MEDICINA GENERALA

AN UNIVERSITAR 2014-2015
PARAZITOLOGIE MEDICALA
LP 5

CARACTERELE GENERALE ALE FUNGILOR

(DEFINITIE, MORFOLOGIE, CLASIFICARE).
LEVURI DE INTERES MEDICAL (CANDIDA,
CRYPTOCOCCUS).

CARACTERELE GENERALE ALE FUNGILOR

Definitie:

Fungii sunt :
bioentitati microscopice,
eucariote,
uni- sau pluricelulare,
heterotrofe,
contin chitina in peretele celular.

MORFOLOGIE
Se bazeaza pe:
aspectul si
structura partii asimilatoare a fungului- talul,
permite descrierea a 3 tipuri principale de fungi:
Levuriformi
Filamentosi
Dimorfici

1. Levuriformi:
microorganisme unicelulare,
de forma rotunda sau alungita,
se multiplica in principal prin burjeonare;
burjeonul- denumit blastospor sau blastoconidie,
fie se poate desprinde de celula-mama printrun proces de fisiune,
fie ramane atasat la aceasta si genereaza
succesiv noi indivizi, sub forma unor agregate
liniare pseudohife.

2. Filamentosi:

microorganisme pluricelulare,

cu talul alcatuit din filamente

tubulare, septate sau nu, denumite hife;

hifele sunt de obicei ramificate si aglomerate

formand miceliul.

3. Dimorfici

microorganisme care apar

sub forma de levuri in tesuturile

organismelor parazitate sau la 370C in vitro

si

sub forma filamentoasa cand sunt cultivate

la temperatura camerei sau la 300C, pe medii
uzuale.

LEVURI DE INTERES MEDICAL

GENERALITATI

Levurile sunt fungi unicelulari care se multiplica vegetativ

(asexuat)
fie prin burjeonare,
fie prin fisiune.

Habitatul lor natural este extrem de diversificat.

Levurile sunt intalnite la:

plante,
insecte,
animale si om (pe piele, mucoase si in tractul digestiv),
in sol,
apa (dulce si sarata),
aer.

Au caracter ubicuitar.
Levurile de interes clinic sunt
microorganisme aerobe sau facultativ anaerobe,
mezofile si
acidofile.
Temperatura optima de cultivare variaza
pentru marea majoritate a levurilor intre 25 0C si
300C, insa
cele patogene tolereaza si temperature de 37 0C.

IDENTIFICAREA LEVURILOR

1. Examenul microscopic direct al produselor

patologice
preparat extemporaneu intre lama si lamela cu
solutie 20% KOH (scuame, fragmente unghiale,
secretii linguale, vaginale);
preparat extemporaneu cu sol 20% KOH +
substanta fluorescenta sau frotiu colorat cu
aceeasi substanta fluorescenta (Calcofluor);
necesita microscopie in lumina ultraviolet

preparat extemporaneu cu tus de India (pune in

evidenta levurile capsulate din genul Cryptococcus, in
sedimentul LCR, urinar);
frotiu colorat Gram (pune cu usurinta in evidenta
filamentele, pseudohifele;
frotiu colorat May Grunwald-Giemsa (este
coloratia de rutina pentru depistarea levurilor
intracelulare de tip Histoplasma);

In cursul examenului microscopic se urmaresc:

prezenta,

forma,

dimensiunile formatiunilor caracteristice

levurilor:
blastospori,
pseudohife,
filamente (hife).

2. Cultivarea pe medii de izolare

In general, insamantarea prelevatelor se face pe

Agar Sabouraud aditivat cu cloramfenicol;
acest mediu
permite o buna dezvoltare a levurilor si
suprim multiplicarea
eventualelor bacterii
contaminante.

Levurile de interes medical se dezvolta in 24-72 h de

incubare.

pentru prelevatele provenind din situsuri in care

in mod normal temperatura este identica cu cea a
organismului se va alege temperatura de 370C
pentru incubare;
in cazul prelevatelor provenind de la nivelul
tegumentelor sau unghiilor, incubarea se va face
atat la 370C cat si la 300C deoarece, unele levuri
cultivabile la 300C dar necultivabile la 370C, pot
avea semnificatie clinica, fiind cauza unor micoze
superficiale.

Coloniile pot imbraca diverse aspecte in functie de genul si

specia in cauza.
In general,
au

forma rotunda,
sunt bombate si
nu prezinta pigment.

Suprafata poate fi
neteda,
uneori

neregulata,
cu margini fin franjurate si
au aspect umed sau uscat.

Consistenta este
pastoasa,
mucoida
cerata.

sau

3. TESTE DE IDENTIFICARE
Algoritmul de identificare a unei tulpini levurice se
bazeaza pe o combinatie de:
A-caractere microscopice
B-caractere de cultur
C - caractere biochimice
D - caractere genetice

A)OBTINEREA SI EXAMINAREA PREPARATELOR

EXTEMPORANEE CU TUS DE INDIA(CRYPTOCOCCUS)

pe o lama de sticla curata si degresata se

etaleaza o picatura de tus in care se
suspensioneaza apoi cu ajutorul unei anse
microbiologice un mic fragment din colonia
levurii de identificat;
se acopera cu o lamela si se examineaza la
microscop cu obiectiv X20 (X40);
observarea unor levuri rotunde sau ovoidale,
inconjurate de un halou necolorat, clar, pe fond
brun negru, indica prezenta capsulei.

B)TESTUL DE FILAMENTARE (TESTUL DE

BLASTEZA SAU GERM-TUBE TEST) CANDIDA

ca medii pentru blasteza se utilizeaza serul

sanguin de cal, serul sanguin uman;
Tehnica:
se prepara suspensia levurica in solutie salina
fiziologica, densitatea acesteia ajustandu-se la 0,5
Mc Farland (cca.105-106 celule /ml) ;
in fiole cu capacitatea de 2 ml se pun in contact
0,5 ml suspensie levurica si 0,5 ml ser sanguin de
cal;
fiolele se mentin apoi in baia de termostatare la
360C timp de 2h.

TESTUL DE FILAMENTARE

Dupa expirarea celor 2h, fiolele se agita si din fiecare

amestec se preleveaza un volum de 25L care se etaleaza
apoi intre lama si lamela.
preparatul extemporaneu astfel obtinut se examineaza la
microscop in vederea decelarii tubilor germinativi
caracteristici tulpinilor de Candida albicans si Candida
dubliniensis-filamente scurte care emerg din blastospori
fara strangulare;

TESTUL DE FILAMENTARE

ca martor al filamentarii, se utilizeaza de fiecare

data o tulpina tip de Candida albicans;
si alte levuri pot produce formatiuni similar de
tipul pseudofilamentelor, insa ele se diferentiaza
de adevaratii tubi germinativi prin existenta unei
strangulari la locul de emergenta din blastospor.

TESTE BIOCHIMICE
a)fermentarea zaharurilor
-utilizarea metabolica a zaharurilor este utila in
diferentierea diverselor specii apartinand genului
Candida

b)capacitatea de asimilare a surselor de carbon

-abilitatea levurilor de a creste pe diverse medii in
prezenta anumitor substante chimice adaugate ca
unica sursa de carbon, poarta numele de
auxanograma

TESTE BIOCHIMICE
c)capacitatea de asimilare a surselor de azot
-important pentru diferentierea levurilor
apartinand genurilor Criptococcus si Rhodotorula

d)producerea de ureaza
-pune in evidenta capacitatea levurilor de a
produce enzima numita ureaza; de ex., Cryptococcus
e)rezistenta la cicloheximida
-testul se refera la abilitatea levurilor de a se
dezvolta pe medii de cultura continand doua
concentratii de cicloheximida- 0,01 %, repectiv 0,1%

TESTE BIOCHIMICE
f)producerea de fenol-oxidaza
-permite identificarea speciei de Criptococcus neoformans pe baza
unei reactii de culoare ce determina o brunificare a mediului in
aproximativ 24h de incubare la 30 0C

g)producerea altor enzime

-este evidentiabila prin cultivarea levurilor pe medii cromogene

h)teste rapide de identificare a unor specii de levuri:

-latex-aglutinare (pt C dubliniensis-BICHRO-DUBLI,
Fumouze,api Candida)
-asimilarea trehalozei

. TEHNICI MOLECULARE

se bazeaza in principal pe:

- amplificarea si
- secventializarea unor regiuni unanim prezente
in genomul levurilor;
regiunile tinta sunt amplificate prin PCR cu
ajutorul a doua secvente nucleotidice cunoscute,
denumite amorse.

CANDIDA, CRYPTOCOCCUS

Descrierea principalelor genuri

de levuri
de interes medical

GENUL CANDIDA
Cuprinde peste 160 de specii, de ex.:
- C.albicans,
-C.parapsilosis,
- C.glabrata,
- C. kefir,
- C.krusei,
-C.tropicalis s.a.
C. albicans este comensal a cavitilor naturale (n
special gur, intestin, vagin). Alte specii se ntlnesc att
pe mucoase, ct i la nivelul pielii sntoase. Sunt levuri
oportuniste; produc infecii cnd apar deficinee ale
mecanismelor de aprare (nespecific i specific) ale
gazdei. Determin candidoze cu localizare superficial sau
profund.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
Produsul patologic recoltat: variaz n funcie
de localizarea leziunilor.
Recoltarea scuamelor din leziunile cutanate se
face cu pensa; din leziunile mucoasei, cu ajutorul
tamponului steril; prelevarea prin raclarea
unghiilor la limita dintre zona sntoas i cea
infectat.
Recoltarea sputei, l.c.r., urin se face n
recipiente sterile.
Transportul produsului patologic trebuie
efectuat rapid (max 1h), datorit multiplicrii
rapide a levurii.

EXAMEN DIRECT
microscopic, se practic:
-n stare proaspt, lam-lamel (materii fecale,
urin)
-dup clarificare cu solutie de KOH 20% sau cu
solutie cloral-lactofenol (scuame, unghii)
-dup colorare (frotiu, preparate histologice).
Se pot observa:
-Levuri circulare sau rotunde, cu diametrul de 2-6
m, nmugurite.
-Pseudofilamente (excepie C. torulopsis, care nu
filamenteaz).

CULTIVARE

Cultiv sub form de levuri pe mediul

Sabouraud (cu antibiotice), formnd colonii
albicioase, dup 24-48 ore.
Temperatura de cultivare este de 26C sau
37C dup localizarea superficial sau profund a
infeciei.

IDENTIFICARE
-se face pe baza caracterelor morfologice macrosi microscopice, biochimice si genetice.
Testul de filamentare este pozitiv pentru
Candida albicans si
Candida dubliniensis.
Antifungigrama permite stabilirea
sensibilitii la antifungice (Fluconazol,
Itraconazol, Amfotericina B, Nistatina,
Flucitozina, Ketoconazol, Miconazol, Econazol).

GENUL CRYPTOCOCCUS
Cuprinde levuri capsulate al caror habitat natural
este reprezentat de mediul ambiant.
A fost izolat din excrementele psrilor domestice
(n special porumbei) i slbatice, precum i din
solul ngrat cu acestea.
Contaminarea este predominant aerogena.
Specia cea mai importanta din punct de vedere a
implicarii in aparitia infectiilor criptococice este C.
neoformans,care afecteaza n special, persoanele
imunodeficiente (HIV pozitive sau cu hemopatii
maligne), la care produce cel mai frecvent meningite
celelalte specii sunt mai rar semnalate..

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
Produse patologice: l.c.r., urin, spltur
bronho-alveolar, puroi, biopsie.
Examen microscopic: levuri; se evidentiaza
capsula. Levuri sferice, nmugurite, cu
diametrul de 3-8m, nconjurat de o capsul
groas. Nu formeaz filamente sau
pseudofilamente.
Cultivare: Cultiv pe mediul Sabouraud,
incubat la 37C, n timp de 3-5 zile. Coloniile de
C. neoformans sunt foarte mucoase, de culoare
bej.

IDENTIFICAREA
Identificarea se face pe baza caracterelor
-morfologice macro- si microscopice,
- biochimice si
- genetice.
Cryptococcus spp. produc ureaz.

Antifungigrama

- permite stabilirea sensibilitii la antifungice.