MICROSCOPIE

Șef de lucrări dr. Anca-Narcisa Neagu

An universitar 2023, semestrul II

Microscop confocal cu scanare LASER (direct)

Leica DM 5500QTCS SPE- BF, DIC, POL, FLUO, FLUO-DIC, CS,
Cu cameră foto DFC 290
(155.000 euro)
 FACULTATEA DE
BIOLOGIE

Laboratorul de Histologie animală şi Microscopie confocală

Entitate a Grupurilor de cercetare: IDENTIFICAREA ȘI CARACTERIZAREA MOLECULELOR BIOLOGIC ACTIVE (pluridisciplinaritate: Biochimie, Fiziologie vegetală și
animală, Microbiologie)
http://www.bio.uaic.ro/cercetare/grupuri/bioactive/index.html
BIOARHEOLOGIE
(pluridisciplinaritate: Anatomia comparată a animalelor, Anatomia omului, Arheozoologie, Arheobotanică)
http://bioarchaeologyuaic.simplesite.com/

Adresa : Facultatea de Biologie, Universitatea “Alexandru Ioan Cuza” din Iasi, Bd Carol I, nr. 20A (Corp B, demisol I), Iaşi, 700506, Romania

Activităţi de cercetare ştiinţifică şi didactice în domeniile:

Histologie animală şi Imunohistochimie, Biologia dezvolării, Ecomorfologie animală, Bioindicatori ai calității mediului.
Circuitul xenobioticelor în natură, Microscopie
 Microscopia

• Este un domeniu tehnic care utilizează microscopul pentru vizualizarea probelor care nu pot fi observate și caracterizate cu ochiul liber
(obiecte care nu se găsesc în limita de rezoluție a ochiului uman, Bonaque-Gonzalez, S. et al., 2021. The optics of the human eye at 8.55
micrometers resolution).

• Microscopia optică este un termen general folosit pentru orice tip de microscop care utilizează lumina transmisă de către o sursă de lumină.

• MICROSCOPIA A REVOLUȚIONAT ȘTIINȚA.

• Galileo Galilei 30x-Robert Hooke 50x-Anton van Leeuwenhoek 275x.

• Se pare că primele microscoape au fost concepute pe la sfârșitul anilor 1300, deși există date că au fost folosite din secolul XI.
• În anul 1609, Galileo Galilei, unul dintre cei mai cunoscuți savanți ai Renașterii (n. 1564 la Pisa, anul în care s-a născut Shakespeare și Isaac
Newton și a murit Michelangelo) a pus la punct primul echipament cunoscut sub denumirea de microscop. A fost astronom, fizician, inginer,
filosof și matematician, pasionat de anatomie și optică. Inventator. A fot profesor de matematică la universitatea din Pisa, apoi la universitatea
din Padova.
 ROLUL MICROSCOPULUI

1. Produce o imagine mărită a specimenului prin utilizarea unei lentile sau a unor combinații
de lentile (magnificație)
2. Separă detaliile imaginii (rezoluție)
3. Face detaliile vizibile pentru ochiul uman sau pentru o cameră foto (contrast)
 REZOLUȚIA MICROSCOPULUI

Rezoluția constă în capacitatea unui microscop de a distinge detaliile specimenului.

Rezoluția este distanța minimă la care 2 puncte distincte ale specimenului pot fi vizibile pentru ochiul
observatorului sau pentru o cameră foto ca entități separate.
Rezoluția este strict legată de apertura numerică (NA) a sistemelor optice dar și de lungimea de undă a
luminii utilizate pentru observație.
NA = n x sin α,
unde n este indicele de refracție a mediului (1 pentru aer, 1,52 pentru uleiul de imersie) prin care trece
lumina și α este ½ din apertura unghiulară a unui obiectiv (valoare de 0,95 pentru un unghi de 144 grade).
NA pentru obiectivul uscat va fi de 0,95, iar pentru obiectivul umed de 1,45).
R (rezoluția teoretică)= 1.22 λ (lungimea de undă)/NAobiectiv+NAcondensor

De exemplu, dacă se utilizează iluminare cu lumină verde (514 nm), un obiectiv umed cu NA de 1,45 și un
condensator cu NA de 0,95, limita teoretică de rezoluție (maximă) va fi de 261 nm.
Utilizând o lungime de undă de 400 nm, în aceleași condiții de mai sus, R va fi egală cu 203 nm.
 REZOLUȚIA MICROSCOPULUI

1. Cea mai bună rezoluție în microscopia optică este de cca 200 nm (0,2 micrometri). Obiectivele cu
putere de mărire mai mare au o rezoluție mai bună.
2.
3. În microscopia electronică, rezoluția este de 0,1 nm (0,0001 micrometri).
 MICROSCOPIA ÎN CÂMP LUMINOS
(Brightfield BF)

Este un tip de microscopie optică în care proba este iluminată cu lumină albă, lumina este
transmisă prin probă, după care ajunge la detector.

Tipuri de microscopie care cresc contrastul în BF:

• microscopia cu contrast de fază (PCM)
• microscopia cu contrast diferențial de fază (DIC, differential interference contrast)
• microscopia cu lumină polarizată (POL)
• microscopia în câmp întunecat (DF)
 Comparație între Bright fileld (BF) și microscopia cu contrast de fază (PCM)

https://imb.uq.edu.au/research/facilities/microscopy/training-manuals/microscopy-online-resources/image-capture/brightfield-
techniques
 Comparație între Brightfileld (BF) a și Microscopia cu lumină polarizată POL)
fibre de nylon, probe cu proprietăți birefringente (se utilizează în special în știința
materialelor, dar are și aplicații biologice)
https://www.leica-microsystems.com/science-lab/galleries/polarizing-microscope-image-gallery/ nylon
https://www.leica-microsystems.com/science-lab/galleries/polarizing-microscope-image-gallery/ poliamidă
https://www.leica-microsystems.com/science-lab/galleries/polarizing-microscope-image-gallery/ lână
cristale de acid uric din sediment urinar (ansamblu original, POL)
cristale de acid uric din sediment urinar (detaliu original, POL)
https://www.sciencephoto.com/media/873155/view/vitamin-c-crystals-polarised-light-micrograph cristale de vitamina C
 Comparație între Brightfileld (BF) (a, c) și
microscopia cu câmp întunecat (b, d)

https://imb.uq.edu.au/research/facilities/microscopy/training-manuals/microscopy-online-
resources/image-capture/brightfield-techniques
https://blog.perceptilabs.com/use-case-highlighting-blood-cells-in-dark-field-microscopy-using-image-segmentation/
elemente figurate DF
https://www.robertharding.com/preview/869-3674/globular-alga-volvox-dark-field-microscopy/ colonie de alge genul Volvox
Darkfield
 • În anul 1668, olandezul Anton van Leeuwenhoek (1632-1723) a îmbunătățit
calitatea lentilelor din sticlă pentru a crește claritatea și mărimea imaginii
obținute.

• Bacteriile și spermatozoizii în mișcare au fost primete celule observate de

Leeuwenhoek la microscop, ceea ce i-a atras denumirea de părintele
microbiologiei. În 1880 a fost ales membru al Royal Society (Societății
Regale) din Londra.

• A creat cca 500 de microscoape pe cadru metalic (cupru, bronz, argint), dintre
care unele mai pot fi observate în diferite muzee.

• Muzeul din Utrecht (Olanda) are în colecție un microscop cu o putere de

mărire de 275 x creat de Leeuwenhoek.
 Galileo Galilei

Se pare că nu a inventat telescopul, dar a perfecționat unul realizat de un

olandez, transformând ”o jucărie populară de carnaval într-un instrument
științific”. Se pare că a fost mai mult interesat de observarea stelelor pe cer
decât de observarea unor insecte la microscop (occhiolino, 30x). Microscopul
lui Galilei a fost realizat pe principiul unui telescop.

https://
lensonleeuwenhoek.net
/content/galileos-
 Robert Hooke

A publicat lucrarea fundamentală Micrografia în 1667.

Se pare că el a vorbit pentru prima dată despre știința microscopiei.

A adus microscopia ca știință în atenția publicului.

Puterea de mărire 50X.

A folosit ca sursă de lumină o lampă cu ulei.

Microscoapele sale au fost manufacturate de către londonezul Christopher Cook.

 Frits (Frederik) Zernike (1888-1966)-fizician olandez

A construit/inventat primul microscop cu contrast de fază (1941) pentru care a primit Premiul Nobel
pentru Fizică în 1953. Producția de microscoape cu contrast de fază a început în anul 1942 în
Germania.
Phase-contrast microscopy (PCM). Producători: Leica, Zeiss, Nikon, Olympus etc.

Permite observatorului să analizeze celule vii, inclusiv microorganisme (nu este necesară colorarea
preparatelor și nici utilizarea fluorescenței).
A permis studierea diviziunii celulare.
Pot fi observate preparate transparente/translucide, secțiuni foarte fine prin organe, invizibile pentru
microscopia în câmp luminos).

https://en.wikipedia.org/wiki/Phase-contrast_microscopy#/media/
File:Brightfield_phase_contrast_cell_image.jpg
Microscopia cu contrast de fază este o tehnică
utilizată pentru a crește contrastul în probele
transparente (necolorate) reprezentate de celule
sau secțiuni subțiri.

Prin utilizarea unui inel la nivelul condensorului,

doar o anumită fază a luminii este lăsată să treacă
prin condensor și ajunge la specimen/preparat.

În spatele obiectivului de află o placă de fază/inel

de fază care blochează faza luminii lăsată să
treacă prin condensor și lasă să treacă doar lumina
care a fost refractată de celulele/țesuturile din
probă.

Lumina refractată de celule va fi direcționată către

camera foto sau dispozitivul de imagistică.

Inele de fază:
http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/artmar06/go-phase.html
 http://www.microscopy-uk.org.uk/mag/artmar06/go-phase.html
Brightfield BF-câmp luminos, COL iluminare circulară oblică, darkfield DF-câmp întunecat)
Microscopia cu contrast de fază convertește diferențele în indicele de refracție și densitate celulară în variații detectabile ale intensității
luminoase, în special pentru observarea celulelor vii.
Microscoapele sunt utilizate în special pentru observarea culturilor celulare și a celulelor vii, fără a fi necesară colorarea acestora.

În contrastul de fază pozitiv, obiectul analizat apare colorat în gri închis pe un fond luminos.

În contrastul de fază negativ, obiectul de analizat apare luminos pe un fond întunecat.

Solzi ctenoizi

https://www.researchgate.net/figure/Specimens-in-Positive-and-Negative-Phase-
Contrast-Figures-5a-5c-and-5e-illustrate-a_fig3_344362735
 Cultură de celule tumorale MCF 10A.

https://www.researchgate.net/figure/Comparison-of-positive-A-and-negative-B-phase-contrast-images-of-the-MCF-
10A_fig14_281434136
 Georges Nomarski

A inventat microscopul cu contrast diferențial de fază (Differential Interference Contrast

DIC)/Nomarski interference contrast (NIC)/Nomarski microscopy, asemănător cu microscopul cu
contrast de fază, dar mult mai utilizat în zilele noastre.

https://en.wikipedia.org/wiki/Phase-
contrast_microscopy#/media/
File:S_cerevisiae_under_DIC_microscopy.jpg
 Solz ctenoid DIC

https://www.researchgate.net/figure/Schematic-drawing-of-cycloid-scale-
left-and-ctenoid-scale-right-including-the-terms_fig2_335201897

olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/techniques/dic/dicgallery/
Fir de păr de șobolan secționat oblic DIC (foto original)
Purice de baltă (Daphnia)

olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/techniques/dic/dicgallery/
Testicul de pisică DIC Testicul de berbec BF (foto original)
https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-
resource/primer/techniques/dic/dicgallery/
Vorticella Vorticella
Lacul Bicaz foto original DIC https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-
resource/primer/techniques/dic/dicgallery/
 Grăuncior de polen de timoftică
(Phleum pratense) (DIC)

https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/techniques/dic/dicgallery/
 Grăuncior de polen de ambrozie
(Ambrosia) (DIC)

https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/techniques/dic/dicgallery/
 Grăuncior de polen de pin (DIC)

https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/techniques/dic/dicgallery/
Granule de polen de floarea soarelui din
miere de albine (DIC)
 Țesut muscular de râmă

https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/techniques/dic/dicgallery/
 Pană de lebădă

https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/techniques/dic/dicgallery/
Microscopia cu contrast de fază (PCM) și microscopia cu contrast diferențial de fază (DIC) sunt tehnici complementare capabile
să producă imagini cu un contrast ridicat.
Pot fi analizate specimene transparente care în mod normal nu afectează semnificativ amplitudinea radiației luminoase vizibile
care trece prin specimen. Diferențele de fază nu sunt detectabile de ochiul uman și nu pot fi observate în microscopia în câmp
luminos. Astfel, radiația luminoasă care trece prin microscop trebuie modificată pentru a produce imagini satisfacătoare ale
specimenelor.

Celulă din epiteliul bucal cu numeroase bacterii

pe suprafața sa (aDIC, bPOC).

Secțiune groasă prin rinichi de șoarece cDIC și

dPCM

https://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/dic/
dicphasecomparison.html
Celulă epitelială pavimentoasă din mucoasa obrazului Celulă epitelială în umbrelă din uroteliu observată în
https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope- sediment urinar (foto original DIC)
resource/primer/techniques/dic/dicgallery/
Hepatocite de șoarece DIC (foto original)
 Eritrocite umane
Celule HeLa în cultură monostrat,
acoperite cu lamelă
Alge filamentoase din genul Zygnema

https://www.olympus-lifescience.com/
en/microscope-resource/primer/
techniques/dic/dicgallery/

https://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/dic/dicphasecomparison.html
Eritrocite umane observate în
microscopie optică în câmp luminos.
Eritrocite umane observate în
microscopie electronică cu baleiaj
(scanning).
 Eritrocite umane observate în microscopie
în câmp întunecat.

Microscopia în câmp întumecat permite

realizarea contrastului fără colorare, prin
folosirea unui condensor special pentru
câmp întunecat. Condensorul previne
trecerea luminii prin lentile și crează un
câmp întunecat, cu excepția celulelor
prezente în preparatul respectiv.

https://moticeurope.blogspot.com/2015/07/red-human-blood-cells-in-darkfield.html
Eritrocite de șoarece
observate în microscopia
cu contrast diferențial de
fază (DIC) (foto original).
Eritrocite umane observate în microscopie
cu contrast diferențial de fază (DIC)
 Marvin Minsky

A aplicat primul patent pentru MICROSCOPUL CONFOCAL în 1957. A fost ini țial ignorat de
comunitatea științifică, dar astăzi microscopia confocală este larg utilizată, atât în cercetare
fundamentală, cât și în clinică.
Un moment important a fost izolarea dintr-o meduză bioluminescentă ( Aequorea victoria, meduza de cristal) a ”green fluoresccing protein” (GFP)/proteina cu fluorescență verde.
Osamu Shimomura și colegii (Martin Chalfie și Roger Tsien) au primit premiul Nobel pentru Chimie în 2008 pentru lucrările lor asupra GFP, proteină descoperită în anii 1961.

GFP a fost ulterior folosită ca marker pentru alte proteine.

FRAP (Fluorescence Recovery after Photobleaching)
TIRF (Total Internal Reflection Microscopy)
 Imunofluorescență/detecție fluorescentă
Detecție directă (primară) și indirectă (secundară)
1. Anticorpul primar, cu specificitate pentru un anumit antigen, este conjugat cu una sau mai multe molecule de fluorocrom. Fluorocromul este excitat cu o radiație
LASER incidentă și emite fluorescență detectabilă cu un microscop cu fluorescență sau cu un microscop confocal cu scanare laser.
2. Anticorpul primar, cu specificitate pentru un anumit antigen, se conjugă cu un anticorp secundar conjugat cu un fluorocrom. Fluorocromul este excitat cu o radiație
LASER incidentă și emite fluorescență detectabilă cu un microscop cu fluorescență (FLUO) sau cu un microscop confocal cu scanare laser (CLSM).
 Type of fluorophore

Fluorescent dye (low molecular weight fluorescent dye) FITC (fluorescein isothiocyanate), Alexa Fluor® dye Cy dyes,
etc.

Fluorescent protein PE (phycoerythrin), APC (allophycocyanin) etc.

LASER
Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation

Caracteristici ale luminii LASER

1. monocromaticitate-cuprinde un spectru foarte îngust de lungimi de undă
2. Directivitate-proprietetea de a se propaga pe distanțe mari cu o divergență redusă și capacitatea de a fi focalizate pe o arie foarte mică
3. Intensitate-unele dispozitive emit un fascicul suficient de intens pentru a fi folosite la tăierea metalelor
Autofluorescență
 Celule HeLa evidențiate cu anticorp primar de iepure anti-beta III
tubulină conjugat cu FITC (fluorescein isothiocyanate)
obținut prin recombinare genetică (animal-free)
Excitație 495 nm
Emisie 517 nm

FITC (fluoresceină) cel mai utilizat fluorocrom în IHC, printre primii

utilizați, precursor pentru AlexaFluor 488

Este utilizat adesea în combinație cu TRITC (rhodamină)

(tetramethylrhodamine-5 (and 6)-isothyocyanate) (550/575nm)

https://www.leica-microsystems.com/science-lab/fluoresc
ent-dyes/

Dezvoltarea embrionului de Drosophila (FITC verde, TRITC

roșu)

https://www.abcam.com/fitc-beta-iii-tubulin-antibody-ep1569y-ab224978.html

https://www.bio-rad-antibodies.com/flow-cytometry-fluorescence.html
Tetrahymena pyriformis colorată cu
anticorp primar de șoarece anti-beta tubulină conjugat cu AlexaFluor
488 azidă

https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A10266
https://www.researchgate.net/figure/a-Characteristics-5-6-and-b-excitation-and-emission-spectra-of-the-fluorochromes_fig1_327933068
Fibroblaste de șarece

Nuclei colorați cu DAPI

Verde: F-actină, FITC
Roșu: tubulină, Cy5

https://www.leica-microsystems.com/science-lab/fluorescent-dyes/
Courtesy of: Dr. Günter Giese, Max Planck Institute for Medical Research, Heidelberg, Germany.

DAPI

https://www.crbdiscovery.com/technical/fluorescence/cy-dyes/
DNA staining (colorarea nucleilor)

DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole): excitație 358nm (UV), emisie 461nm; trece prin membrana celulară, colorează nucleii celulelor vii și
moarte/fixate.

Hoechst 33258, 33342, 34580, excitație UV, emisie 455nm: Penetrază membrana celulară, este folosit pentru celule vii sau fixate. Mai puțin
citotoxic decât DAPI.

Iodura de propidiu (propidium iodide) PI: nu trece prin membrana celulară, este folosit în teste de viabilitate celulară deoarece pătrunde doar în
celule moarte, la care integritatea membranară este deteriorată. Nu penetrază celulele intacte. 538nm/617nm.

Acridin orange/portocaliu de acridină: 502/525 (ADN state), 460/650 RNA binding. Diferențiază ADN de ARN.
 Marcare multiplă (imunofluorescență indirectă): antigenul Ki67 (proteină nucleară verde, biomarker pentru
proliferarea celulară/activitatea proliferativă a celulelor tumorale) și alfa-tubulina din microtubuli în roșu. Nucleii
sunt colorați cu un fluorocrom cu afinitate pentru ADN/DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) (albastru).
Fluorocromi specifici pentru studiul organitelor celulare
Mitocondrii: MitoTracker®.
rhodamine 123 t
tetramethylrosamine

Lizozomi: LysoTracker  Aparat Golgi: NBD C6-ceramide 

FM 4-64®  BODIPY FL C5-ceramide.
FM 5-95®
Lipide din plasmalemă (colesterol):  NBD-6 Cholestrol 
ER (reticul endoplasmatic): DiOC6(3)  NBP-12 Cholesterol 
ER-Trackers like ER-Tracker Green și Red.

Celule endoteliale pulmonare bovine, marcare

triplă
https://www.leica-microsystems.com/science-
lab/fluorescent-dyes/

Roșu: mitocondrii marcate cu MitoTracker Red

CMXRos
Verde: F-actină marcată cu un anticorp cu
fluorescență verde BODIPY FL phallacidine
Blue: DAPI