 nm 0,5 µg

Gornall (metoda biuretului) Două legături peptidice adiacente formează cu Cu2+ în mediu bazic, 100 µg
un complex colorat violet care absoarbe radiaţia electromagnetică
cu λ = 540 nm
Lowry Gruparea fenolică a Tyr şi nucleul indolic al Trp reacţionează cu 1 µg
acizii fosfotungstic şi fosfomolibdenic (agenţi oxidanţi) şi formează
compuşi coloraţi albastru. Combinând această reacţie cu reacţia
biuretului se formează compuşi albastru-purpuriu care absorb
radiaţia electromagnetică cu λ = 600 nm
Bradford Colorantul Coomasie brilliant blue se leagă de regiunile hidrofobe 0,5 µg
ale proteinelor şi formează complexe care absorb radiaţia cu λ =
595 nm
Metode spectrofotometrice de dozare

 Interpretarea rezultatelor
 Interval de referinţă ale proteinemiei: 6 – 8 g/100 ml
 Variaţii patologice
 Hiperproteinemiile
 aparente (prin hemoconcentraţie)
 reale (inflamaţii cronice, colagenoze, gamapatii monoclonale, etc.)
 Hipoproteinemiile
 aport scăzut de proteine (malnutriţie, inaniţie)
 tulburări de absorbţie
 biosinteză deficitară (afecţiuni hepatice cronice, insuficienţă hepatică)
 pierderi masive la nivel renal (sindrom nefrotic), intestinal, tegumentar (arsuri extinse), hemoragii