Aplicațiile spectrofotometriei

IR în controlul
medicamentelor

Pregătire rezidenţiat
• Proprietatea substanțelor de a absorbi selectiv radiațiile
electromagnetice stă la baza spectofotometriei de absorbție și
este folosită pentru identificare, determinarea purității și
dozare.

• Spectrele de absorbție se obțin la trecerea unui fascicul de

radiații continue prin substanța de analizat care poate absorbi o
parte din energia acestuia
• Cantitatea de energie absorbită este în funcție de structura și
numărul moleculelor și al atomilor substanței cu care interacționează
fasciculul de radiații
 Radiaţie
reflectată ABSORBŢIE

Interacţiunea
radiaţiei Radiaţie Radiaţie
Radiaţie refractată
electromagnetice incidentă
Probă transmisă

cu materia

Radiaţie
împrăştiată Radiaţie
emisă
 • frecvenţa (ν) – numărul de oscilaţii al undei
Proprietăţile undei electromagnetice per secundă
electromagnetice • lungimea de undă (λ) – distanţa dintre 2 maxime sau
minime

𝑉 𝐶
𝜆= =
𝜈 𝜈
Proprietăţile
undei
electromagnetice

E = h υ = h c / λ = h c 𝜈ҧ
• În funcție de domeniile spectrale în care are loc absorbția
luminii se deosebesc:
• spectofotometria în ultraviolet ( 185 - 400 nm)
• spectofotometria în vizibil (400 - 800 nm)
• spectofotmetria în infraroșu (peste 800 nm)
• Pentru etalonarea scării pe care sunt înscrise lungimile
de undă ale spectofotometrului se procedează la
determinarea poziției liniilor spectrale emise de:
• lampa de hidrogen la 486,1 nm și la 656,1 nm și de
• lampa cu vapori de mercur la 265,3 nm, la 313,2 nm, la
365,0 nm, la 404,7 nm și la 546,1 nm, efectuându-se
corecțiile corespunzătoare
• Scara absorbanțelor se verifcă și se etalonează folosind
o soluție preparată din 60 mg dicromat de potasiu (s.r.)
care se dizolvă în acid sulfuric 0,005 mol/l și se
completează cu același solvent la 1000 ml, într-un balon
cotat.
• Pentru această soluție se obțin următoarele valori ale
absorbanțelor, corespunzătoare unui strat de soluție cu
grosimea de 1cm:
• λ = 235 nm; A = 0,745 ±0,01
• λ = 257 nm; A = 0,870 ±0,015
• λ = 313 nm; A = 0,290 ±0,01
• λ = 350 nm; A = 0,645 ±0,01
• SPECTOFOTOMETRIA ÎN INFRAROȘU
• Spectofotometrele folosite în domeniul infraroșu sunt astfel construite
încât permit să se obțină lumina monocromatică în intervalul de la 5000
cm⁻¹ la 400 cm⁻¹.
• Spectrul de absorbție în infraroșu se obține grafic prin reprezentarea
transmitanței în procente în funcție de numărul de undă
𝑰
T%= ∗ 𝟏𝟎𝟎
𝑰𝟎

în care:
• T % = transmitanța substanței de analizat (în procente)
•I = intensitatea luminii transmise
• Iₒ = intensitatea luminii incidente
• Numărul de undă folosit în domeniul infraroșu este o mărime proporțională
cu frecvența și este inversul lungimii de undă în vid. Unitatea de măsură a
numărului de undă este inversul centimetrului (cm⁻¹), conform raportului
următor:
𝟏𝟎𝟒
ν=
λ
în care:
υ = numărul de undă (în cm⁻¹) ;
λ = lungimea de undă (în micrometri).

• Benzile de absorbție în infraroșu și intensitățile acestora sunt caracteristice

substanțelor și se pot folosi pentru identificare și dozare.
• Domeniul spectral infraroșu se subdivide în trei regiuni:

• IR apropiat: λ = 0,8 - 2,5 μm

υ = 12500 - 4000 cm⁻¹

• IR mijlociu: λ = 2,5- 25 μm
υ = 4000 - 400 cm⁻¹

• IR îndepărtat: λ = 25 – 1000 μm
υ = 400 - 10 cm⁻¹
• În continuare ne vom referi exclusiv la domeniul IR mijlociu – denumit
simplu Spectrul IR (λ = 2,5- 25 μm, υ = 4000 - 400 cm⁻¹)

• În acest domeniu spectral se situează benzi de absorbție ce corespund

vibrațiilor în stare fundamentală atribuite diferitelor grupări funcționale.

• Acesta cuprinde mai jos de 1500 cm⁻¹ o regiune foarte complexă,

bogată în informații, denumită “regiunea amprentei” care se constituie
ca un fel de “semnătură” a moleculei analizate
• Așa cum am arătat, spectrele de absorbție (ca și cele de emisie) iau
naștere prin interacțiunea dintre radiația electromagnetică luminoasă și
materie: atomi și molecule
• Molecula, spre deosebire de atom, pe lângă diferitele stări de energie
electronică, mai posedă energie cinetică de rotație, vibrație și translație, care
sunt energii cuantifícate (exceptând translația).

• Între aceste nivele pot avea loc tranziții sub acțiunea radiațiilor IR,
ceea ce se va reflecta într-un spectru de benzi de absorbție așezate în
funcție de distanța dintre nivelele energetice
• Domeniul spectral IR mijlociu (mediu) este încadrat de
domeniul IR apropiat și de domeniul IR îndepărtat.

• Spectrele din IR apropiat corespund vibrației mișcărilor de

translație ale atomilor unul în raport cu celălalt

• Cele din IR mijlociu corespund mișcărilor de rotație - vibrație

ale moleculelor iar cele din IR îndepărtat tranzițiilor de rotație pură
• Pentru identificarea metanolului se utilizeaza spectrul sau IR, in care se constata ca
• apare o banda de vibratie de intindere a gruparii –OH (νO-H) la cca 3400cm-1,
• o vibratie de deformare in plan (δ-OH) la 1400-1300 cm-1,
• si o alta vibratie de intindere (νO-H) la 1050-1060 cm-1, caracteristica alcoolilor primari.
• restul benzilor din acest spectru se datoreaza unor moduri de vibratie al grupei –C-H (la cca 2900-
2800 cm-1), CH2 (la cca 1440-1450 cm-1) si –CH3 (la cca 1390-1370 cm-1)
• Reprezentarea grafică a unui spectru se realizează
înscriindu-se
• pe abscisă lungimea de undă – λ (m) sau numărul de undă -
υ (cm⁻¹),
• iar pe ordonată se reprezintă transmitanța în procente (T)
sau absorbanța (A) sau extincția (E), coeficientul molar de
extincție ᶓ (sau log ᶓ)
• Mai frecvent (F.R.X.), spectrul de absorbție IR se obține prin
reprezentarea transmitanței în procente, în funcție de numărul
de undă

𝑰
T%= ∗ 𝟏𝟎𝟎
𝑰𝟎

în care:
• T % = transmitanța substanței de analizat (în procente)
• I = intensitatea luminii transmise
• Iₒ = intensitatea luminii incidente
• Benzile de absorbție în IR și intensitățile acestora sunt
caracteristice substanțelor, grupelor funcționale ale
acestora și pot fi utilizate pentru identificare, dozare și
analiză structurală
• Pentru determinări cantitative este necesară stabilirea
unei relații matematice între intensitatea radiației
absorbite de probă și concentrația compusului
• Soluțiile și lichidele se examinează sub forma unui film
obținut între două ferestre sau prin introducerea în cuve
confecționate din material transparent pentru lumina IR
(ex. clorură de sodiu, bromură de potasiu, fluorură de
litiu), folosind pentru compensare ferestre sau cuve din
același material și aceeași grosime
• În cazul soluțiilor se folosește și un lichid de
compensație
• Substanțele solide se pot analiza folosind următoarele 3 procedee de
preparare a probelor:
• Prepararea sub formă de pastă. Se triturează bine 10 – 20 mg substanță de
analizat cu 0,1 ml lichid de imersie (de obicei parafină lichidă de puritate
spectrală). Se înregistrează spectrul IR, folosind pentru compensare
parafină lichidă de puritate spectrală
• Dispersie sub formă de comprimate. Se folosește bromură de potasiu de
puritate spectrală. 1 – 3 mg probă și 0,3 g bromură de potasiu se
omogenizează și se comprimă. Se înregistrează spectrul IR, folosind pentru
compensare un comprimat preparat în aceleași condiții fără substanța de
analizat
• Obținerea unei pelicule. Soluția unei substanțe de analizat într-un solvent
organic volatil se toarnă pe o suprafață de mercur într-o capsulă. Se
evaporă solventul. Se înregistrează spectrul IR al peliculei obținute
• Spectrul în infraroșu al probei de analizat prelucrate prin unul din
procedeele a, b sau c se compară cu spectrul în infraroșu obținut cu o
substanță de referință prelucrată în aceleași condiții cu proba de analizat.
• Dacă spectrele obținute prin procedeele a și b, descrise pentru
substanțele solide, prezintă deosebiri sensibile față de spectrele
substanțelor de referință și dacă în monografía respectivă un se fac alte
precizări, atât substanța de analizat, cât și substanța de referință se
recristalizează din același solvent, prevăzut în monografía respectivă, și
determinările se repetă.
• Verificarea și etalonarea numerelor de undă ale spectofotometrelor în
infraroșu se efectuează folosind spectrul de referință al filmului de
polistiren
• În domeniul farmaceutic, spectroscopia IR oferă multiple posibilități de aplicații, în analiza
chimică și fizică sau în laboratoare de sinteză.
• Mai jos sunt redate câteva din aceste aplicații:
• Identificarea unor substanțe active, a excipienților utilizați la condiționarea în forme
farmaceutice, identificarea unor produși intermediari în sinteza unor substanțe
farmaceutice, sau materiale de ambalaj
• Evaluarea calitativă a unor substanțe active, excipienți , utilizați la condiționarea unor
forme farmaceutice, a unor intermediari în sinteza unor substanțe farmaceutice, sau
materiale de ambalaj, îndeosebi atunci când este vorba de a compara loturi diferite de
produce sau de schimbare a furnizorilor
• Cuantificarea unor substanțe active într-o matrice sau determinarea unor urme de apă sau
solvenți
• Cuantificarea unor impurități, spre exemplu gaz sau substanțe anorganice
• Urmărirea unor reacții, de exemplu în cazul unor sinteze
• Determinarea proprietăților stării solide sau a unor polimorfi
• Aparatura
• Spectofotometrele pentru determinări IR cele mai folosite,
funcționează pe principiul transfomatei Fourier (FR-IR) și
sunt alcătuite din:
• o sursă de lumină (filament ceramic de exemplu)
• interferometru
• un dispozitiv de introducere a probelor
• un detector
• un dispozitiv care asigură înregistrarea spectrului IR și evaluarea
lui (ordinator)
• Pentru identificarea metanolului se utilizeaza spectrul sau IR, in care se constata ca
• apare o banda de vibratie de intindere a gruparii –OH (νO-H) la cca 3400cm-1,
• o vibratie de deformare in plan (δ-OH) la 1400-1300 cm-1,
• si o alta vibratie de intindere (νO-H) la 1050-1060 cm-1, caracteristica alcoolilor primari.
• restul benzilor din acest spectru se datoreaza unor moduri de vibratie al grupei –C-H (la cca 2900-
2800 cm-1), CH2 (la cca 1440-1450 cm-1) si –CH3 (la cca 1390-1370 cm-1)
• Aplicatii ale spectrometriei in infrarosu la controlul medicamentelor
• Interpretarea unui spectru in IR reprezinta un mijloc deosebit de important de
determinare a structurii unei substante, a degradarii ei chimice, a identitatii,
puritatii si evaluarii ei cantitative.
• Analiza structurala
• Inainte de a incerca sa interpretam un spectru este necesar ca acesta sa prezinte o rezolutie
convenabila (distanta dintre doua benzi consecutive), sa provina de la o substanta purificata,
sa avem in vedere caracteristicile aparatelor folosite (domeniul de inregistrare, acuratetea si
reproductibilitatea pozitiei unei benzi in spectru, exactitatea cu care este redata transmisia
reala) si tehnica de preparare a probelor.
• Spectrele substantelor in stare gazoasa sint diferite de cele ale celor in stare lichida sau
solida.In cazul cind proba este lichida, trebuie sa tinem seamad efectele dizolvantului
utilizatasupra pozitiei si intensitatii benzilor de absorbtie.
• Structura substantelor este mai bine evidentiata pe probele in stare solida. Astfel, izomerii
optici in solutie dau spectre identice, in timp ce in stare solida, spectrele lor sint diferite
• Studiul spectrelor in IR tine seama de impartirea regiunilor
spectrale in 4 subdiviziuni
1. Regiunea legaturii elementelor cu hidrogenul (3700-2500cm-1); C-
H, O-H, N-H, S-H
2. Regiunea legaturii triple (2500-2000 cm-1); C=C;C=N;C=C=C
(duble legaturi cumulate)
3. Regiunea legaturii duble ( 2000-1600cm-1); C=C;C=O;C=N
(conjugarea scade frecventa acestor grupari)
4. Regiunea legaturii simple (1500-700 cm-1); vibratiile de deformare
ale simplelor legaturi:C-H, O-H,N-H si celel de valenta ale
grupelor:C-O, C-C,C-N ( cu mase apropiate si posibilitati de
interactiune regiune “amprenta”)
• Spectrul in IR reprezinta o proprietate fizica specifica a moleculei, care
nu se repeta la o alta molecula oricit de mult s-ar asemana structurile lor,
dar care este identica pentru substante cu structuri identice.
• Daca doi compusi identici prezinta in spectrele lor diferente ale pozitiei
si intensitatii relative a benzilor, farmacopeele recomanda recristalizarea
ambilor compusi din acelasi solvent si repeatrea determinarii pe probe in
stare solida, sau dizolvarea probelor in acelasi solvent si efectuarea
spectrelor in aceleasi conditii.
• In acest fel este posibila evidentierea formelor cristaline diferite ale
aceleiasi substante.Astfel, pentru acetatul de cortizon s-au descoperit 5
forme polimorfe diferite:3 forme polimorfe ortotrombine si 2
monoclinice
• Identificarea formelor polimorfe ale substantelor
medicamentoase
• Este una din cele mai importante aplicatii ale
spectrofotometriei in IR.Fiecare polimorf are parametrii sai
fizici proprii care determina diferentele dintre ei in stare
solida.
• Metodele de determinare se bazeaza tocmai pe aceste
diferente ale polimorfilor in stare solida: difractia cu raze X,
analiza termica spectrometria IR si masurarea solubilitatii
sau a vitezei de dizolvare
• Spectrul infrarosu, criteriu de identitate a substantelor medicamentoase
• Spectrul IR permite o identificare mai sigura decit prin alte metode. Numarul benzilor fundamentale,
armonice si de combinatii complica spectrul, dar ofera garantii suplimenatre de identificare.In practica
se intilnesc doua cazuri diferite:identificarea substantelor cu structuri necunoscute si cunoscute
• Identificarea substantelor cu structuri necunoscute se poate face prin interpretarea spectrelor IR si
atribuirea benzilor diferitelor grupari functionale sau prin compararea spectrului IR al substantei
necunoscute cu spectrul unei substante cunoscute presupuse. In acest ultim caz se compara spectrele
celor doua substante obtinute in concentratii identice, in doua medii si in doua stari de agregare diferite
(tableta si solutie sau suspensie si solutie)
• Compararea celor doua spectre se face prin suprapunerea lor si iluminarea cu un fascicul puternic de
lumina sau prin inregistrarea ambelor spectre pe aceeasi hirtie ( care permite si compararea
intensitatilor benzilor respective)
• Identificarea substantelor cunoscute se poate face prin compararea spectrului substantei de determinat
cu cel al unei substante de referinta obtinut in aceleasi conditii sau cu spectrul publicat ca atare sau sub
forma unor date intabelate.Spectrometria in IR ne permite astfel identificarea omologilor aceleiasi clase
care prin alte metode nu se pot diferentia ( barbiturice, xantine, fenotiazine, sulfamide, peniciline,
enantiomeri, stereoizomeri, etc)
• Spectrul infrarosu-criteriu de puritate
• Aparitia unor benzi suplimentare fata de spectrul substantei pure permite
decelarea unor impuritati. Sensibilitatea metodei variaza dupa natura impuritatilor
(de exemplu, o singura impuritate avind benzi foarte intense este mai usor de
decelat decit un amestec de impuritati lipsite de benzi intense). De multe ori, o
impuritate in cantitate de 4-5% nu este vizibila in spectru infrarosu. Daca se
cunoaste spectrul substantei pure, se poate afla spectrul impuritatii prin diferenta.
• Determinarea pricipiilor active din forme farmaceutice
• Valabilitatea testului de identificare depinde in mare masura de puritatea produsului. In
aproape toate cazurie se impune extractia sau separarea principiilor active din forme
farmaceutice; solutiile extractive se supun uneori recristalizarii repetate a produsului inainte
de a fi determinat.
• Determinari cantitative in IR
• Principiile care stau la baza determinarilor in UV sint valabile si pentru IR. In IR avem
posibilitatea de a alege dintre multiplele benzi care alcatuiesc spectrul, pe cea mai
intensa, respectiv pe aceea care se refera la o anumita parte din molecula, de obicei la
gruparea responsabila de activitatea biologica.Aplicarea legii lui Lambert-Beer, corelata
cu cunoasterea exacta a coeficientului de extinctie al unei benzi caracteristice, permite
determinari exacte de concentratie sau a gradului de puritate al unui compus

• Calculul concentratiilor se realizeaza fie prin interpolarea extinctiilor pe curbele de

etalonare fie prin directa comparare a absorbtiei probei cu cea a standardului utilizat, a
suprafetelor integrate, corespunzatoare curbelor lor de absorbtie sau a inaltimii
“picurilor”

• Orice determinare cantitativa are la baza masurarea a doua valori: energia radiatiei
incidente –Io-determinata in spectru prin tehnica liniei de baza (a) sau a punctului de
baza (b) sau liniei de 100% (c) si energiei transmisa -I-prezentata prin traseul spectrului
• Din raportul distantelor masurate in cm sau mm se determina absorbanta sau transmitanta:
• A=IgxIo/I sau A=Igx1/T; T=1/A sau T=I/Io

• Verificarea legii Lambert –Beer prin care se evidentiaza legatura dintre T (transmitanta), A
(absorbanta) si concentratie, are aceeasi semnificatie ca si in UV si se realizeaza pe o banda
destul de intensa din spectrul substantei atribuita de preferinta unei grupari caracteristice
moleculei si independenta de formarea legaturilor de hidrogen sau asociatiilor moleculare.
• Exemplu:determinarea penicilinelor de semisinteza. In forma acida spectrele lor in IR, in solutie
cloroformica, prezinta 3 benzi caraceristice atribuite legaturilor C=O din 1) ciclul b-lactamic(1790cm-
1);2) grupa –COOH (1740cm-1) si 3)amida catenei laterale (1965cm-1).

• Pentru determinarea cantitativa s-a ales banda corespunzatoare ciclului B-lactamic data fiind
importanta integritatii acestei functii pentru activitatea terapeutica, si mai ales, pentru
considerentul ca acest domeniu este mai putin afectat de interferentele produse de
excipientii din formele farmaceutice. Pe de alta parte intensitatea acestei benzi scade in
spectrul solutiilor de penicilina alterate, reprezentind un mijloc de determinare al gradului de
alterare
• Spectrul solutiilor de penicilina alterate
• Spectrul solutiilor de penicilina alterate
• Spectofotometrele IR se pot asocia cu un microscop pentru ca probele
analizate, respectiv imaginea acestora să fie mărită, sau cuplat cu aparat
de analiză termică sau cromatografică.

• În funcție de caracteristicile probei analizate (starea de agregare) acestea

pot fi determinate în transmisie, în reflexie, în reflexie total atenuată
(ATR).
• Metoda IR se impune prin specificitatea sa în ceea ce privește
• identificarea diferitelor specii moleculare, izomerilor,
stereoizomerilor, polimorfilor, omologilor aceleiași clase,
• cât și prin posibilitățile pe care ni le oferă în ceea ce privește
determinările cantitative
• privind gradul de impurificare,
• studiile de stabilitate
• și, în ultimul timp, evaluarea interacțiunilor dintre medicamente,
medicamente – excipient, medicament – materiale de ambalaj etc.
• Asociată cu alte metode (UV, SM, RMN) cât și cu tehnicile de
separare cromatografică (CG, CSS, HLPC), metoda IR poate
răspunde la cele mai diferite probleme legate de structura,
calitatea și cantitatea substanței medicamentoase ca atare, din
amestecuri și forme farmaceutice
• Concluzii
• Metoda poate fi aplicată la stabilirea structurii, identității, purității și
dozarea majorității substanțelor
• Se pot analiza substanțe lichide, solide sau gazose
• Sunt necesare condiții speciale,
• Solvenți
• Celule
• Abilități speciale în special pentru prepararea pastilelor de KBr
• Pentru analiza structurală este necesară completarea datelor cu studii
RMN, SM, Raman