PROBA PRACTICA

1. Efectuarea i colorarea unui frotiu de snge periferic:

Executia frotiului de sange:
Se foloseste sange capilar pt aprecierea exacta a morfologiei cel sanguine si a nr de Tr.
Materiale: lanteta sau ac de unica folosinta
Vata, tifon sau hartie de filtru; alcool
Tehnica: locul de punctie: pulpa degetului inelar sau mijlociu (la adulti), supraf plantara a calcaiului sau a
halucelui (la sugari).
Supraf intepata trebuie sa fie calda si bine vascularizata; daca e rece sau cianozata iar sangele apare lent,
se obtin valori crescute pt Hg, nr de L si de Er Se dezinfecteaza pielea, apoi se inteapa ferm si rapid,
suficient de adanc pt ca sangele sa tasneasca de la sine.
Primele picaturi se sterg cu un tifon uscat sau o hartie de filtru, iar urmatoarele se recolteaza evitand
stoarcerea degetului.
Picaturile de sange pot fi folosite pt obtinerea de frotiuri prin depunerea lor pe lame de sticla.
Observatii:
1. in sangele capilar, Hg, Ht si nr Er sunt mai scazute decat in sangele venos;
2. nr de Tr se apreciaza mai exact prin examinarea unui frotiu de sange capilar (unde nu s-a folosit
anticoagulant la recoltare; in sangele venos pastrat pe anticoagulant acesta poate produce gruparea Tr sau
fenomenul de satelitism, ceea ce va duce la valori fals scazute ale Tr);
3. anticoagulantul poate produce alterari ale morfologiei cel sanguine.
Tehnica:
Se pune o picatura mica de sange pe o lama-suport, la 1-2 cm distanta de unul din capete, pe linia
centrala.
Se pune in contact picatura cu capatul unei lame slefuite, tinand-o la un unghi de aprox 30-450 fata de
lama-suport. Picatura se va intinde de-a lungul liniei de contact dintre cele 2 lame.
Se intinde frotiul cu o miscare de translatie lina, uniforma si rapida a lamei slefuite.
Lama cu care se intinde frotiul trebuie sa fie putin mai ingusta decat lama-suport pt a se putea obtine si
examina 2 margini paralele in lungime ale frotiului: se foloseste o lama slefuita cu colturi rupte.
Frotiul se usuca rapid prin agitare in aer.
Observatii:
-un frotiu bine executat trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii:
-lungime = 3-4 cm
-sa fie mai ingust decat lama
-sa aiba 2 margini drepte, paralele, si franjuri in partea terminala.
-sa aiba o grosime potrivita, cu o trecere gradata de la gros la subtire.
-celulele sa fie raspindite uniform, sa nu fie distruse sau deformate.

2. Numrarea leucocitelor n camera Brker-Trk dintr-o prob de snge periferic.

Leucocitele sau globulele albe sunt celule ale sistemului imunitar produse de maduva osoasa si care apara
organismul de boli infectioase si de corpuri straine.
Se recunosc uor dup morfologia nucleului i dup dimensiuni, diametru 10-21m, adic de 2 -3 ori mai
mari dect hematiile,
Conin n citoplasm dou tipuri de granulaii: specifice i nespecifice.
Clasificarea leucocitelor se face dup prezena granulaiilor specifice, n:
Granulocite: neutrofile, bazofile, eozinofile
Agranulocite: monocite i limfocite
Numr: 4000-8000 /mm
Tehnica: Numararea leucocitelor se efectueaza asemanator numararii eritrocitelor. Se aspira sange in
pipeta potain pana la diviziunea 0,5, apoi lichidul de dilutie turk pana la diviziunea 11. Rezulta o dilutie
de 1/20. Se numara patru campuri de 1mm in cele patru colturi ale camerei, deci 4mm. efectuarea
masurarii se face folosind optica obisnuita (10x40), variind constant viza micrometrica; Se face media
aritmetica a numerelor obtinute. Pentru a afla numarul de leucocite /mm, se face corectia de dilutie si
inaltime dupa formula: nr de leucocite = Mx10x20
Interpretarea rezultatului:
Valori normale: -la adulti: 4 000 - 8 000/mm,
-la sugari: 8 000 12 000/mm,
-la nou nascuti: 12 000 - 20 000/mm.

Variatii ale numarului de leucocite:

a.) Leucocitoza: cresterea numarului de leucocite peste 10 000/mm.

-fiziologica: efort muscular intens si prelungit, hemoconcentratie, sarcina, emotii,
postprandial.
-patologica: inflamatie (de obicei de origine infectioasa), traumatisme, infarct.
b.) Reactie leucemoida: cresterea masiva a leucocitelor la valori pana la 50 000/mm, tablou hematologic
ce sugereaza leucemia, dar nu este leucemie. Este un fenomen reversibil, o reactie de aparare a
organismului, stimularea maduvei osoase fiind realizata de tixine bacteriene, virusuri, toxine chimice.
c.) Leucemie: numar foarte mare de leucocite, sute de mii (peste 100 000).
d.) Leucopenia: scaderea numarului de leucocite sub 3 500/mm,la trei determinari repetate si in
conditiile unui efort fizic minim (scara urcata, genoflexiuni repetate).
-fiziologica: varstnici, surmenaj fizic, leucopenia permanenta: 2 000 3 000
leucocite/m, fara manifestari patologice
-patologica: prin inhibitie medulara (expuneri la radiatii ionizante,citostatice,
utilizarea indelungata de antibiotice sau alte medicamente) si prin distructie
exagerata (boli autoimune, hipersplenism, infectii virale ).

3. Numrarea trombocitelor n camera Brker-Trk dintr-o prob de snge periferic.

Explorarea hemostazei primare-trombocitele.
-Trombocitele reprezinta un tip special de celule ale sangelui cu rol important in procesul de coagulare,
din cadrul hemostazei primare. Daca un pacient nu are o cantitate suficienta de trombocite in sange, poate
fi supus unui risc crescut de hemoragii si echimoze.
-Sunt fragmente citoplasmatice, au form de disc lenticular, cu o zon periferic omogen, palid colorat,
numit hialomer, care conine microtubuli i microfilamente, o zon central, ntunecat, numit
granulomer, format din: lizozomi, peroxizomi, granule alfa, corpi deni i mitocondrii, nu au nucleu.
Tehnica: Numararea tr se efectueaza asemanator numararii eritrocitelor. Se aspira sange in pipeta potain
pana la diviziunea 0,5, apoi lichidul de dilutie turk pana la diviziunea 11. Rezulta o dilutie de 1/200;
1/100. Pentru a obtine liza eritrocitara se omogenizeaza pipeta 2 min, se asteapta apoi 15 min, se agita din
nou, se agita din nou si se indeparteaza primele 3-4 picaturi din varful pipetei; Plachetele apar ca niste
corpusculi mici , izolati, refrigerenti, ca niste pucte negre mai mari decat leucocitele care stralucesc la
miscarea microvizei microscopului. Se numara 5 grupe a cate 16 patratele de dimensiuni 1/4000 mm2, in
total 80 patratele, obtinandu-se cifra N, efectuarea masurarii se face folosind optica obisnuita (10x40),
variind constant viza micrometrica; Se calculeaza nr. Tr:
-nr.tr.=nr.tr./80 patratele de 1/400 mm2(2 la patrat)x5xdilutia x inaltimea camerei (10)
-adica se va inmulti nr.tr./80 patratele de 1/400 mm2(2 la patrat) cu 10000
-daca dil este 1/100 se va inmulti nr.tr./80 patratele de 1/400 mm2 cu 5000
-numarul de tr./l=nr.tr./mm2(2 la patrat) x 10.000.000
Eroarea metodei, folosind o camera si o pipeta de numarat este de +-30-40%; iar folosind 2 pipete si 2
camere scade la 16%, numaratoarea electronica are eroare mai mica 7.5%, iar cifra gasita trebuie
coroborata cu modificarile lor de pe frotiul colorat.
Aspect morfologic de pe frotiul de sange:
-grupe mari de tr., macrotrombocite, granulate (asociate cu reticulocite=sangerare)
-placute izolate, negrupate indica trombopatii
-grupe de 15-20 elemente indica o cifra normal de tr.
Interpretarea rezultatului: nr.trombocite:150.000-300.000 mm3
Modificari patologice:- nr.scazut (trombocitopenie) <150.000mm3:
-scaderea productiei medulare (anemie aplastica), leziuni medulare
-creste distructia sau consumul in sangele periferic (CID sau coagulare intravasculara diseminata)
- sechestrare splenica (splenomegalie)
- factorii imunologici
-nr.crescut (trombocitoza) >300.000mm3 :
primara in afectiunile mieloproliferative
- secundara in conditii de traumatisme sau hemoragii severe
- trobocitemie

4. Determinarea vitezei de sedimentare a hematiilor dintr-o prob de snge periferic.

Viteza de sedimentare a hematiilor (V.S.H.) este o constant biologic de mare interes n patologie.
Dac se adaug un anticoagulant (citrat de sodiu) sngelui recoltat ntr-o mic eprubet metoda
Westergreen), globulele se depun pe fundul tubului, datorit greutii lor specifice care este superioar
celei a plasmei. Valorile normale la o or sunt de 6-l2 mm la brbat i de 10 - 16 mm la femeie. Creterea
V.S.H. indic un process evolutiv, a crui intensitate este cu att mai mare, cu ct valorile sunt mai mari.
V.S.H. depinde de proteinele sanguine i ndeosebi de fbrinogen i de alfa-globuline.
In diagnosticul anemiilor se practic i dozarea fierului seric. La 100 ml ser la brbat se gsesc lOOg, iar
la femeie 90g. Valorile cresc n ciroza pigmentar i scad n anemiile hipocrome.
Pentru aprecierea gradului de distrugere a hematiilor se dozeaz urobilina n materiile fecale. Eliminri
crescute apar n anemiile hemolitice i n anemia pernicioas (Piermer).
In unele stri patologice, n sngele periferic apar i hematii anormale: megalocite i megaloblati, n
anemia Biermer; eritroblati, n anemia hemolitic; reticulocite depind valoarea normal de 1%, n
hemoragii, criza hemolitic, tratamentul cu fier sau extracte hepatice.
In strile patologice pot aprea diferite anomalii ale hematiilor: variaii anormale ale dimensiunilor
(anizocitoz cu prezena macrocitelor sau microcitelor), deformri ale globulelor - "n par", "n virgul",
"n bastona" (poikilocitoz) -, anomalii de coloraie (policromatofilie) etc.
Viteza de sedimentare a hematiilor (VSH) este o prob care exprim grosimea statului de depunere a
eritrocitelor (hematiilor), exprimat n milimetrii [mm], n eprubet, ntr-un interval de o or [1h], 2 ore
[2h] sau o zi [24h] . Dup cum se tie, n plasm, eritrocitele se afl n suspensie. Dup recoltarea unei
probe de snge i depunerea ei ntr-o eprubet mpreun cu o substan anticoagulant, are loc o
sedimentare a hematiilor (eritrocitelor) care const n depunerea lor la fund, proces ce are loc simultan cu
limpezirea, clarificarea probei n partea ei superioar..
Mod de recoltare punctie venoasa cu holder+ac -vacutainer cu capac negru sau seringa de 2ml si ac de
punctie venoasa; pipete Westergreen cu stativul corespunzator; citrat de sodiu 3,8%, solutie sterila;
materiale necesare recoltarii sngelui prin punctie venoasa.
Tehnica
- se aspira n seringa solutie de anticoagulant cu care se clateste seringa, retinndu-se 0,4ml;
- se punctioneaza vena, dupa dezinfectare, si se aspira snge n seringa pna la 2 ml;
- continutul seringii se amesteca prin cateva miscari de rasturnare;
- proba se trece apoi ntr-o eprubeta din care se aspira cu pipeta Westergreen pna la diviziunea 0, astfel
nct coloana de snge sa fie continua; metoda manuala Westergren: se aseaza tubul in pozitie verticala
intr-un suport gradat milimetric si se citeste nivelul de sedimentare a hematiilor in mm dupa 1 ora; in
unele teste este citit rezultatul si dupa un interval de 2 ore, dar acesta nu furnizeaza informatii
suplimentare
- se plaseaza pipeta n stativ n pozitie perfect verticala;
- citirea se face dupa o ora, iar rezultatul se exprima n mm coloana de plasma
separata de eritrocite n decurs de o ora (mm/ora).
Valori normale:
- barbat: 1 10 mm/ora;
- femeie: 2 13 mm/ora;
Variatii fiziologice:
la femei, V.S.H.-ul creste n timpul menstruatiei;
la femei, V.S.H.-ul creste n sarcina (mai ales n ultimele luni).
Variatii patologice:
Cresterea V.S.H.-ului apare n boli infectioase sau inflamatorii (pneumonii, rheumatism articular acut,
tuberculoza activa, septicemie, pielonefrite), n anemii, infarct miocardic, leucemii, neoplasme, etc.
Scaderea V.S.H.-ului apare n poliglobulii, etc.

5. Examinarea microscopic a unui frotiu din snge periferic. Stabilirea formulei leucocitare.
Granulocite neutrofile (nucleu segmentat) Pe un frotiu recoltat din sangele periferic se observa
predominanta celulelor anucleate, respectiv a hematiilor. Din loc in loc se gasesc si elemente nucleate.
Leucocitele neutrofile (granulocitele neutrofile) sunt cele mai numeroase leucocite, fiind prezente in
sange in procent de 45-75%. Sunt celule globuloase, emit pseudopode ceea ce le confera o mare
mobilitate. Durata de viata a neutrofilelor este de 2-5 zile, ele persistand in sange 6-12 ore. Au nucleu
caracteristic, segmentat, prezentand 2-5 lobi nucleari legati intre ei prin punti de cromatina. Asezarea
lobilor in neutrofil realizeaza forme diferite, asemanatoare literelor din alfabet (C, E, U, V, S, Z, Y). La
sexul feminin aproximativ 3% din neutrofile prezinta la unul din lobii nucleari corpusculul Barr, ce
reprezinta cromatina sexuala condensata a unuia din cei doi cromozomi X. Corpusculul sexual apare la
microscop ca o prelungire a lobului nuclear sub forma unui bat de toba.
Citoplasma neutrofilului este slab acidofila, colorata in roz palid. Gradul de segmentare al nucleului
corespunde cu varsta celulei. In citoplasma se gasesc numeroase granulatii fine.
Limfocite (nucleu sferic) Limfocitul este o celula sferica sau usor ovala, se gaseste in sange in proportie
de 25-45%. Nucleul limfocitului este mare,usor incizat, colorat in violet, ocupand mare parte din
citoplasma care este redusa la un inel perinuclear. Citoplasma este bazofila, contine granulatii azurofile,
organite celulare. Durata de viata in sangele periferic este diferita, fiind situata intre cateva zile si un an,
dar unele limfocite pot atinge si varsta de 5-25 ani. Limfocitele joaca un rol important in imunitate
(limfocitele B si T)
Granulocite eozinofile (nucleu bilobat) Eozinofilul se gaseste in sangele periferic in proportie de 1-5%,
fiind printre cele mai mari elemente din grupul granulocitelor segmentate. Celulele sunt sferice, cu nucleu
bilobat sau "in desaga". Se pot intalni in sangele circulant si eozinofile cu nucleu trilobat. Citoplasma este
intens acidofila, contine organite celulare si granulatii acidofile.
Durata de viata a eozinofilelor este de 8-12 zile.
Monocite (nucleu reniform) Monocitele se gasesc in sangele periferic in proportie de 6-8%. Se impart in
monocite mici-inactive si monocite mari-active. Sunt celule globuloase, cu citoplasma abundenta,
bazofila, ce se coloreaza in albastru-cenusiu. Nucleul celulei este nesegmentat, mare, deseori reniform.
Monocitul impreuna cu macrofagul tisular joaca un rol important in apararea organismului.
Durata de viata in sangele circulant este de 10-60 ore
Principiu : o pictur de snge capilar se ntinde n strat subire pe o lam, aa nct elementele figurate s
nu fie suprapuse. Etalarea frotiului se face cu o lam lefuit, cu colul rupt, pstrnd un unghi de
nclinaie de 45 grade.Imediat dup ntindere, frotiul se usuc prin agitare cu scopul primei fixri i apoi
se coloreaz.
Tehnica:
A) Fixarea: se acopera frotiul cu solutia May-Grunwald si se lasa 2-3 min.
B) Colorarea: se adauga peste solutia May-Grunwald apa tamponata, si se lasa astfel 2 min.
Se varsa solutia de pe lama si se acopera lama cu solutie Giemsa diluata (o picatura sol Giemsa pt 1 ml
apa tamponata), apoi repaus 20 min Se spala lama la robinet. Se sterge dosul lamei si se lasa lama in
stativ pt uscare
Timpii tehnicii de colorare MGG:
Se prepar soluia de lucru Giemsa prin diluarea a 3 picturi de colorant cu 2 cm de ap distilat.
Fixarea: se acoper frotiul cu 20-25 de picturi de soluie May- Gruenwald, se las 2 - 3 minute, timp n
care are loc fixarea chimic.
Colorarea se face n 2 timpi: peste soluia M-G se adaug 20-25 de picturi de ap tamponat, obinnd
colorantul n stare nativ, care se las s acioneze 2 minute.
Amestecul colorant se ndeprteaz fr a spla lama, dup care aceasta se acoper cu soluia Giemsa
diluat care se las s acioneze 25-30 minute.
Frotiul se spal cu un jet puternic de ap de robinet, se usuc i se examineaz la microscop, cu obiectiv
imersie.

Rezultate:
Frotiul corect colorat trebuie s aib culoarea roz-violet sau rou-violet.
Nucleii apar colorai n violet de intensiti variabile, n funcie de raportul ntre eucromatin/
heterocromatin.
Nucleolii sunt colorai n albastru deschis.
Citoplasma :
-acidofil se evideniaz n roz, rou sau crmiziu, prin colorare cu eozin;
-bazofil apare n nuane de albastru, , prin colorare cu albastru de metilen;
Granulaiile:
-neutrofile sunt colorate n violet, cu eozinatul de albastru de metilen (colorant neutru);
-acidofile (eozinofile) apar n rou crmiziu;
-bazofile sunt colorate n albastru, sau n violet (metacromatic) cu albastru de metilen;
-azurofile, se coloreaz n violet purpuriu cu azur II, din compozitia colorantului Giemsa.
Criteriile de recunoatere ale elementelor figurate prezente pe frotiu:
Solutie May-Grunwald: eozinat de albastru de metilen 1 g; Glicerina neutra 50 ml; Alcool metilic 100 ml
Solutie Giemsa: eozinat de azur de metilen 3 g; Azur de metilen 0,8 g; Glicerina neutra 250 ml; Alcool
metilic 200 ml. Mai sunt necesare: apa distilata neutra, pipete Pasteur, pipete gradate.
Observatii:
- pH-ul apei distilate trebuie sa fie 7-7,2. Apa distilata fiind de obicei acida, se neutralizeaza prin
adaugarea catorva picaturi de solutie slab alcalina de carbonat de sodiu 1% la 500 ml de apa distilata,
incercandu-se pH-ul cu indicator universal de hartie.
-un frotiu bine colorat prezinta microscopic:
-zonele dintre celule: clare
-er: portocaliu-rosu
-granulatiile neutrofile: purpuriu
-granulatiile eozinofile: rosu-portocaliu
-granulatiile bazofile: albastru-inchis, negru
-citoplasma limfocitelor (Lf): albastru palid
-nucleul leucocitelor (L): albastru-violaceu

6. Interpretarea valorilor unei hemograme complete furnizate de un analizor automat

multiparametric.
Se realizeaza pe un analizor automat de hematologie ce permite determinarea a 21 de parametri ai
hemoleucogramei - inclusiv diferentierea leucocitelor in 5 populatii - prin urmatoarele metode:
1) Focusare hidrodinamica (impedanta electrica);
2) Citometrie in flux cu laser semiconductor;
3) Masurarea cu SLS (sodium lauril sulfat) a hemoglobinei prin metoda fotometrica.
1) Metoda cu focusare hidrodinamica
Prin aceasta metoda sunt determinate numarul si dimensiunile eritrocitelor si trombocitelor. Scopul
focusarii hidrodinamice este de a reduce suprapunerea si recircularea celulelor in zona de detectie. Dupa
aspirare si diluare cu reactiv, particulele sunt directionate intr-un singur rand printr-o apertura si
genereaza semnale electrice pulsatorii, pe baza carora se efectueaza numaratorile celulare.
2) Citometria in flux
Numarul de leucocite si formula leucocitara sunt determinate, dupa lizarea eritrocitelor, cu ajutorul
citometriei in flux, care permite analizarea caracteristicelor fizice si chimice ale celulelor. Proba de sange
este aspirata, diluata si colorata. Celulele sanguine trec apoi in linie, una cate una, prin centrul camerei de
flux, unde raza laser emisa de semiconductor loveste celulele sanguine. Ca urmare, lumina va fi
dispersata in directii diferite.
Lumina dispersata frontal si captata de o fotodioda indica volumul celular, lumina dispersata lateral
furnizeaza informatii asupra continutului celular (nucleu si granulatii), iar lumina fluorescenta laterala
aduce informatii despre cantitatea de ADN si ARN celular. Lumina dispersata lateral si cea fluorescenta
laterala sunt receptate de un tub fotomultiplicator.
In final, analizorul va afisa doua scatergrame bidimensionale:
- pe scatergrama 4DIFF (axa x reprezinta intensitatea luminii laterale, iar axa y intensitatea fluorescentei
laterale) apar cele 5 populatii leucocitare si grupul de umbre eritrocitare;
- pe scatergrama WBC/BASO (axa x reprezinta intensitatea luminii laterale, iar axa y intensitatea luminii
frontale) apar populatia de bazofile si restul populatiei de leucocite, precum si grupul de umbre
eritrocitare.
3) SLS - Hemoglobina
Analizorul determina direct concentratia hemoglobinei cu ajutorul surfactantului Sodiu-Lauril-Sulfat
(SLS). Reactia chimica include urmatoarele etape: hemoliza eritrocitelor, alterarea conformatiei moleculei
de globina, oxidarea fierului si formarea SLS-Hb care este masurata fotometric.
Metoda nu este toxica, iar viteza de conversie a hemoglobinei este mare. Metoda se poate utiliza si pentru
masurarea methemoglobinei, deci si a sangelui de control ce contine methemoglobina.
Parametrii analizati sunt urmatorii:
a) eritrocitari:
- numarul de eritrocite;
- hemoglobina (Hb);
- hematocritul (Ht);
- indicii eritrocitari - volumul eritrocitar mediu (VEM), hemoglobina eritrocitara medie (HEM),
concentratia medie a hemoglobinei(RDW), largimea distributiei eritrocitare (RDW);
b) leucocitari:
- numarul total de leucocite
- formula leucocitara in valori relative (%) si absolute (#)
c) trombocitari:
- numarul de trombocite;
- trombocitocritul (PTC);

- volumul trombocitar mediu (VTM);

- largimea distributiei trombocitare (PDW).
Dintre acestia, analizorul masoara direct numarul de leucocite si formula leucocitara, numarul de
eritrocite, hemoglobina, hematocritul si numarul de trombocite.
In afara parametrilor hemoleucogramei si a celor doua scatergrame, analizorul mai afiseaza si doua
histograme pentru eritrocite si trombocite, ce indica numarul de celule si distributia acestora in functie de
volum.
De asemenea analizorul poate detecta celulele anormale sau imature afisand diferite mesaje de avertizare
generate de localizarea anormala a populatilor celulare pe scatergramele WBC/BASO sau 4DIFF, cum ar
fi:
I. Leucocite: Avertizari si parametrii cheie (in paranteza):
- Modificari anormale - neutropenie (neut#, neut%), neutrofilie (neut#, neut%), limfopenie (limf#, limf
%), limfocitoza (limf#, limf%), monocitoza (mono#, mono%), eozinofilie (eo#, eo%), bazofilie (ba#, ba
%), leucopenie (le#), leucocitoza (le#). Valorile limita sunt in functie de valorile normale corespunzatoare
varstei pacientului.
- Suspect - blasti?, granulocite imature?, deviere la stanga?, limfocite atipice?, precursori eritrocitari
nucleati? Sunt detectati prin citometrie in flux sub forma unor populatii aparte ce apar pe citogramele
WBC/BASO sau DIFF.
II. Eritrocite: Avertizari si parametrii cheie (in paranteza):
- Modificari anormale - dimorfism eritrocitar (histograma), anizocitoza (RDW-SD, RDW-CV),
microcitoza (VEM), macrocitoza (VEM), hipocromie (CHEM), anemie (Hb), eritrocitoza (Nr. eritrocite).
Ca metoda de detectie este folosita histograma pentru eritrocite, valorile limita fiind calculate in functie
de valorile normale corespunzatoare varstei pacientului.
- Suspect - aglutinare eitrocitara? (Nr eritrocite, CHEM, HEM), turbiditate/interferenta cu determinarea
Hb? (CHEM), deficit de Fe? (CHEM, VEM, RDW-CV), defect de Hb? (RDW-CV, VEM), fragmente
eritrocitare?
III. Trombocite: Avertizari si parametrii cheie (in paranteza):
- Modificari anormale - trombocitopenie (Nr. trombocite), trombocitoza (Nr. trombocite).
- Suspect - aglutinate trombocitare? Valorile limita este calculata in functie de valorile normale
corespunzatoare varstei pacientului.

7. Interpretarea rezultatelor unei coagulograme care cuprinde PT-AP-INR, APTT, TT, FBG.,
D-DIMERI. Variante de diagnostic. Alte teste necesare pentru diagnosticul de certitudine.
Tabel 1. Teste screening de coagulare
Testul
Numrtoarea de trombocite
Frotiu din sngele periferic
Timpul de sngerare (TS)
Timpul de protrombin (PT)
Timpul de tromboplastin parial activat (APTT)

Interpretare
Numrul de plachete
Numrul i morfologia celular
Funcia plachetar
Calea extrinsec
Calea intrinsec

Dup efectuarea testelor screening, pot s apar urmtoarele situaii:

PT i APTT normal
Deficit: VII
Cauze: hepatopatie n stadiu precoce, deficit de vitamina K, warfarin sau dicumarol.

PT i APTT
Deficit: X, II, V, I (fibrinogen)
Cauze: deficit singular sau multiplu, CID, insuficien hepatic, deficit de vitamina K.

PT normal i APTT
Deficit: XII, XI, IX, VIII
Cauze: hemofilie A sau B, boal von Willebrand, deficit singular sau multiplu, heparin, inhibitori
nespecifici ai acestor factori (substane anticoagulante n lupus).

CID: numr de trombocite , fibrinogen , PDF .

Deficit de vit. K: PT , teste specifice pentru factorii II, VII, IX, X (); administrare de vit. K i
repetarea PT dup 48h. Dac PT nu se corecteaz, diagnosticul este de hepatopatie, dac PT revine la
normal, diagnosticul este deficit de vitamina K (testul Koller).

TS, APTT, PT normale, dar pacientul prezint sngerri: probleme chirurgicale (deficit la nivelul
suturilor), pacientul este hipotermic, eroare de laborator.

8. Monitorizarea tratamentelor cu anticoagulante de tipul heparinei i/sau derivate cumarinice.

Heparina:
A. Istoric
a fost extras din ficat n 1916 de McLean
denumit heparin de Howell de la cuvntul grec hepar = ficat
Jorpes reuete s purifice heparina n 1939 astfel nct s nu mai produc reacii alergice
B. Ce sunt heparinele?
amestecuri de lanuri polizaharidice cu secvene specifice, cu lungimi i greuti moleculare diferite,
avnd efect anticoagulant
extrase din mucoasa intestinal porcin iar pentru unele preparate din mucoasa bovin
C. Structura chimic
lanuri de glucozaminglicani, constituite prin repetiia de segmente zaharidice
cuplarea a dou segmente zaharidice formeaz un dizaharid. Cuplarea acidului iduronic 2 sulfat cu
glucozamin N sulfat 6-0-sulfat formeaz un dizaharid regular.
.Cum acioneaz heparinele?
1. Efect anticoagulant
Howell a artat n 1925 c pentru a aciona, heparina are nevoie de un cofactor numit antitrombin
Heparina acioneaz asupra trombinei, formnd un complex macromolecular: Heparin - AT III Trombin
se produce o modificare conformaional la nivelul AT care determin o inhibiie rapid a trombinei i
a factorului Xa
complexul H AT III inhib o serie de ali factori ai coagulrii
II, X, XI, XII activai.
2. Efecte anticoagulante complementare ale heparinei:
inhib funcia agregant trombocitar
inhib factori V i VIII
stimuleaz secreia endoteliale de TFPI
reduce activitatea factorului VIIa (tissue factor pathway inhibitor)
3. Efecte metabolice:
heparina stimuleaz eliberarea lipoproteinlipazei din esuturi
hidrolizeaz trigliceridele plasmatice
crete nivelul plasmatic al acizilor grai liberi
4. Alte efecte:
crete permeabilitatea vascular
inhib proliferarea celulelor musculare netede vasculare
inhib formarea osteoblastelor
stimuleaz formarea osteoclastelor.
E. Cnd folosim heparine?
1. n prevenirea i tratamentul unor boli:
prevenirea TEV
tratamentul EP
tratamentul infarctului miocardic acut i al anginei instabile
chirurgia vascular
angioplastia coronarian
chirurgia cardiac
etapa hipercoagulant a CID
tratamentul perioperator al pacienilor cu afeciuni care necesit administrare de ACO.
2. Proceduri
recoltare probe biologice
anticoagulant pentru catetere venoase arteriale
laborator, anticoagulant n vitro

 by pass cardiac, circulaie extracorporal

hemodializ
De reinut !
Administrarea continu a heparinelor utiliznd seringa automat este superioar terapeutic administrrii
intermitente prin injecii.
Heparina nu produce liza trombului format ns mpiedic creterea acestuia, reduce complicaiile
secundare trombozei venoase sau emboliei i permite realizarea mai rapid a trombolizei de ctre
mecanismele fiziologice ale organismului.
F. Contraindicaii cnd nu administrm heparine?
manifestri hemoragice active
tulburri de coagulare prin hipofuncie (boli hipocoagulante)
alergie la heparine
TIH (trombocitopenie indus de heparine) (trombocite sub
50.000/mm3)
endocardite lente
HTA sever
Ulcer gastroduodenal activ
TBC activ.
Protocol de tratament heparina sodic
1. Se verific valoarea APTT nainte de nceperea tratamentului.
2. Tratamentul se ncepe cu un bolus de 5000 UI heparin sodic i.v.
3. Se ncepe administrarea i.v. a heparinei sodice n doz de 16-20 UI/kgc/h (400 UI/kgc/zi).
4. Se verific APTT la 6 ore.
5. Se urmrete ca obiectiv APTT 1,5 ori 2 ori fa de normal (50-75 s). Se ajusteaz dozele n funcie
de acest obiectiv.
6. ncepnd cu a 2-a zi se verific APTT i numrul de trombocite zilnic, n cazul APTT n limite
terapeutice.
7. n cazul ajustrii dozelor se repet APTT dup fiecare ajustare la 6 ore.
8. n cazul valorilor anormale ale APTT se urmrete nomograma Hirsch sau Cruickshank.
9. Tratamentul se continu pentru 5 zile.
10. Din ziua a 6-a se introduce anticoagulantul oral n doze de ncrcare.
11. Se continu pentru 4 zile concomitent tratamentului heparinic.
12. Se reduce doza de heparin progresiv ncepnd cu a doua zi de administrare i se ntrerupe cnd INR
ajunge la 2, timp de dou zile consecutiv.
13. Se continu cu tratamentul anticoagulant oral timp de minim 3 luni.
Se consider c ACO poate fi introdus chiar i n prima zi de tratament, cu continuarea tratamentului
heparinic pentru 3-5 zile concomitent.
Valoarea nivelului APTT necesar n cazul tratamentului concomitant heparin nefracionat +
anticoagulant oral se poate calcula astfel: (3 NR) APTT normal - APTT normal este considerat 35 s
I. Cum monitorizm heparinele?
monitorizarea este obligatorie i necesar n cazul tratamentului curativ al TEV
se utilizeaz aPTT (timpul parial de tromboplastin activat) valori normale 25-35 secunde
intervalul terapeutic optim pentru tratament anticoagulant este estimat a fi 50-75 secunde
recoltarea eantioanelor de snge se face cu 1 or naintea urmtoarei administrri n cazul
tratamentului secvenial cu heparin (injecii intermitente)
recoltarea se face oricnd n cazul utilizrii injectomatului
n general numrul de recoltri este de 4 pe zi
n cazul tratamentului profilactic nu este necesar de obicei recoltarea de snge pentru control aPTT.
G. Cum neutralizm efectul anticoagulant al heparinelor?
Protamina: protein cationic extras din lapii de pete realizeaz

legturi ionice puternice cu heparine.

1 mg heparin = 100-110 UI
neutralizarea se face: 1 mg heparin la 1 mg protamin pentru
administrare cu injecii intermitente
pentru administrare continu
mg protamin = (mg heparin/h) x 2,5
(durata medie de aciune a heparinei este de 2-3 ore) (2,5)
Reacii secundare ale protaminei:
reacii alergice sau anafilactice
hipotensiune, bradicardie eliberare histamin
Alte tipuri de heparine:
nefracionate:
o sodic
o calcic
o litiu
fracionate:
o tinzaparina: Innohep
o reviparina: Clivarin
o enoxaparina: Clexane
o nadroparina: Fraxiparina
o dalteparina: Fragmin
o parnaparina
o ardeparina
o certaparina
I. Principii de realizare a tratamentului curativ
1. Administrarea obinuit a heparinelor fracionate se face pe cale subcutanat n una sau dou
administrri/zi. Nu s-au evideniat diferene terapeutice semnificative n funcie de orarul de administrare.
2. Administrarea heparinelor fracionate se poate face i pe cale intravenoas, n acest caz fiind necesar
administrarea lor n dou doze pe zi.
3. n mod uzual nu este necesar monitorizarea de laborator. n cazul riscului hemoragic crescut
(insuficien renal, obezitate, malnutriie, deficite de coagulare), monitorizarea de laborator este necesar
(trombocite, fibrinogen, APTT, TT, ACT).
Ca regul general, tromboprofilaxia se realizeaz pn la dispariia factorilor de risc pentru care
ea a fost indicat sau pn la ncadrarea pacientului ntr-o categorie cu risc minim.
Dac afeciunea pentru care se face tromboprofilaxia sau tratamentul continu, dup 7-30 zile de
tratament heparinic se continu tratamentul cu alte metode:
ACO, anticoagulante, metode fizice
n cazul deficitelor congenitale ale factorilor de coagulare cu hiperfuncie procoagulant terapia se face
ntreaga viaa
implantul de dispozitive n scop terapeutic sau profilactic impune tratament continuu (ex. valve
cardiace, filtre endovenoase, stent-uri).
9. Diagnosticul de laborator n sindroame hemoragipare.
Date clinice
Anamneza trebuie sa sileasca date privind semne hemoragipare, modul de aparitie a lor, severitatea
tulburarilor si caracteristicile clinice:
- hemoragii cuteneo-mucoase;
- gingivoragii spontane, provocate;

- epistaxis;
- purpura petesiala sau echimotica;
- menoragii;
- hemartroze.
Anamneza trebuie sa excluda antecedentele hemoragice severe dupa interventii chirurgicale sau dupa
extractii dentare, amigdalectomii, circumcizii; antecedente terapeutice, in special tratamentul anticoagulant si antiagregant.
Modul de aparitie si localizarea hemoragiilor dau informatii asupra mecanismelor sistemelor tulburarilor
hemostazei.
Hemartrozele, hematoamele parietale profunde sau alte localizari aparute dupa traumatisme sau
interventii chirurgicale, orienteaza spre tulburari de coagulare plasmatica (hemofilia A).
Aparitia de hematoame la nivelul punctiilor ve-noase facute cu ore sau zile inainte evoca fibrino-liza.
Sangerarile difuze la nivelul campului operator presupune coagulare diseminata intravasculara si
eventualitatea unei incompatibilitati transfuzionale.
Exista unele localizari de hemoragii cu risc vital cum ar fi hemopericardul care determina tampona-da
cardiaca cu soc cardiogen, hemoragie cerebro-meningee, hematomul seului bucal care provoaca
obstructia cailor aeriene superioare.
Unele localizari pot induce erori de dagnostic:
- hematoame de perete intestinal cu semne de ocluzie;
- hematom de teaca psoasului cu simularea unei apendicite retrocecale;
- hematoame intracraniene cu simulare de boli psihiatrice;
- hematoame de sani cu simulare de tumori mamare.In fine, sindromul hemoragipar poate fi provocat si
cantonat la nivelul unui organ si face ca tulburarea de hemostaza sa se generalizeze cum este cazul
hemoragiei digestive superioare sau hema-turia provocata de o litiaza nedepistata.
Clasificarea sindroamelor hemoragipare
Vasculare
Trombocitare
Coagulopatii
Ereditare Trombocitopenii: Congenitale:
- prin consum; - hemofilia A;
- prin sechestrare; - hemofilia B;
- prin distrugere;
- prin scaderea productiei;
Dobandite Trombocitopatii:
- defecte de aderare;
- defecte de agregare;
- tulb. de eliberare.
Tulburari vasculare
Defectul vascular este suspectat cand apar sangerari ale mucoaselor si testele standard sunt normale.
Testul Hess, Rumpell-Leede este poziti Defectul vascular structural poate fi datorat proceselor
inflamatorii si imune sau tulburarii tesutului conjuncti
Sindroame vasculare: pot fi ereditare sau dobandite.
Caracteristice:
- testul Rumpell-Leede ++;
- TS crescut;
- trombocite normale;
- fragilitate vasculara;
- purpura, petesii.
Purpure vasculare ereditare

Boala Rendo-Osler (angiomatoza hemoragica familiala ereditara) manifestata prin telangiectazii ale
capilarelor si arteriolelor pielii si mucoaselor, care progreseaza cu varsta este destul de rar. Se mai citeaza
anomalii congenitale ale tesutului conjunctiv (sindrom Marfan) care comporta riscul hemoragiilor.
Telangiectazia hemoragica ereditara (b. Rendu-Osler)
- transmitere autosomal dominanta;
- dilatatii sacciforme delimitate de un strat endo-telial la nivelul capilarelor si a arteriolelor;
- situate extern, pe buze, mucoasa bucala, nazala, varful degetelor si intern, pe tract digestiv, urogenital,
plamani, meninge;
- frecvent apare epistaxis si hemoragie.
Purpure vasculare dobandite
Purpura senila - prin pierderea turgorului si elasticitatii tesutului perivascular.
Carenta de vitamina C - deficit de sinteza a substantei intercelulare endoteliale, tumefierea gingiilor,
gingivoragii, hemoragii petesiale perifolicu-lare.
Sindrom Cushing - creste meolismul proteic cu distrugerea tesutului perivascular.
Boli infectioase: septicemii, meningite, endocar-dita bacteriana.
Purpura anafilactoida Schonlein - mecanism imun (dupa infectie streptococica) vasculita a capilarelor cu
permeabilitate crescuta (triada simptomatica: purpura + HDS + artrita +/- GNA).
Sindroame trombocitare
A. Trombocitopenii:
1. prin scaderea productiei;
2. prin distrugerea excesiva;
3. prin consum;
4. prin sechestrare.
B. Trombocitopatii
1. defecte de aderare;
2. defecte de agregare;
3. tulburari de coagulare.
Trombocitopenii. Valori normale = 150 000-400 000/mm3
Cand trombocitele scad sub 30 000/mmc apar primele semne hemoragice. La valori ale trombo-citelor
sub 10 000/mmc hemoragiile sunt grave.
Semne: hemoragii cutanate, mucoase (nazala, gastrointestinala, uterina, urinara), bule cu sange in
mucoasa bucala (patognomonic).
1. Trombocitopenii prin scaderea productiei apar cand exista pancitopenie periferica idiopatica, infiltrarea
maduvei hematopoetice (tumori, leucemii, mieloscleroza-mieloftizie), leziuni medulare prin radioterapie,
toxice (alcool, medicamente), trombo-citopoieza inefectiva, anemie aplastica, carenta de vitamina B12 si
acid folie.
2. Trombocitopenii prin distrugerea excesiva: mecanismul este de obicei imun (Ac. antitrom-bocitari,
IgE). Fixarea IgE si a complementului pe trombocite determina distructie in splina si ficat. Apar cand
exista:
- Purpura trombocitopenica idiopatica (b. Wehrlhoff).
- Anemie hemolitica autoimuna. -LES.
3. Trombocitopenii prin consum apar in:
- Purpura trombotica trombocitopenica = acumulare de trombocite si fibrina subendotelial cu scaderea
duratei de viata a trombocitului. Apar trombi trombocitari diseminati. Evolutia este fulminanta. Se
asociaza cu anemie hemolitica grava, Coombs negativa.
-CID.
- Sindrom hemolitic uremie = apare la copii sub 6 ani si asociaza insuficienta renala acuta, anemie
hemolitica cu microangiopatie.
4. Trombocitopenii prin sechestrare apar prin hipersplenism si hemangioame.

Trombocitopatii
Apar in imensa majoritate sub actiunea unor droguri, antiagregante plachetare (Dipiridamol, Ticlo-pidineTiclid, aspirina) sau ca efecte secundare dupa Indometacin, Fenacetin, Dextran, Penicilina, Cefalosporine,
Clorpromazin, Imipramin, Amitripti-lina, Teofilin, Papaverina, Propranolol, Clorochin etc.
Aceste tulburari functionale ale trombocitelor se intalnesc ca epifenomen in insuficienta renala, lupus
eritematos diseminat, ciroza, disglobulinemii, sindroame mieloproliferative, boli autoimune sau
limfoproliferative.
1. Defecte de aderare. Boala von Willebrand = este provocata de deficitul proteinei von Willebrand din
compozitia factorului VIII, o proteina sintetizata din endoteliul vascular. Este transmisa ereditar,
autosomal dominant, prezenta la ambele sexe si are rol in aderarea trombocitelor. Factorul VIII are doua
subunitati glicoproteice, una are rol de aderare a trombocitelor si cealalta (factorul VIMc) este
responsabila de activitatea coagulanta (factorul antihemofilic).
Clinic se manifesta prin hemoragii mucoase, epistaxis, gingivoragii, menoragii, echimoze spontane sau
dupa o trauma minima, hemoragii peri- operatorii, hemartroze - exceptional in forme severe.
Bilogic se caracterizeaza prin TS prelungit, trombocite in limite normale, TCA prelungit cu TQ si
fibrinogen in limite normale. Dozajul imunologic al factorului VIII se practica in forme grave si cu ocazia
unor interventii chirurgicale, iar tratamentul se realizeaza prin administrare in plasma proaspata congelata
sau factor VIII concentrat. Recent s-a introdus produsul Minirin, medicament care stimuleaza productia
de factor deficitar.
Terapia anomaliilor trombocitare prin aport de masa trombocitara cu trombocite normale este indicata in
cazuri de hemoragii severe si la interventii chirurgicale.
2. Defecte de agregare. Trombastenia Glanzman - se datoreaza lipsei proteinelor llb si lila mem-branare
cu rol de receptori pentru fibrinogen, cu absenta retractiei cheagului si TS foarte crescut. Sub tratament cu
aspirina sau AINS tulburarile hemoragice sunt agravate.
3. Tulburari de eliberare. Boala de stocare = se datoreaza unui deficit de ciclooxigenaza cu blocarea
productiei de TxA2 si se asociaza cu albi-nism.
Tulburari asemanatoare - apar la medicamente ce inhiba ciclooxigenaza (aspirina, fenilbutazona).
Tratamentul este substituti in trombopeniile medicamentoase se suprima medicamentul in cauza; in
purpura trombopenica se dau corticoizi si imunosupresoare si se face plasmafereza, in trombopeniile
posttransfuzionale prin alloimunizare se face plasmafereza plus corticoterapie.
10. Standardizarea PT.
Timp Quick
Timpul Quick este un test screening pentru diagnosticul deficientelor de coagulare. Valori normale 12-15
secunde sau 80-100%.
Un timp de protrombina prelungit se intalneste in deficienta de factori II, V,VII sau X, deficienta de
vitamina K, hemoragie, afectiuni hepatice, obstructie biliara, terapie cu anticoagulante orale, absorbtie
deficitara a grasimilor. Dozarea timpului de protrombina ( timpul Quick) este o metoda de explorare a
factorilor coagularii din sistemul extrinsec ( I, II, V, VII, si X), in prezenta de tromboplastina tisulara in
exces. Determinarea timpului de protrombina se utilizeaza pentru controlul terapiei anticoagulante orale
si explorarea caii extrinseci a coagularii.
11.Metode de determinare a grupelor sanguine n sistemul ABO.
Informatii generale
Hematiile conin substane numite aglutinogene, iar plasma substane numite aglutinine, care sunt
anticorpi naturali, denumii i izoanticorpi. Dup repartiia aglutinogenelor i aglutininelor se deosebesc
patru grupe sanguine.
0 (I) - ab Toi 0
A (II) A b Ai AB Ai 0

B (III) B a B i AB B i 0
AB (IV) AB - AB Toi
Cei din grupa 0 (I) se numesc donatori universali, iar cei din grupa AB (IV) primitori universali. n afara
acestor antigene se mai cunoate i factorul Rhesus, antigen care se gsete la aproximativ 85% din
oameni. Dac nu se respect grupele sanguine, n cursul transfuziilor pot aprea accidente de hemoliz,
uneori mortale. Accidente hemolitice mai pot aprea i la nou-nscutul al crui tat este Rh-pozitiv, i
mama Rh-negativ.
Hemoliza este ns i un fenomen normal. Durata vieii unei hematii fiind de 120 de zile, n fiecare zi se
distruge aproximativ o sutime din numrul total al eritrocitelor, eliberndu-se hemoglobina. n strile
patologice, hemoliz se exagereaz. Cnd hemoliz este brutal, apar anemii acute i tubulonefrite acute;
cnd este lent, apar anemie i icter: icter hemolitic sau anemie hemolitic.
La om au fost identificate 26 sisteme de grup sanguin cu 228 antigene; un sistem de grup sanguin consta
din unul sau mai multe antigene guvernate de o singura gena sau de un complex de doua sau mai multe
gene strans legate intre ele. De asemenea au fost identificate si alte antigene care nu au fost atribuite
sistemelor stabilite. Antigenele eritrocitare pot fi proteine, glicoproteine sau glicolipide. Majoritatea sunt
sintetizate de eritrocit, totusi unele antigene, cum ar fi cele apartinand sistemului Lewis, sunt adsorbite
din plasma pe membrana eritrocitara. Unele antigene sunt specifice eritrocitelor, in timp ce altele sunt
intalnite si pe alte celule din organism. Cunoasterea grupelor sanguine este esentiala pentru terapia
transfuzionala. Astfel indivizii care nu prezinta anumite antigene eritrocitare pot produce aloanticorpi
atunci cand sunt expusi la sange care contine aceste antigene in transfuziile cu produse de sange sau in
timpul sarcinii. Anticorpii care interactioneaza cu antigenele eritrocitare produc reactii transfuzionale
hemolitice imediate sau intarziate si boala hemolitica a nou-nascutului4.
Sistemul de grup sanguin ABO reprezinta cel mai important sistem de grup sanguin deoarece: cand
antigenele nu sunt exprimate pe suprafata eritrocitelor, anticorpii corespunzatori sunt intotdeauna prezenti
in plasma, stimulii pentru productia de anticorpi fiind reprezentati de o varietate de factori de mediu, cum
ar fi bacteriile (ex.: E. coli), care exprima pe suprafata structuri aproape identice carbohidratilor ABO;
anticorpii formati reprezinta un amestec de IgM (predominant) si IgG, activi la 37C si capabili sa
activeze complementul, iar densitatea mare de situsuri antigenice de pe membrana eritrocitara permite
legarea unui numar mare de anticorpi ducand, in cazul transfuzarii de sange incompatibil in sistemul
ABO, la reactii transfuzionale hemolitice acute.
Recomandari pentru determinarea grupului sanguin ABO2
inaintea unei transfuzii;
inaintea unei proceduri invazive sau chirurgicale potential asociate cu complicatii hemoragice care ar
putea necesita transfuzii;
monitorizarea imunohematologica antepartum si postnatala a mamei si copilului;
la donatorii de sange;
pentru compatibilitatea de grup ABO in transplantul de rinichi si inima.
Pregatire pacient nu este necesara o pregatire prealabila; sunt utile informatii asupra unor tratamente
perfuzabile cu solutii macromoleculare efectuate premergator determinarii, transfuzii in ultimele 120 zile,
boli infectioase cu germeni Gram negativi cu/fara septicemie, boli maligne (carcinom, limfom, mielom)3.
Specimen recoltat - a) sange capilar din pulpa degetului; b) sange venos3.
Recipient de recoltare b) vacutainer fara aditivi sau gel activator (capac rosu sau incolor)3.
Cantitate recoltata - b) cat permite vacuumul3.

Cauze de respingere a probei - specimen puternic hemolizat3.

Stabilitate proba - testul se efectueaza imediat, daca acest lucru nu este posibil, proba se pastreaza 48 ore
la 2-8C3.
Prelucrare necesara dupa recoltare - dupa coagularea completa la temperatura camerei se indeparteaza
serul si cheagul. Din hematiile ramase se prepara o suspensie 10% in plasma proprie sau in ser
fiziologic1;3. Pentru metoda de aglutinare pe carduri se prepara o suspensie de 5% hematii in mediu
special de suspensie.
Metoda de determinare se efectueaza metoda directa/globulara (Beth-Vincent) de determinare a
grupului sanguin ABO utilizand seruri anti-A, anti-B si anti-AB, cu urmatoarele variante:
- hemaglutinare pe placa3. Se utilizeaza doi martori: martor AB (hematiile pacientului cu ser AB) si
martor auto (hematiile si serul propriu)1.
- aglutinare si gel-filtrare pe carduri cu microtuburi ce contin un gel impregnat cu reactivul specific
antigenului eritrocitar de determinat (anticorpi monoclonali murini sau umani) test direct de grupaj
ABO si de determinare a Ag RH1( D) si a Ag RH 1,2,3 ( DCE)3.
La fiecare rulare a probelor se utilizeaz un sange de control de grup si Rh cunoscute3.
Limite si interferente.
Rezultatul determinarii grupului de sange trebuie citit de doua persoane si trebuie eventual confirmat pe
o a doua proba de sange2.
Pentru metoda de aglutinare pe carduri o reactie pozitiva se valideaza numai daca microtubul de control
este negativ. Reactia pozitiva se apreciaza in functie de dispersia aglutinatelor in microtub de la + la +++
+.
Erori de citire datorate greselilor de tehnica:
- sticlarie murdara; contaminare bacteriana;
- prezenta de microcheaguri (falsa aglutinare);
- nu se respecta: proportiile hematii/ser, ordinea de picurare a serurilor hemotest (aglutinari
contradictorii), timpul de citire citire tardiva: margini uscate (falsa aglutinare), citire precoce (lipsa
aglutinarii sau aglutinare slaba).
Erori datorate hematiilor
False aglutinari
a) Prezenta rulourilor (pseudoaglutinarea): utilizarea de solutii macromoleculare (Dextran, HES),
tulburari de coagulare, probe de sange incomplet coagulate, hiperfibrinogenemia, produsi de degradare a
fibrinei, agenti fibrinolitici, disproteinemia, paraproteinemia, crioglobulinemia, cresterea reactantilor de
faza acuta, medicamente (doze mari de heparina, sulfat de protamina), factori reumatoizi, cresterea
colesterolului, bilirubinei, leucocitoza, enzime leucocitare2. Martorul AB este pozitiv; spalarea hematiilor
permite efectuarea corecta a probei globulare1.
b) Autoaglutinarea
Prezenta de aglutinine la rece (martorul auto este pozitiv). Proba de sange si reactivii se preincubeaza la
37C, iar testarea se efectueaza la cald2.
Hematii acoperite de aloanticorpi: nou-nascut din sarcina incompatibila (in sistemul Rh, ABO),

pacient transfuzat cu sange incompatibil.

Determinarea grupului sanguin pe sange recoltat din cordonul ombilical: gelatina Wharton, substanta
macromoleculara care inconjoara eritrocitele, da aspect de pseudoaglutinate. Pentru indepartarea ei este
necesara spalarea hematiilor de cel putin 6 ori inaintea determinarii1.
Prezenta complexelor imune medicamentoase.
c) Poliaglutinarea
In septicemiile cu bacilli Gram negativi sunt expuse criptoantigene (T), prin actiunea enzimatica a
agentilor bacteireni, recunoscute de anticorpi (anti-T) prezenti in majoritatea serurilor umane2. Martorul
AB este pozitiv1.
Aglutinari absente sau slabe sau aspect de dubla populatie: aglutinarea nu este totala, cu prezenta de
hematii libere (aglutinatele apar pe un fond roz)1;2:
sange vechi;
antigene slabe: nou-nascuti, prematuri;
subgrupe A sau B slabe;
atenuarea antigelor (in leucemii, limfoame, boala Hodgkin);
pacient cu grup A sau B transfuzat cu sange grup O, hemoragie materno-fetala;
prezenta in cantitate mare de substanta A sau B in plasma (cancer de stomac, pancreas) care
neutralizeaza anticorpii test (hematiile trebuie spalate pentru indepartarea acestora);
prezenta unei chimere sau mozaic (exceptional, ex.: post-alotransplant medular).
12.Metode de determinare a grupelor sanguine n sistemul Rh.
Antigen D (antigenul Rh ): daca se afla pe suprafata hematiilor unei persoane, atunci aceea persoana are
Rh (+); absenta lui de pe hematiile unei persoane insemna ca persoana respectiva are Rh (-) .
Anticorp anti Rh de tip Ig M: se formeaza la primul contact cu antigenul Rh si fiind molecule mari nu
pot traversa placenta
Anticorpi anti Rh de tip IgG: sunt molecule mici care pot traversa placenta si care inlocuiesc in timp
functia anticorpilor de tip IgM
Izoimunizarea: apare atunci cand hematiile fetale Rh (+) au intrat in circulatia materna si s-au format
anticorpi anti Rh.
Conditiile de aparitie a incompatibilitatii in sistemul Rh:
Rh-ul este transmis pe linie paterna, deci fatul va avea Rh-ul tatalui. Problemele pot aparea in conditiile in
care mama are Rh negativ (-) iar tatal are Rh-ul pozitiv (+), deci implicit avem o mama cu Rh (-) ce
poarta un fat cu Rh (+). Nu apare incompatibilitatea in sistemul Rh in urmatoarele situatii :

Cum apare incompatibilitatea in sistemul Rh?

In timpul sarcinii exista doua sisteme circulatorii distincte: cel matern si cel fetal, astfel incat hematiile
din sangele fetal nu vor intra in sistemul circulator al mamei. Trebuie remintit ca sangele fetal este
purtator de antigen D ( antigen Rh ), pe cand in circulatia materna antigenul Rh este absent. In cazul in
care hematiile purtatoare de antigen D intra in circulatia materna (in cazul chiuretajelor uterine dezlipirea
de placenta, sarcina ectopica, hematom decidual , avorturi spontane, etc), sistemul imun matern nu va

recunoaste antigenul D si va reactiona prin formarea de anticorpi anti Rh, care initial vor fi de tip IgM,
apoi de tip IgG. Anticorpii anti Rh de tip IgM se formeaza la primul contact cu antigenul D si au o
greutate moleculara mare, deci nu vor trece de bariera placentara. In schimb, anticorpii anti Rh de tip Ig G
( care se vor forma la urmatoarele contacte cu antigenul D ) au o greutate moleculara mica, deci vor putea
trece de bariera placentara.

TESTUL CUMBS
-direct identifica anticorpii antieritrocitari fixati pe eritrocite.
-indirect identifica anticorpii antieritrocitari liberi din ser care reactioneaza impotriva eritrocitelor.
Test Coombs direct
Sinonime test antiglobulinic direct.
Informatii generale Demonstrarea prezentei de imunoglobuline sau a complementului pe suprafata
hematiilor sustine diagnosticul de distructie eritrocitara mediata imun6.
Exista doua clase majore de anticorpi care reactioneaza cu eritrocitele. Anticorpii completi sau salini
aglutineaza eritrocitele suspendate in solutie salina; acestia sunt de obicei de tip IgM (cel mai bun
exemplu de aglutinare salina la temperatura camerei este cea utilizata in grupajul ABO). In vivo anticorpii
IgM fixeaza complementul si produc hemoliza imediata intravasculara. Anticorpii care nu reactioneaza
vizibil in mediu salin si produc reactii de aglutinare numai prin utilizarea de tehnici speciale sunt numiti
aglutinine incomplete si sunt de obicei de tip IgG (cel mai bun exemplu sunt anticorpii anti-Rh, care, daca
sunt prezenti in serul primitorului de sange incompatibil, produc o reactie hemolitica transfuzionala
intarziata, extravasculara)3.
Pentru a certifica faptul ca hematiile unui pacient sunt invelite (sensibilizate) cu imunoglobuline,
complement sau ambele, se adauga la o suspensie de eritrocite provenite de la pacient antiser cu
reactivitate fata de moleculele de Ig si/sau complement umane, care va determina aglutinarea acestora.

Initial testarea se face su antiseruri polispecifice, care contin anti-IgG, anti-C3d si ocazional si activitate
anti-lant usor. Reactivii monospecifici diferentiaza in continuare intre IgG, C3d, existand si seruri
monospecifice pentru C3b, C4b, C4d si lantul greu al IgG. Antiseruri specifice pentru IgM sau IgA sunt
rar utilizate, deoarece IgM nu mai sunt gasite de obicei inca atasate pe suprafata celulara, iar IgA sunt
foarte rar intalnite pe suprafata eritrocitelor6.
Utilizand sange recoltat pe EDTA sau pe citrat activarea in vitro a complementului de catre autoanticorpii
la rece benigni este inhibata. Spalarea eritrocitelor indeparteaza globulinele solubile sau atasate
nespecific, ceea ce permite detectia imunoglobulinelor si factorilor complementului specific legate de
eritrocite in vivo4.
Recomandari pentru efectuarea testului Coombs direct
investigarea reactiilor transfuzionale acute sau intarziate (demonstrarea fixarii pe suprafata eritrocitelor
de la donator a aloanticorpilor prezenti in serul pacientului);
suspiciune de hemoliza autoimuna;
boala hemolitica a nou-nascutului;
hemoliza imuna indusa de medicamente;
atunci cand martorul auto efectuat in cadrul grupajului sanguin, screening-ului prezentei de aloanticorpi
si testelor de compatibilitate este pozitiv4.
Pregatire pacient - nu este necesara o pregatire prealabila5.
Specimen recoltat - sange venos5.
Recipient de recoltare vacutainer cu K3-EDTA5.
Cantitate recoltata - cat permite vacuumul5.
Cauze de respingere a probei - specimen coagulat5.
Stabilitate proba - testul se efectueaza imediat, daca acest lucru nu este posibil, proba se pastreaza 48 ore
la 2-8C5.
Prelucrare necesara dupa recoltare - o parte din eritrocite se spala de trei-patru ori cu solutie salina
normala, urmata de prepararea unei suspensii eritrocitare in ser fiziologic steril 5%1;5.
Metoda de determinare hemaglutinare pe lama5.
In laboratoarele Synevo se utilizeaza urmatoarele metode:
-hemaglutinare pe lama cu antiglobulina umana polispecifica
-aglutinare si gel-filtrare pe carduri cu microtuburi ce contin reactivi monospecifici anti-IgG si anti-C3d.
Valori de referinta negativ.
Interpretarea rezultatelor
In cazul metodei de hemaglutinare pe lama rezultatul se raporteaza negativ/pozitiv in functia de
absenta/prezenta aglutinatelor eritrocitare.
Pentru metoda de aglutinare pe carduri o reactie pozitiva se valideaza numai daca microtubul de control
este negativ. Reactia pozitiva se apreciaza in functie de dispersia aglutinatelor in microtub de la + la +++
+, astfel : rezultat pozitiv ( ++++) ; rezultat slab pozitiv ( + pana la +++ ) ; rezultat negativ ( ). De
asemenea, in cazul unui rezultat pozitiv se va raporta specificitatea anti-IgG si/sau anti-C3d.

Test Coombs direct pozitiv se asociaza cu urmatoarele entitati2;3;4;6:

Afectiune

Tipul Ac

Boala aglutininelor la rece primara

AutoAc tip IgM, de obicei
(idiopatica) sau secundara (asociata cu
monoclonali (rar IgG sau IgA),
macroglobulinemie Waldenstrm si alte boli cu specificitate anti-I/i, rar Pr
limfoproliferative, mononucleoza infectioasa,
infectii cu Mycoplasma pneumoniae etc.)

Specificitatea TCD
C3 (IgM disociaza
de pe eritrocite si nu
sunt detectabile)

Hemoglobinuria paroxistica la rece

AutoAc tip IgG policlonali, cu C3 (IgG disociaza
acuta/tranzitorie (asociata cu boli infectioase) specificitate anti-P (Ac Donath- de pe eritrocite la
si cronica, idiopatica sau asociata cu sifilisul Landsteiner)
cald)
tardiv sau congenital
Anemia hemolitica imuna cu autoanticorpi la IgG1, mai rar IgG3, ocazional in IgG si/sau C3
cald idiopatica sau secundara (asociata cu boli asociere cu IgA sau IgM, de tip
autoimune, boli limfoproliferative, infectii,
panaglutinine
tumori, sarcina, deficiente imune congenitale
sau dobandite)
Anemia hemolitica cu autoanticorpi la cald si Ig M si IgG
rece

IgG+C3

Anemia hemolitica imuna indusa

medicamentos (penicilina in doze mari,
cefalosporine, quinidina, -metildopa etc.)

Ac tip IgG cu specificitate

diferita in functie de tipul de
medicament

IgG sau C3,

ocazional IgG+C3

Boala hemolitica a nou-nascutului

AloAc tip IgG, cu specificitate

diferita in functie de tipul
incompatibilitatii materno-fetale:
anti-D, anti-c, anti-K1, anti-Fya
etc.

Reactii transfuzionale imediate

AloAc IgM, mai rar IgG, de

obicei anti-A sau anti-B, mai rar
anti-Jka, anti-K, anti-Fya

Reactii transfuzionale intarziate

AloAc IgG anti-D etc.

Limite si interferente

 spalarea inadecvata a celulelor si concentratia mare de imunoglobuline in serul pacientului influenteaza

testul.
In cazul obtinerii unui rezultat pozitiv trebuie luate in considerare urmatoarele posibilitati:
profilaxie antepartum la mama cu imunoglobuline anti-D;
prezenta de autoanticorpi la cald benigni, fara actiune hemolitica;
modificari ale membranei eritrocitare induse de medicamente (ex.: cefalosporine) cu adsorbtia
nespecifica de proteine;
adsorbtia nespecifica de globuline asociata cu hipergamaglobulinemia sau paraproteinemia;
activarea in vitro a complementului de catre autoanticorpi la rece benigni (ca de exemplu in sangele
coagulat dupa racire);
poliaglutinare, daca sunt expuse criptoantigene (T), iar reactivul este contaminat cu anti-T.