Biologie celulară și moleculară

Lucrarea practică nr. 3

Tehnica obţinerii preparatelor microscopice

permanente: metoda etalării în monostrat (tehnica
frotiului sangvin şi amprenta de organe).

Asist. univ. drd. Bota Viviane

• În organism, celulele se află fie agregate în diferite țesuturi, fie
în suspensie, în diferite lichide biologice.
• În funcție de aceasta, prepararea lor pentru observarea la
microscopul optic se face diferit, dar având un principiu comun.
• Suspensiile celulare de origine biologică (sânge, lichid
cefalorahidian, urină, lichid pleural etc.) și cele obținute în
laborator (prin dispersia unui țesut sau culturi de celule) nu
necesită folosirea procedurilor complicate care implică
secționarea.
• Celulele, dacă sunt dispuse într-un strat subțire, sunt
transparente.
Frotiul
• Întinderea unui strat subțire de celule pe suprafața unei
lame microscopice formează un frotiu.
• Etape de preparare:
 Pregătirea lamei
 Etalare
 Uscare
 Fixare
 Colorare
 Spălare
 Uscare
• Apoi urmează observarea la microscop.
Pregătirea lamei
 pregătirea lamei se face controlând ca lama sa fie perfect
curată, apoi se face degresarea acesteia prin păstrare în
alcool sau treceri consecutive prin flacăra becului de gaz de
cca. 20 de ori, în aşa fel încât ambele feţe să fie flambate la
fiecare trecere pe toată suprafaţa lor.

https://i.ytimg.com/vi/3ZmlEZT0MMI/hqdefault.jpg http://3.bp.blogspot.com/-d4ZbM2AwKt0/Tm-40l92BJ
I/AAAAAAAAAB8/McX0D3kEFGU/s320/025.JPG
 1
Etalarea
Pentru tehnica frotiului de sânge:
 Se recoltează câțiva ml de sânge prin 2
puncție venoasă pe un anticoagulant (citrat
sodic, EDTA, heparină) sau puncția pulpei
degetului cu un ac steril sau hemostilet.
 O picătură de sânge (30μl) recoltat se 3
dispune la extremitatea unei lame (1cm de
etichetă, 2 cm lame fără etichetă).
 Cu o altă lamă, ținută oblic (30-45°), se
atinge picătura de sânge în așa fel încât
aceasta să se întindă de-a lungul întregii 4
muchii.
 Apoi se deplasează lama rapid până la
extremitatea opusă a primei lame (suport).
 Astfel se realizează un strat subțire de sânge
5
– frotiul sanguin.
 Dacă recoltarea s-a realizat prin puncție
capilară, picătura de sânge care apare pe
pulpa degetului se preia cu marginea mică
(sau mare) a unei lame șlefuite. Se preferă
însă absorbția picăturii cu tuburi capilare de
plastic.
 Dacă sângele provine din tuburi cu recoltat
venos pe anticoagulant, preluarea se face cu
pipete de unică folosință de plastic, cu
tuburi capilare de preferat de plastic și nu https://images-na.ssl-images-amazon.com/image
s/I/31adMHFjetL._SX342_.jpg
de sticlă (risc de spargere). Tuburile nu
trebuie heparinate.
 Există și un dispozitiv (DIFF-SAFE) de
realizare a picăturii de sânge preluate din
tubul de recoltare, Acesta elimină formarea
de micropicături de sânge în timpul
efectuării frotiului iar tubul de recoltare nu
trebuie deschis. Elimină utilizarea de pipete
și reglează volumul picăturii aplicate.
https://www.marketlab.com/images/xxl/Diff-Safe_
b.jpg
Etalarea
 Pentru frotiurile din organe, etalarea se poate face prin:
 Ștergere
 Amprentă
 Strivire între două lame
 Cu pipeta pasteur sau ansa de însămânțare

 Etalarea prin ștergere:

 constă în trecerea unei lame de microscop, pe suprafaţa
unei secţiuni, din organul din care se execută frotiul.
Etalarea
Etalarea prin amprentă:
 constă în aplicarea unei lame (fără ştergere) pe suprafaţa
de secţiune a unui fragment de organ de examinat, în acest
fel ramânând o impresiune corespunzatoare formei
suprafeței atinse (metoda amprentă).
 este bine ca pe aceeasi lamă să se practice mai multe
amprente, pentru a se putea examina frotiurile mai
subțiri(ultimile amprente sunt întotdeauna mai fine).
Etalarea
 Etalarea prin strivire între două lame:
 se execută atunci când leziunile din ţesut sunt de tip nodular
(TBC – bacilul tuberculozei), se secţionează un fragment din
nodul.

 Etalarea cu pipeta pasteur sau ansa de însămânțare:

 Se execută în cazul culturilor bacteriene din medii lichide.
 după omogenizarea culturii se recoltează în mod steril o
picătură care se depune pe o lamă de sticlă şi se întinde prin
mişcări concentrice, astfel încât frotiul să fie subţire şi uniform,
şi să aibă o intindere mai redusă decât marginile lamei de
microscop.
 Etalarea
 Etalarea cu pipeta pasteur sau ansa de 1
însămânțare:
 În cazul culturilor bacteriene de pe medii solide.
 pe lama de sticlă se depune o picătură de apă
distilată, apoi cu ansa se recoltează o mică 2
cantitate de cultură, care se suspendă într-o
picătură de apă şi se întinde prin mişcări
concentrice pe o suprafaţă cât mai mare.
3
Indiferent de metoda de etalare, niciodată nu
se va atinge cu materialul infecţios marginea
lamei!
4
*Amprenta de organe
Se taie un fragment tisular de 10/10/3 mm;
Se ţine cu pensa în aşa fel încât suprafaţa proaspăt tăiată să fie în sus, dupa care
dintr-o singură mișcare se atinge suprafața lamei;
Nu se comprimă ţesutul, dacă suprafaţa atinsă este excesiv de udă şi sângerândă,
se îndepărtează excesul de lichid cu hârtie de filtru, se prepară mai multe lame.
Lamele se usucă rapid în aer fără a se încălzii, uscarea fiecărei lame durează
aproximativ 30 – 60 secunde; dacă durata este mai mare înseamnă că amprentele
sunt prea umede iar rezultatele nu vor fi satisfăcătoare;
În scop de standardizare se fixează, după uscare, cu alcool absolut şi se
colorează cu: hematoxilină-eozină, Papanicolaou, Giemsa sau Wright;
După pregătirea amprentelor, se fixează şi se trimite la histologie blocul de ţesut
folosit pentru a corela datele obținute.
Fixarea
Frotiurile sanguine necesită doar uscare la aer. În cazul colorației
prin tehnica May-Grünwald-Giemsa, alcoolul metilic din
compoziția soluției are și rol fixator.
Restul preparatelor citologice necesită fixare rapidă.

 cel mai utilizat fixator: alcool absolut (95% -100%), durata optimă a

fixării: 15 minute, există şi fixatori tip spray.

 în cazul frotiurilor uscate se poate realiza rehidratarea acestora în soluţie

apoasă de glicerină – 3 minute, 2 băi de alcool etilic 95% etapele

coloraţiei Papanicolaou

http://www.rasfoiesc.com/educatie/biologie/Efectuarea-pre
paratelor-micros56.php
 Colorarea
Colorarea frotiului sanguin se face prin tehnica
May-Grünwald-Giemsa.
 Prima etapă constă în acoperirea lamelor cu frotiul
uscat, dispuse pe suportul unei băi de colorare, cu
un strat de soluție May-Grünwald (2-3 ml). Se lasă
timp de 5 min., timp în care alcoolul metilic
acționează ca fixator.
 Apoi, deasupra stratului de soluție, se toarnă
aceeași cantitate de apă distilată și se amestecă ușor
cu vârful unei pipete pasteur. Se lasă alte 5 min.,
timp în care soluția acționează ca și colorant.
 După cele 5 min, se aruncă soluția de pe frotiu fără
a le spăla, și se acoperă cu soluție Giemsa 10%,
preparată în momentul folosirii. Soluția giemsa
colorează nucleii, iar timpul de colorare variază
între 10-30 min, în funcție de calitatea colorantului.
Spălarea și uscarea
 După colorare, frotiurile se spală cu apă de robinet și se
acoperă timp de 1 minut cu apă distilată, pentru
diferențierea colorației.
 Se usucă la temperatura camerei sau la curent de aer cald.

http://www.rasfoiesc.com/educatie/biologie/Efectuar
ea-preparatelor-micros56.php
Observarea la microscop
 Se începe cu observarea unei imagini de ansamblu (obiectiv de 10x) și
cu obiectivul de 20x.
 Pentru detalii se poate folosii obiectivul de imersie.
 Observarea cu obiectivul de imersie se face doar după acoperirea lamei
cu ulei de imersie (ulei de cedru), ce nu afectează celulele de pe frotiu.
 Se recomandă observarea pe marginea frotiului, unde celulele sunt
dispuse într-un singur strat, iar leucocitele au morfologia neafectată.

Zona de analiză
Aspecte legate de calitatea
frotiului
 Calitatea unui frotiu este corespunzătoare dacă celulele sunt dispuse
într-un singur strat continuu și depinde de mai mulți factori:
 Mărimea picăturii de sânge
 Unghiul sub care se ține lama cu care se trage frotiul
 Viteza de întindere a frotiului.

Exemple de frotiuri necorespunzătoare

Aspecte legate de calitatea
frotiului
 Un frotiu bun îndeplinește următoarele condiții:
 Este foarte subțire, cu celulele întinse într-un singur strat
 Are ambele margini pe lamă
 Porțiunea terminală este rotunjită, prezentând franjuri
 Este întins uniform, fără îngroșări sau întreruperi
 Eritrocitele, neavând nucleu apar cu conținutul omogen, colorate
cenușiu, cu nuanțe roșii-albăstrui. Leucocitele, mai rare, apar bine
evidențiate, cu nucleu colorat în roșu.
Prepararea soluției May-Grünwald
 Soluția reprezintă o combinație de fixator și colorant
format din soluție saturată de albastru de metil-eozinat în
metanol.
 Colorantul se prepară conform rețetei lui Jenner astfel:
1. Se amestecă părți egale de soluție apoasă de 1,25% eozină
și 15 albastru de metil
2. Se filtrează după 24 hr.
3. Se spală filtrul cu apă distilată
4. Pulberea rămasă pe filtru se usucă și se dizolvă în 200 ml
alcool metilic absolut, - soluție Giemsa
Prepararea soluției Giemsa
 Soluția stoc se poate obține ca atare de la diferite firme
specializate sau se poate prepara astfel:
1. Colorant Giemsa (Azur-eozină-albastru de metilen) –
1,52 g
2. Glicerină anhidră, 100 ml, se dizolvă prin mojarare
3. Alcool metilic absolut 100 ml
4. Se lasă în repaus 24 ore
5. Se filtrează
6. Se folosește în concentrație de 5-10% (preparată în
momentul folosirii) în apă distilată neutră sau tampon
fosfat neutru (pH 7,2)