Explorarea hemostazei

Hemostaza fiziologic este generat de o serie complex de mecanisme care implic factori
biochimici, celulari i umorali reprezentai de celulele endoteliale vasculare, de matricea
subendotelial, de trombocite precum i de factorii coagulrii i fibrinolizei.
Explorarea hemostazei cuprinde o serie de teste care sunt destinate explorrii hemostazei primare
ce implic n principal factori vasculari i trombocitari, hemostazei secundare respectiv factorilor
plasmatici ai coagulrii precum i mecanismelor fibrinolizei.
Explorarea hemostazei primare se poate realiza prin efectuarea urmtoarelor teste:
a)Msurarea timpului de sngerare
b)Determinarea fragilitii capilare
c)Studiul trombocitelor constnd n:
- numrarea trombocitelor
- studiul morfologiei i distribuiei trombocitelor pe frotiul sanguin
- studiul funciilor trombocitate: adezivitate, agtregabilitate, produceri de factori trombocitari
Timpul de sngerare (TS)
Principiu: TS reprezint timpul scurs de la practicarea unei injurii capilare pn la formarea, n
locul respectiv, a trombusului plachetar care oprete scurgerea sngelui marcnd momentul final
al instalrii hemostazei primare.
TS ofer indicii preioase asupra a dou din mecanismele hemostazei, vascular i
plachetar, prin colaborarea crora se formeaz trombusul plachetar. Rezultatele sale depind de
calitatea peretelui vascular, de numrul i funcia plcuelor sanguine, de factorul von Willebrand
i de fibrinogen.
Metodele cele mai larg utilizate pentru realizarea acestui test sunt: Duke, Ivy, Ivy- Borchgrevink.
Metoda Duke permite msurarea duratei sngerrii provocat prin incizia unei zone mediane a
lobului urechii.
Materiale necesare:
- port-ac tip Francke n trus, cu lanete interanjabile, sterilizabile,
- vat, eter,
- hrtie de filtru,
- cronometru.
Tehnic. Dup dezinfecia pielii cu eter i nu cu alcool, se sprijin lobul urechii pe un dop de
penicilina i se incizeaz ferm pielea cu laneta (lime de 1,5 mm, reglat la o adncime de 3
mm), declannd concomitent cronometrul. Din 30 n 30 de secunde se culeg picturile de snge
pe o hrtie de filtru, prin absorbie i prin apsare pe incizie. Cnd hrtia de filtru nu se mai
coloreaz se oprete cronometrul, notndu-se timpul parcurs. Se practic testul i la cealalt
ureche i se face media rezultatelor obinute.
Valorile normale sunt cuprinse ntre 2 4 minute. Valori peste 5 minute sunt patologice indicnd
o tulburare determinat fie de trombocitopenii fie de trombocitopatii, boala von Willebrand sau
diateze vasculare pure dar i dup ingestia de aspirin.
TS nu se practic pacienilor care se afl sub tratament cu aspirin, derivai salicilai, sau
prezimt trombopenii severe.
Metoda Ivy const n practicarea unei uoare staze venoase la nivelul antebraului care determin
mrirea presiunii sanguine n capilare n vederea eliminrii aa numitului tonus capilar, dup
care, se realizeaz dou incizii i se apreciaz durata i abundena hemoragiei provocate.
Materiale necesare:
- lame Gillette, chirurgicale nr. 3.
-tensiometru
-hrtie de filtru
-cronometru
Tehnic. Se aplic pe bra maneta aparatului de tensiune fixat la o presiune de 40 mmHg. Pe
faa anterioar a antebratului aseptizat i uscat se practic dou incizii paralele, pe o lungime
de 10mm, cu o adncime de 2 mm i la o distan de 2 cm una fa de alta. De la aplicarea
presiunii pn la efectuarea inciziilor nu trebuie s treac mai mult de 60 de secunde. Se pot
utiliza 2 lame sterile montate pe un suport special sau scarificatoare pentru practicarea automat
a timpului Ivy care uureaz mult efectuarea inciziilor. Din 30 n 30 de secunde se culeg
picturile de snge care se scurg prin polul inferior al fiecrei incizii, pe o hrtie de filtru.
Cronometrul declanat n momentul practicrii inciziilor se oprete n momentul ncetrii
sngerrii de la fiecare incizie. Rezultatul este dat de media timpilor obinui i poart denumirea
de TS primar.
Valorile normale sunt cuprinse ntre 3 9 minute. Interpretarea abaterilor de la normal sunt
acelai ca la metoda Duke. Metoda Ivy este mai sensibil dar mai puin acceptat de pacieni
Metoda Ivy Borchgrevink. Se efectueaz dup 24 de ore de la aplicarea metodei Ivy i const
din ndeprtarea crustelor formate la nivelul inciziilor cu ajutorul unui vaccinostil urmat de
pornirea cronometrului la reapariia sngerrii msurndu-se timpul pn la oprirea acesteia.
Valoarea msurat se numete TS secundar i are valori normale ntre 2 6 minute.
Testul fragilitii capilare.
Metoda prin compresiune (semnul garoului).
Principiu: Se msoar rezistena respectiv fragilitatea capilarelor la nivelul plicii cotului,
apreciind numrul de peteii formate dup o compresiune standard produs de brasarda unui
tensiometru sau o depresiune standard realizat prin aplicarea unei ventuze. Testul apreciaz
funcionalitatea i implicit integritatea peretelui capilar.
Metoda prin depresiune. Se aplic ventuza aparatului Lavollay la nivelul plicii cotului provocnd
o presiune negativ de 30 mmHg la copii i 40 mmHg la aduli pentru o durat de 2 minute. Se
numr apoi peteiile formate n aria delimiat de circumferina ventuzei (diametrul = 20 mm) Se
efectueaz dou determinri, una deasupra i una dedesuptul plicei, lundu-se n considerare cea
mai net.
Metoda prin compresiune. Pe braul pacientului, la o distan de 3 cm de plica cotului, se aplic
mneta unui tensiometru realizndu-se o compresiune egalcu media dintre valoarea tensiunii
arteriale maxime i minime pe o durat de 5 minute. Se decomprim, se scoate maneta i dup
un minut se numr peteiile cuprinse pe o arie de 20 mm
2
.
Rezultate:
Valori normale: negativ = ntre 0 10 peteii.
Valori patologice: slab pozitiv (+) ntre 10 i 20 peteii
pozitiv (++) ntre 20 i 40 peteii
pozitiv (+++) ntre 40 i 60 peteii, unele putnd deveni confluente
intens pozitiv (++++) > 60 peteii, n majoritate confluente
Rezistena capilar sufer variaii fiziologice fiind mai sczut la copii i femei fa de cea la
brbatul adult. Nou nscuii au rezistena capilar mai crescut ea msurndu-se n acest caz n
fosa subclavicular sau pe omoplat. Rezistena capilar este mai crescut seara iar la femei
prezint i variaii lunare fiind mai redus n timpul menstrelor i n sarcin.
Rezultate pozitive se ntlnesc n trombocitopenii, n majoritatea trombocitopatiilor, n unele
trombocitoze, n hepatite, n hipertensiune arterial, n unele intoxicaii medicamentoase, n
diabet, n avitaminoza C, n purpurele vasculare imuno-alergice, n benzenism etc.
Studiul trombocitelor
Trombocitele pot fi analizate pe criterii cantitative, calitative (funcionale) i morfologice,
referitoare la dimensiunea i structura acestora.
Numrarea trombocitelor.
Numrarea trombocitelor se realizeaz prin microscopie direct, ntr-o prob de snge integral
sau plasm bogat n plachete diluat cu o soluie care produce eritroliz impiedicnd n acelai
timp agregarea sau dezintegrarea trombocitelor
Principiu:
Sngele amestecat cu lichid de diluie n pipete speciale, este introdus n hemocitometru ntr-un
volum bine determinat, unde elementele sunt distribuite uniform i numrate pe o reea anumit.
Materiale necesare:
-Materiale necesare pentru recoltarea sngelui capilar sau venos.
-Pipeta Potain pentru eritrocite
-Lichidul de diluie trebuie s menin integritatea elementelor care urmeaz a fi
numrate i s lizeze celelalte tipuri de celule;. Lichidul de diluie folosit pentru numrarea
trombocitelor este soluia Feissley sau soluia de oxalat de amoniu constituit din:
Oxalat de amoniu..............1g
Na
2
EDTA................0,01g
Ap distilat.....................100ml.
.
-Camera de numrat sau hemocitometrul
- Microscopul optic se folosete utiliznd obiectiv uscat, 20x sau 40x , ocular 10 sau 7i
iluminare slab.
Tehnic. Se folosete snge capilar prelevat din vrful degetului printr-o neptur franc
sau snge venos. Diluia se face n pipete Potain pentru eritrocite, aspirnd snge pn la
diviziunea 1 i apoi diluent pn la diviziunea 101 (diluie de 1/100). Se agit pipeta 2 minute, se
las n repaus 30 de minute (pentru a obine o liz perfect a eritrocitelor) se agit din nou 2
minute, se las s cad 3-4 picturi i se ncarc hemocitometrul. Acesta se las n repaus 5
minute pe platina microscopului ( In atmosfer umed, sub o plac Petri, cptuit cu hrtie de
filtru umed. Numrtoarea se face pe camera Brker-Trk (ptratul pentru eritrocite).
Efectuarea numrrii se face micnd constant viza micrometric astfel nct plachetele apar ca
nite mici corpusculi refringeni, izolai. Se numr plachetele de pe 200 de ptrele (1 ptrat
mic = 1/400 mm
2
). Cifra obinut se nmulete cu 2 (pentru aducerea la 1 mm
2
), cu 10 (pentru
nlimea camerei) i cu 100 (pentru a corecta diluia).
n cazurile de trombocitemii se aspir snge n pipeta Potain pentru hematii numai pn la
diviziunea 0,5, diluentul pn la 101 (diluie 1/200) inndu-se cont la calculul final al numrului
de trombocite (nr. plachete de pe 200 ptrele x 2 x 10 x 200).
n cazurile de trombopenii diluia se va face n pipeta Potain pentru leucocite aspirndu-se snge
pn la diviziunea 0,5 i diluent pn la diviziunea 11; se numr 5 grupe de cte 16 ptrele i
se nmulete rezultatul cu 1000 (nr. plachete de pe 80 ptrele x 5 (pentru aducerea la 1mm
2
) x
10 (nlimea camerei) x 20 (diluia).
Valori normale: 150 000 400000 /mm
3
.
Rezultatele obinute se coroboreaz ntotdeuna cu cele obinute prin examinarea frotiului
sanguin care permite o apreciereaproximativ a numrului acestora pe lng studiul morfologiei
i modalitii de dispunere a trombocitelor pe frotiu.
Numrarea trombocitelor reprezint o metod delicat, cu multiple posibile cauze de
eroare, materialul utilizat trebuind s fie perfect splat, degresat i uscat, puncionarea venei sau
a pulpei degetului trebuind efectuat franc, pentru a evita orice iniiere a procesului coagulii.
Deasemenea, umplerea pipetei trebuie realizat n coloan continu, exact pn la diviziunea
corect, iar lichidul de diluie trebuie s fie perfect limpede. Chiar i numrarea propriu-zis se
poate constitui n cauze de eroare dac nu se face disticia ntre trombocite i praful cu strlucire
intens, strome eritrocitare sau de limfocite mici, bacterii i levuri.
Numrtoarea electronica se realizeaz n analizoarele automate de hematologie mpreun cu
numrarea leucocitelor i a hematiilor, de cele mai multe ori pe probe de snge recoltate pe
EDTA ca anticoagulant. Cele mai multe analizoare numr impreun trombocitele i hematiile
difereniindu-le apoi dup mrimea lor, cele mai mici fiind considerate trombocite. Aceast
tehnioc este supus erorii dac numrul leucocitelor este mai mare de 100 000/l, n cazul unei
fragmentri eritrocitare severe, dac lichidul de diluie conine particule externe, dac
trombocitele agreg sau dac procesarea probei este prea ndelungat.
Variaii fiziologice:
- valori sczute n prima zi de via a noului nscut
- valori sczute premenstrual
- valori crescute dup efort fizic intens sau dup expunerea la altitudine.

Variaii patologice:
Valori sczute (trombocitopenii) prin:
defecte de producere: - trombocitoz diminuat (iradiere medular, toice medulare,
infecii, invadare medular).
- trombocitoz ineficient (deficit de vitamin B12, acid folic,
mielodisplazii).
anomalii de repartiie hipersplenism
distrucie exagerat: - consum excesiv (proteze vasculare i valvulare, purpur trombotic
trombocitopenic, CID)
- distrucii prin mecanism imun alloanticorpi (sarcin, transfuzii),
autoanticorpi, reacii imunoalergice.
- Idiopatic (PTI)
Numrul trombocitelor poate fi sczut i n timpul chimioterapiei sau al tratamentelor cu:
penicilin, cloramfenicol, strptomicin, carbamazepin, metildopa, fenilbutazon, indometacin,
salicilai, diuratice tiazidice, sulfonamide, heparin, antidepresive triciclice
Valori crescute n:
trombocitoze reactive: - postsplenectomie.
- dup intervenii chirurgicale
- boli infectioase
- dup hemoragii acute
- anemie feripriv
- cancere
- dup tratament cu vitamina B12 sau acid folic n anemia Biermer.
trombocitemii: - sindrom mieloproliferativ cronic (trombocitemia esenial, policitemia vera,
leucemia granulocitar cronic, metaplazia mieloid cu mielofibroz)



Explorarea funciilor trombocitare
Funciile ndeplinite de trombocite pot fi clasificate n funcii dinamice i funcii tromboplastice.
Funciile dinamice ale trombocitelor se evideniaz prin testarea adezivitii agregabilitii
plachetare i prin studierea retraciei cheagului.

Adezivitatea plachetar

Principiu: msurarea descreterii numrului de plachete dintr-un eantion de snge care vine n
contact cu o suprafa strin (in vivo- stratul subendotalial, in vitro- sticl sau metal) la
temperatura de 37 C, pentru un timp standardizat.
Adezivitatea plachetelor joac un rol fundamental n formarea trombusului plachetar, fiind unul
dintre stadiile precoce ale hemostazei.

Metoda Borchgrevink msoar adezivitatea in vivo, folosind tehnica Ivy pentru timpul de
sngerare.
Tehnic: se face o numrtoare de trombocite din snge venos sau capilar prelevat din pulpa
degetului (proba 0). A doua numrtoare de trombocite se efectueaz din sngele prelevat cu o
pipet Potain, de la nivelul inciziei cutanate, n primul, n al 3-lea i al 5-lea minut dup incizie
(probele 1, 2, 3). Numrul de plachete sanguine reinute la nivelul leziunii vasculare este dat de
diferena dintre numrul de plachete al probei 0 i media determinrilor efectuate pe probele 1, 2
i 3. Rezultatul se exprim sub form de procentaj, baza de calcul fiind numrul de plachete al
probei 0.
Valorile normale sunt cuprinse ntre 30% i 60%
Adezivitatea in vitro
Poate fi studiat prin mai multe metode: Breddin, Bobek-Cepelak, Hellem, Salzmann, Wright.
Metoda Breddin modificat are ca principiu realizarea unui contact amplu ntre plachete i
suprafaa de sticl prin rotirea sngelui citratat ntr-un flacon de sticl la 3 C, un timp standard.
Se numr plachetele nainte i dup rotire, stabilindu-se procentul de plachete adezive.
Materiale necesare:
- balon de sticl cotat de 25 ml, nesiliconat, (nehidrofugat),
- dispozitiv pentru rotire lent, constant (15 rotaii/min.),
- baie termostatic reglat pentru 37 C.
Tehnic. Se recolteaz 3 ml de snge cu seringa siliconat i ac arquadizat: proba de snge se
toarn peste citratul trisosic din eprubeta gradat siliconat (o parte citrat i 9 pri snge). Se
omogenizeaz prin basculare lent. Se pune o pictr de snge pe o lam parafinat din care se
recolteaz proba I pentru numrarea plachetelor.
Din proba de snge bine omogenizat, se iau 2 ml care se pun n balonul cotat de 25 ml,
nesiliconat. Aceste se aeaz oblic n baia termostatic la 3 C, ancorat de dispozitivul de rotire,
prin intermediul unui dop de cauciuc, fixat de axul rotitor i introdus n orificiul gtului
balonului. Rotirea ( 15 ture / min) se face timp de 20 minute. Se oprete aparatul i din balonul
aflat n poziie nclinat prelevm o pictur de snge pe lama parafinat din care executm o
nou nimrtoare de plachete. Diferena dintre rezultatele celor dou numrori arat numrul de
plachete care au aderat.
Rezultatul se exprim n procente i se calculeaz raprtnd la numrul de plachete din proba I
diferena dintre numrul de plachete din proba I i numrul de plachete din proba II totul
nmulindu-se cu 100.
Valorile normale sunt cuprinse ntre25% i 50%.
Variaii patologice sunt reprezentate de:
Creteri ale adezivitii din strile de trombofilie cum se ntmpl n ateroscleroz, obezitate,
diabet zaharat al adultului.
Scderea adezivitii din uremii, trombastenii, boala von Willebrand, boala Bernard- Soulier.

Agregabilitatea plachetar

Exist diferite modaliti de studiu al agregrii plachetelor care permit s explice dac
alungirea TS este datorat unui defect de reactivitate al membranei plachetare la agentul agregant
extrinsec sau se datoreaz unei anomalii a eliberrii de ADP intraplachetar, diminurii
coninutului plachetar n ADP sau unei eliberri deficitare a acestuia prin membrana plachetar
n mediul exterior.
In vivo agregarea este indus de ADP, prosteglandine i tromboxan.
In vitro , agregarea placetelor poate fi indus direct, prin adugarea unei soluii de ADP
sau adrenalin n concentraii mari, sau indirect, prin utilizarea unui agent inductor al eliberrii
din plachete a ADP (epinefrin, colagen, ristocetin).
Agregarea trombocitar indus direct sau indirect poate fi ulteror studiat la microscop,
cu ajutorul fotometrului sau utiliznd agregametrul.
Studiul la microscop se poate face fie prin numrarea plachetelor dintr-o prob de
plasm, nainte i dup contactul cu diferii ageni inductori ai agregrii (ADP, colagen etc.) fie
prin observarea momentului apariiei agregatelor i taliei lor ntr-un preperat ntre lam i lamel,
la microscopul n contrst de faz.
Fotometrul msoar variaia transmisiei optice a unei probe de plasm bogat n plachete,
n prezena diferiilor ageni agregani, n condiii standard.Agregarea este cuantificat
determinnd msura n care aceata se clarific pe msura formrii agregatelor trombocitare care
vor sedimenta la captul tubului.
Agregametrul nregistraz grafic, n dinamic, curba modificrii transmisiei optice a unei
plasme bogat n plachete, constant agitat la 37 C, n prezena diferiilor ageni inductori
agregani, existnd o relaie direct proporional ntre creterea transmisiei optice i agregarea
plachetar. Curbele de agregare sunt interpretate n funcie de tipul i de concentraia stimulilor
folosii.
Agregarea trombocitar este un proces n doi timpi determinnd undele primar i
respectiv secundar ale agregrii. Unda primar este determinat de aderarea plachetelor una de
alta n prezena unui agonist ca ADP, epinefrin sau ristocetin iar cea ecumdar se produce ca
urmare a stimulrii plachetelor de a secreta substane coninute n organitele lor. Exist agoniti
care stimuleaz numai agregarea primar sau cea secundar i unii care le stimuleaz pe ambele
determinnd o curb de agregare bifazic. n plus, concentraii diferite ale aceluiai agonist
produce efecte diferite asupra tipului de agregare primar sau secundar, exemplu:
- concentraii sczute de ADP induc o agregare bifazic, concentraii foarte
mici de ADP induc o und primar urmat de dezagregare iar concentraiile
ridicate de ADP induc o singur und larg de agregare. Pacienii cu tulburri
ale eliberrii de trombocite nu vor prezenta rspunsul bifazic la ADP.
- Agregarea indus de colagen produce dup o perioad de laten o singur
und de agregare.
- Agregarea cu epinefrin ca i cea cu trombin este bifazic
- Agregarea indus de ristocetin este monofazic.



Platelet-rich plasma is produced from EDTA-anticoagulated whole blood by
centrifugation. Individual platelet agonists are added to aliquots of platelet-rich plasma in
clear tubes, and the change in light transmittance with time is measured in an
aggregometer. In the presence of agonists, normal platelets are rapidly activated, change
shape, and bind together to form aggregates. Initially, the light transmittance of the dense
platelet suspension is very low. Soon after adding an agonist, normal platelets aggregate
into progressively larger clumps. Light transmittance increases as aggregation proceeds.
Two waves of aggregation are seen with weak agonists (e.g., ADP and epinephrine), the
primary wave resulting from reversible agonist-dependent aggregation and the secondary
wave resulting from irreversible platelet-dependent aggregation following the release of
endogenous platelet-aggregating agents (Figure 15-4). Only one large wave of
aggregation is seen with strong agonists (e.g., collagen and thrombin). Specific platelet
function defects can be identified by this approach. For example, in Bernard-Soulier
syndrome, platelets do not aggregate in response to the nonphysiologic agonist
ristocetin but exhibit normal aggregation with all other agonists. This results from
inherited deficiency of the platelet VWF receptor Ib/IX. Ristocetin induces platelet
aggregation by forming molecular bridges between VWF molecules bound to VWF
receptors on adjacent platelets. Without platelet-bound VWF, RIPA cannot occur.



Retracia chiagului

ntr-un tub de coagulare se introduc 5 ml de snge recoltat prin puncie venoas, tubul
introducndu-se imediat n baie de ap la 37 C. Retracia cheagului se citete dup 4 ore, cnd
n mod normal, cantitatea de ser rezultat trebuie s reprezinte 30% pn la 45% din volumul
total al sngelui. n cazul n care cheagul nu se dezlipete spontan dup 30 sau 60 de minute de la
coagulare trebuie dezlipit de peretele eprubetei fr a seciona cheagul. Retracia cheagului este
influenat de numrul hematiilor i de concentraia fibrinogenului.
Retracia cheagului plasmatic
Principiu: activitatea plachetelor din ultima faz a coagulrii este apreciat prin msurarea
aciunii trombodinamice a factorului 7 plachetar , trombostenina, asupra cheagului de fibrin din
plasm, eliminndu-se factorul de eroare legat de prezena hematiilor dac testul ar fi executat
din snge integral.
Tehnic. Dup maxim o or de la recoltarea sngelui,
ntr-o eprubet (diametru 16/160) se introduc:
3,4 ml SF + 1,5 ml plasm de la pacient ( cu 100000 plachete/mmc) + 0,1 ml trombin sol de 50
U/ml
n a doua eprubet (diametru 16/160) se introduc:
3,9 ml SF + 1 ml plasm srac n plachete de la martor + 0,1 ml trombin sol de 50 U/ml.
Dup ce ambele eprubete se dau peste cap, sunt lsate 30 de secunde ntr-un stativ i apoi sunt
lsate o or n baie de ap la 37 C, practicnd dou decolri ale cheagului, una la 2 minute i a
doua la 10 minute da la introducerea n baia de ap.
Dup ora de incubaie se examineaz eprubeta martor, n care cheagul trebuie s rmn
neretractat (lipsa de plachete din prob) i eprubeta test cu cheagul retractat.
Din ambele eprubete cheagurile se apuc folosind o pens , fiind lsate s se preling uor pe
pereii eprubelelor, fr stoarcere. Serul rmas se decanteaz ntr-un cilindru gradat, de 5 sau 10
ml msurndu-se vlumul obinut.
Rezultatul se obine prin nmulirea volumului msurat cu 20 i se exprim n procente.
Valori normale > 85%.

Funciile tromboplastice ale trombocitelor pot fi puse n eviden prin teste ca: timpul de
cefalin, disponibilitatea factorului 3 trombocitar, consumul de protrombin corectat cu cefalin,
testul trombocitar Biggs i Douglas.

Explorarea hemostazei secundare implic un mare numr de teste care se adreseaz factorilor
plasmatici ai coagulrii, respectiv celor dou mecanisme, intrinsec i extrinsec, n care acetia
sunt implicai.
Timpul de coagulare (TC) este un test de explorare global a coagulabilitii.
Metoda Bazarov Milian utilizat frecvent n practic, are o sensibilitate redus, obinerea unui
rezultat normal neexcluznd existena unui deficit al coagulrii. Utiliznd snge capilar este util
n cazurile n care recoltarea venoas este imposibil (nou nscut, copii, colaps venos).
Tehnic: pe o lam de sticl se pune o pictur de ser fiziologic. Dup puncionarea pulpei
degetului se ndeprteaz prima pictur iar a doua pictur, mare, este lsat s cad liber peste
pictura de ser fiziologic moment n care se declaneaz si cronometrul. Lama se pstreaz ntr-o
camer umed (cutie Petrii cu perei tapetai cu hrtie de filtru umezit). Se urmrete momentul
instalrii coagulrii nclinnd uor lama din minut n minut.
Valorile normale sunt cuprinse ntre 6 10 minute. Alungirea timpului de coagulare indic o
hipocoagulabilitate sanguin global.
Metoda Lee, White (Timpul de coagulare venoas) are i el o sensibilitate limitat.
Tehnic: Se recolteaz snge venos care se repartizeaz n dou eprubete, cte 1 ml, plasndu-le
imediat n baie de ap la 37 C, moment n care se pornete i cronometrul. Eprubeta numrul 1
este examinat din minut n minut nclinnd-o la 45 . Dac eprubeta poate fi complet rsturnat,
cu cheagul format, se citete valoarea timpului de coagulare venoas. Sngele din a doua
eprubet, rmas nemicat, coaguleaz mai trziu i se consider momentul n care n aceast
eprubet apare cheagul difuz.
Valori normale:
6-10 minute n prima eprubet
8-12 minute n a doua eprubet
Timpul Howell (T.H.) reprezint timpul de coagulare dup recalcifierea unei plasme
citratate bogat n plachete fr adugarea unui reactiv biologic. Acest test studiaz factorii
plasmatici ai coagulrii, cu excepia factorului VII, i factorii trombocitari, reprezentnd i testul
de elecie utilizat n monitorizarea heparinoterapiei.
Testul poate fi efectuat manual dar n mod uzual se folosesc analizoare automate
Tehnic. Sngele recoltat pe anticoagulant (soluie de citrat de sodiu 3,8%) n raport de
9:1 este centrifugat la 1000 de turaii timp de 5 minute pentru obinerea plasmei bogat n
plachete. n eprubete de hemoliz se pipeteaz 0.2 ml plasm de cercetat i se incubeaz la 37
C (n baie de ap) 2 minute. Se adaug 0,2 ml CaCl soluie 0,025 molar, moment n care se
pornete i cronometrul. Dup 60 de secunde n care eprubeta rmne nemicat ea se
examineaz prin nclinare uoar din 10 n 10 secunde pn la 80 de secunde i apoi din 5 n 5
secunde pn la apariia coagulrii (filamente dense de fibrin sau un cheag opalescent). Se
lucreaz pe dou eprubete i se face media
Valorile normale sunt cuprinse ntre 60 i 120 de secunde. O alungire a acestui timp este
semnificativ dac depete 20 de secunde i poate fi de natur plasmatic sau trombocitar.
Diferenierea se poate face prin efectuarea timpului de tromboplastin parial activat (APTT). Un
TH alungit cu APTT normal indic o deficien plachetar. Dac ambele teste sunt alungite
deficiena este de natur plasmatic.
Timpul de tromboplastin parial activat (APTT) studiaz coagulabilitatea plasmatic
intrinsec cu excepia factorilor VII i XIII, fr a fi influenat de factorii trombocitari.
Reprezint timpul de coagulare al plasmei citratate, srac n plachete, la adausul unei soluii de
CaCl 0,025 molar i a unui reactiv coninnd o cantitate standardizat de cefalin (fosfolipid
extras din placent, esut cerebral, plante menit s substituie factorul 3 plachetar) i un activator
de suprafa (caolinul, acidul elagic sau silica). Caolinul mrete viteza activrii de contact,
fosfolipidul furnizeaz suprafaa pe care pot avea loc reaciile ntre enzimele coagulrii i
substrat, iar calciul nlocuiete calciul chelat de anticoagulant. Timpul de coagulare exprimat n
secunde se msoar din momentul adugrii ionilor de calciu pn n momentul formrii
cheagului.
Tehnic. Se recolteaz snge pe anticoagulant (citrat de sodiu n raport 9:1) din care se separ
plasma srac n plachete (prin centrifugarea probei de snge timp de 15 minute la 2500g) ntr-o
eprubet de hemoliz aflat n baie de ap la 37 C se pipeteaz 0,1 ml plasm de investigat, 0,1
ml reactiv APTT i 0,1 ml soluie de CaCl 0,025 molar moment n care se pornete i
cronometrul. e agit uor, se ine n baie de ap i se exanimeaz prin nclinarea uoar a
eprubetei pentru a observa momentul formrii cheagului.
Valoarile normale sunt cuprinse ntre 28 i 40 de secunde.
Timpul de protrombin (P.T.) sau timpul Quick (T.Q.) exploreaz factorii plasmatici ai
coagulrii implicai n mecanismul extrinsec (factorii VII, X, V, II care alctuiesc complexul
protrombinic). Reprezint timpul de coagulare al plasmei oxalatate sau citratate la adaos de
soluie de clorur de calciu i de tromboplastin tisular.Se lucreaz pe plasm srac n plachete
obinut prin centrifugarea probei de snge recoltat pe soluie de citrat ca anticoagulant n raport
9:1 sau a plasmei bogate n plachete la 5000 de turaii timp de 5 minute. Testul poate fi efectuat
manual dar n mod uzual se folosesc analizoare automate care pipoeteaz reactivii, incubeaz i
citesc momentul apariiei cheagului.
Tehnic. Recoltarea sngelui n vederea efecturii testelor de hemostaz nu trebuie
precedat de o alt recoltare deoarece poate induce o hipercoagulare reactiv. Aplicarea garoului
trebuie s produc o staz venoas moderat i s lase liber fluxul arterial. Staza venoas
excesiv, prelungit, d natere la o activitate fibrinolitic local care poate interfera cu celelalte
determinri.
Venopuncia practicat n vena antecubital trebuie s fie ndemnatic i ferm pentru a
evita cea mai mic contaminare cu tromboplastina tisular. Sngele se recolteaz pe
anticoagulant (o parte anticoagulant i nou pri snge) i este centrifugat n vederea obinerii
plasmei. TP necesitnd plasm srac n plachete i de aceea sngele se centrifugheaz 10
minute la 5000 turaii/minut.
ntr-o eprubet de hemoliz 10/100 aflat n baie de ap la 37 C se pipeteaz 0,1 ml
plasm de cercetat, se adug 0,1 ml tromboplastin tisular i apoi 0,1 ml soluie CaCl
2
0,025M
(toate prenclzite 5 minute la 37 C) moment n care se declaneaz cronometrul. Dup agitarea
coninutului, eprubeta se las linitit 10 secunde. apoi se scoate din baia de ap i nclinnd-o
uor, din secund n secund, se urmarete momentul formrii cheagului cnd se va opri
cronometrul. Proba se lucreaz n dublu i rezultatul este dat de media valorilor obinute.
Valorile normale sunt cuprinse ntre 11-13 secunde.
Prin raportarea valorilor obinute (TQ bolnav) la o plasm de martor normal (TQ martor
normal), se obine exprimarea procentual a rezultatului cu valori normale ntre 70-100%, aa
numita activitate de protrombin.
Exprimarea n secunde a TQ a fost completat cu cea dat de rezultatul raportului dintre
TQ bolnav / TQ martor normal care nu mai este afectat de variaiile tehnice ale testului. Aceast
modalitate de exprimare a rezultatului menine ns variaii sistematice determinate de folosirea
de tromboplastine cu sensibiliti diferite pentru defectele de hemostaz ceea ce a fcut necesar
calibrarea tromboplastinei prin determinarea TQ a mai multor martori normali i calcularea
mediei lor geomatrice. Se exprim ntr-un sistem de coordonate relaia dintre TQ pacieni i
media log TQ a normalului rezultnd o linie dreapt a crei pant este denumit Index
internaional de sensibilitate (ISI). Aceasta reflect sensibilitatea tromboplastinei folosite i poate
varia ntre 1 i 3. Cunoscnd ISI poate fi calculat Rata Internaional Normalizat (INR) care
furnizeaz o scal internaional comun i eficient pentru evaluarea gradului de anticoagulare.
INR= (Ratio T.Q.)
ISI
= antilog (log Ratio T.Q. x ISI) ; Ratio TQ =
) (
) ln (
normal TQ
av bo TQ


Valoarea ISI se obine prin folosirea rezultatelor unui numr mare de laboratoare care aplic
aceleai recomandri metodologice de calibrare. Tromboplastinele cu sensibilitate mare au ISI
mic iar cele insensibile au ISI mare.
Timpu;l de trombin (T.T.) reprezint timpul de coagulare al plasmei citratate dup
adugarea de calciu i a unei cantiti cunoscute de trombin. Testul evalueaz interacia dintre
trombin i fibrinogen, apreciind momentele terminale ale cii comune celor dou mecanisme
ale coagulrii, intrinsec i respectiv extrinsec. n urma aciunii trombinei asupra fibrinogenului
sunt eliberate fibrinopeptidele A i B. n urma clivrii acestora rezult monomerii de fibrin ce
formeaz aggregate solubile. Sub aciunea factorului XIII activat de trombin i a ionilor de
calciu, are loc o polimerizare transversal a monomerilor de fibrin, cu formare de fibrin
insolubil.
Timpul de trombin poate fi prelungit n cazul deficienei fibrinogenului (calitativ i/ sau
cantitativ) sau a prezenei n circulaie a anticoagulanilor circulani activi care interfer cu
aciunea trombinei, cum ar fi heparina.
Tehnic. ntr-o eprubet de hemoliz, la 37 C se pipeteaz 0,2 ml plasm citratat aplachetar
i 0,2 ml soluie de trombin i se declaneaz cronometrul. Du[ 10 secunde se urmrete din
secund n secund formarea cheagului. Probele se lucreaz n dublu considerndu-se media
valorilor obinute.
Valorile normale sunt de 17 s +/- 3 s.
Explorarea fibrinolizei poate fi efectuat prin metode directe care msoar activitatea
plasminei i a activatorilor plasmatici circulani (determinarea timpului de liz al cheagului
euglobulinic (TLCE), metoda Astrup, determinarea plasminogenului i metode indirecte cum ar
fi evidenierea produilor de degradare a fibrinei i fibrinogenului (FDP).
Metode directe. Timpul de liz al cheagului euglobulinic (TLCE) msoar aciunea
fibrinolitic global asupra unui substrat de fibrin endogen. Fracia euglobulinic a plasmei
conine fibrinogen, plasminogen, activatorii plasmatici ai coagulrii i urme de antiplasmin.
Adaugarea trombinei ntr-o soluie de euglobuline transform fibrinogenul n fibrin i
activeaz plasminogenul. Motivul principal pentru care plasminogenul (prin produii si activi,
n special plasmina), dizolv fibrinogenul, este ndeprtarea acestuia de inhibitorul su natural
din fracia antiglobulinic (n principal antiplasmina) n euglobulinele preparate din snge
normal , cheagul iniial se dizolv n 2-6 ore.
TLCE < 60 de minute semnific apariia fibrinolizei patologice Liza cheagului este
marcat i rapid n fibrinoliza primar, dar poate fi minim n fibrinoliza secundar. Chiar n
condiii de fibrinoliz excesiv, de obicei este suficient fibrinogen pentru a forma un cheag la
adugarea trombinei, dar aspectul acestuia este anormal nc de la nceput i liza acestuia se
poate produce n cteva minute. Un proces mai puin sever determin o disoluie complet a
cheagului n 60-90 minute. TLCE este scurtat i n sngele cu activitate fibrinolitic normal dar
cu o concentraie redus de fibrinogen, cnd o cantitate mai mic de fibrin urmeaz a fi lizat.
n acest caz va fi necesar efectuarea unui alt test, liza plcilor de fibrin sau metoda Astrup
care msoar aciunea fibrinolitic asupra unui substrat de fibrin exogen, aplicnd euglobulina
de la pacient pe o plac standard de fibrin pe care se va determina gradul de disoluie al
cheagului.
Tehnic. Imediat dup recoltarea sngelui venos pe soluie de citrat de sodiu ( o parte
anticoagulant i 9 pri snge) proba se las la frigider la + 4 C timp de 5 minute, dup care se
centrifugheaz 10 minute la 5000 de ture pentru a obine plasm fr plachete. Din aceast
plasm se transfer 0,5 ml ntr-o eprubet coninnd 9 ml ap distilat, se adaug 0,08 ml soluie
acid acetic 1% (pentru a precipita euglobulinele) i se pstreaz la frigider nc 15 minute, pentru
precipitarea complet a euglobulinelor. Proba se centrifugheaz din nou 5 minute la 5000 de
turaii, dup care se ndeprteaz supernatantul complet (conine factorii antilitici) prin
rsturnarea eprubetei pe o hrtie de filtru, chiar uscnd pereii eprubetei cu fii de hrtie de
filtru. Precipitatul euglobulinic obinut este dizolvat prin adugarea n eprubet a 0,5 ml tampon
borat, innd eprubeta n baie de ap la 37 C i amestecnd foarte uor cu o baghet fin. Dup
dizolvarea complet a precipitatului se adaug 0,5 ml soluie CaCl
2
0,025 M i n aproximativ 5
minute se formeaza un cheag care umple fundul eprubetei, moment n care se pornete
cronometrul. Eprubeta se las linitit n baia de ap i se examineaz din 15 n 15 minute
evoluia cheagului, far a agita eprubeta. Se oprete cronometrul n momentul disoluiei complete
a cheagului.
Valori normale :
Pentru femei = 180 minute +/- 30 minute
Pentru brbai = 150 minute +/- 30 minute

Metoda plcilor de fibrin (Astrup)
Principiu. Depunerea pe suprafaa unui gel de fibrin bovin a unui volum prcis msurat de
soluie de euglobuline, determin dup un anumit timp de incubare, apariia n jurul picturii a
unui halou de liz al crui diametru permite exprimarea cantitativ a activitii fibrinolitice.
Gelul de fibrin insensibil la aciunea lizokinazelor este sensibil numai la prezena activatorilor
sau a plasminei. Distrugerea prealabil a plasminogenului prin nclzire face plcile sensibile
numai la aciunea plasminei.

Tabelul nr. Aciunea fibrinolitic pe plcile Astrup
Tipul de plac Fibrin bovin
nenclzit
Fibrin bovin
nclzit la 80 /45 min.
Factori prolitici coninui plasminogen -
Reacia plcii de evideniere
a existenei n soluia de cercetat
a activatorului indirect (lizokinaze)

-

-
Reacia plcii de evideniere
a existenei n soluia de cercetat
a activatorului direct (Kinaze)

+

-
Reacia plcii de evideniere
a existenei n soluia de cercetat
a plasminei
+ +


Determinarea concentraiei plasminogenului
Principiu. Sub aciunea plasminei, format n urma activrii cu streptokinaz a plasminogenului,
se produce hidroliza cazeinei cu eliberarea tirozinei care se msoar prin metode spectro sau
fotocolorimetrice. Dup un timp de incubaie a cazeinei cu proba de testat, diferena dintre
concentraia nainte de incubaie i cea dup incubaie a cazeinei msoar activitatea proteolitic
a plasminei din prob, care va fi convertit prin calcul n uniti de plasminogen

Metodele indirecte msoar consecinele fibrinolizei asupra fibrinei, fibrinogenului sau asupra
altor factori plasmatici ai coagulrii i cuprind decelarea FDP-urilor, a nivelului de fibrinogen, a
nivelelor factorilor VIII i V.
Determinarea FDP
Testul aglutinrii complexului latex-anticorpi antifibrinogen (calitativ)
Principiu. Anticorpi mpotriva fragmentelor X, Y, D i E din serul antifibrinogenului uman foarte
pur sunt adsorbii de particulele de latex ale reactivului ceea ce va permite vizualizarea
aglutinrii ce se produce n prezena produilor de degradare ai fibrinei sau fibrinogenului. n
serul normal nivelul de FDP este egal sau mai mic de 10g/ml. Apariia aglutinrii indic
depirea acestui prag i poate fi exprimat cantitativ utiliznd scara de diluii a lui L. Pechet
conform tabelului de mai jos:

Nr.eprubetei 1 2 3 4 5 6 7 8
Tampon (ml) 0,80 0,50 0,50 0,5 0,25 0,25 0,25 0,25
Ser pacient (ml) 0,20 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50
Diluie realizat 1/5 1/10 1/20 1/40 1/60 1/90 1/135 1/202
Echivalentul concentraiei n antigenn
serul nediluat al pacientului (g/ml)

10

20

40

80

120

180

270

404
Echivalentul concentraiei n antigenn
serul diluat al pacientului (g/ml)

2

1

0,5

0,25

0,17

0,11

0,074

0,0495

Trombelastografia (TEG) este o metod de evaluare cu maxim acuratee a procesului
coagulrii, de la nceputul formrii cheagului pn la fibrinoliz. TEG msoar din punct de vedere
cantitativ i calitativ formarea cheagului, ceea ce alte investigaii de rutin ale coagulrii nu o pot
face, apreciind cinetica formrii cheagului, structura sa i oferind prin graficul nregistrat aspectul
dinamic al coagulrii.
Aspectul normal al trombelastrogramei cuprinde trei zone (fig.nr.):


Fig. nr. Zonele trombelastrogramei normale.

- zona precoagulrii sau faza invizibil a sa, nregistrat grafic sub forma unui segment liniar
(dureaz de la nceputul procesului i pn la formarea primelor filamente de fibrin).
- zona coagulrii, ce ine din momentul ncheierii fazei precoagulrii, adic sfritul segmentului
liniar, pn la maxima separare a celor dou brae simetrice ale TEG, moment n care se
consider c trombul este complet format; corespunde fazei vizibile a coagulrii.
- zona de fibrinoliz ce ncepe dup sfritul zonei de coagulare. Pn n acest moment,
nregistrarea are aspectul unui pahar cu picior, iar fibrinoliza marcheaz apropierea celor dou
brae (laturi ale paharului) ale TEG.
Dac nregistrarea este fcut un timp suficient de lung, fuzionarea celor dou ramuri
ntr-una singur va indica liza total a cheagului.
Parametrii msurai cu ajutorul TEG sunt:
- R Timpul de reacie este echivalent zonei de precoagulare; ofer informaii asupra
generrii tromboplastinei endogene i a trombinei. Tromboplastinoformarea are durat mai lunga
dect trombinoformarea si de aceea R este influenat mai ales de factorii implicai n formarea
tromboplastinei endogene. Valorile normale sunt cuprinse ntre 10-14 mm. O prelungire ale
valorilor R indic existena unor deficiene ale trombocitelor /saui ale factorilor coagulrii sau
pacientul se afl sub tratament cu anticoagulante.
- K Timpul de formare al cheagului (valori normale cuprinse ntre 3-6 mm); reprezint
distana msurat n mm de la sfritul timpului de reacie R, pn n punctul n care distana
dintre cele dou brae ale TEG este de 20 mm. Parametrul K reflect transformarea
fibrinogenului n fibrin sub aciunea trombinei. Valorile sale depind de cantitatea de trombin
format.
- AM Amplitudinea maxim sau elasticitatea maxim reprezint distana maxim ntre
cele dou brae divergente ale TEG; n acest moment cheagul este complet format, valoarea AM
reflectnd structura dens sau lax a cheagului respectiv rezistena la deformarea cheagului mai
ales rezistena la deformarea reversibil (elasticitatea).
Valoarea AM este influenat de funcia i numrul trombocitelor, de concentraia
fibrinogenului, trombinei, factorului XIII i de valoarea hematocritului (valori normale cuprinse
ntre 59 - 68 mm).
- Unghiul alpha - este unghiul format ntre linia din mijlocul trombelastogramei i
tangenta la graficul n formare al trombelastogramei. Unghiul evideniaz cinetica formrii
fibrinei.
Valorile unghiului alfa i parametrul K relev ct de repede forele de sfiere i torsiune
se dezvolt n cheag, adic rata de formare a cheagului. Aceti parametri variaz dac exist
deficiene n privina factorilor coagulrii sau trombocitelor. Astfel de variaii sunt prezente la
pacienii cu trombocitopenie i hipofibrinogenemie.
n general se recomand o analiz global i nu individual a parametrilor TEG, aceasta fiind
o metod valoroas n studierea tulburrilor de coagulare i n aprecierea eficacitii utilizrii
substanelor anticoagulante. De asemeni, TEG s-a dovedit a fi o metod foarte sensibil n
identificarea strilor de hipercoagulabilitate i n prevenirea trombozelor venoase.
Instrumentul folosit pentru aceast nregistrare poart numele de trombelastograf. El poate
lucra simultan pe dou canale sau mai multe, fiecare canal de lucru prezentnd n principal
urmtoarele piese evideniate n fig. nr :
- o cuv de plastic ce se fixeaz ntr-un colier metalic i n care se pune
sngele de prob, 330 l i 30 l clorur de calciu;
- un pin de msurare ataat la un cablu de torsiune calibrat, cheagul de fibrinformndu-se
ntre pin i cuv.
n timpul formrii cheagului se imprim o micare de rotaie pinului ce se va nregistra grafic
pe hrtie impresionat termic, dar i pe
monitorul calculatorului, dac este
realizat conexiunea cu acesta.
















Fig.nr.