Numărarea eritrocitelor

Determinarea numărului de eritrocite, leucocite şi trombocite din sânge în hemocitometru se

bazează pe numărători efectuate pe un eşantion considerat omogen şi pe generalizarea
rezultatelor la întreaga masă sanguină din organism. Executarea unor numărători în condiţii
optime obligă la efectuarea unor diluţii mari din cauza concentraţiilor mari în care se găsesc
celulele în sânge.
Principiul metodei. Sângele, diluat în pipete speciale cu ajutorul unor lichide de
diluţie, este introdus apoi în hemocitometru într-un volum bine determinat, unde celulele sunt
distribuite uniform şi numărate pe o reţea anumită.
Materiale necesare:
-Materiale necesare pentru recoltarea sângelui capilar sau venos.
-Pipeta Potain pentru eritrocite formată dintr-un tub capilar gradat care prezintă două
notaţii, 0,5 şi 1 şi se continuă cu o porţiune dilatată , bula de diluţie, în care se află o mică
perlă, mobilă , roşie. Deasupra bulei de diluţie se află notaţia 101. Dacă sângele este aspirat în
tubul capilar până la diviziunea 0,5 sau 1 şi apoi completat cu lichidul de diluţie până la
notaţia 101, se obţine o diluţie a sângelui de 1/200 sau respectiv 1/100.. Capacitatea totală a
pipetei este de 101 volume iar diluţia este de 1/100 şi 1/200, datorită faptului că un volum de
diluant rămâne în tubul capilar şi nu diluează sângele Partea de sus a pipetei se adaptează unui
tub de cauciuc, care permite o aspiraţie uniformă..După utilizare pipetele se spală cu apă, apoi
cu alcool şi eter, se usucă şi se sterilizează la căldură uscată. Pipeta pentru numărarea
eritrocitelor poate determina erori în rezultatele metodei din cauza cantităţii mici de sânge
folosit pentru diluţie.
 -Lichidul de diluţie trebuie:
- să menţină integritatea, conservând celulele care urmează a fi numărate şi să lizeze celelalte
tipuri de celule;
-să dilueze sângele, împiedicând în acelaşi timp coagularea şi simpexa hematiilor;
- să fie izotonic, pentru a nu determina hemoliza sau ratatinarea eritreocitelor şi Lichidul de
diluţie folosit pentru numărarea hematiilor este soluţia Hayem constituită din:
 Clorură de sodiu..............1g
Sulfat de sodiu................5g
Sublimat.........................0,5g
Apă distilată.....................200ml.
După preparare soluţia se filtrează şi se păstrează la frigider nu mai mult de trei zile.
- Camera de numărat sau hemocitometrul este constituită dintr-o lamă groasă de sticlă
pe care a fost gravată o reţea cu dimensiuni cunoscute. Orice cameră de numărat are gravate
pe ea următoarele date: înălţimea camerei de numărat care este de 0,100 mm( 1/10 mm) şi
respectiv două cifre, 1/400 şi 1/25 sau 1/400 şi 1/16, cifra care variază după tipul camerei şi
indică a câta parte dintr-un mm² sunt pătrăţelele mici care nu au subdiviziuni. Există mai
multe tipuri de camere de numărat:
Camera Thoma, cu suprafaţa totală de 1mm² divizată prin linii duble în 400 de
pătrăţele cu suprafată de 1/400 mm². Linii triple grupează câte 16 pătrăţele de suprafaţă 1/400
mm².
Camera Burker are suprafaţa totală de 9mm² împărţită prin linii triple în nouă pătrate
cu suprafaţa de 1mm² iar acestea sunt împăţite prin linii duble în 16 pătrate cu suprafaţa de
1/25 mm² folosite pentru numărarea lecocitelor. La întretăierea liniilor duble se delimitează
pătrate cu suprafaţa de 1/400 mm².
Camera Burker-Turk are suprafaţa reţelei de 9 mm² împărţită prin linii triple în nouă
pătrate cu suprafaţa de 1 mm² Pătratul din mijloc este de tip Thoma, fiind împărţit în 400 de
pătrăţele mici cu suprafaţa 1/400 mm², grupate câte 16, în pătrate delimitate prin linii
triple.Pătratul din mijloc foloseşte numărării hematiilor.Pătratele din colţurile reţelei sunt de
tip Burker fiind împărţite prin linii duble în 16 pătrate cu suprafaţa de 1/25 mm².Aceste
suprafeţe se folosesc pentru numărarea leucocitelor.
Camera Goreaev are un cadrilaj în care alternează pătrătelele mici de 1/400 dintr-un
mm², în grupuri de câte 16, cu pătrate de câte 1/25 mm² pentru numărarea hematiilor.
Delimitarea camerei de numărat se realizează cu ajutorul unei lamele perfect plană şi
şlefuită ,cu o grosime de aproximativ 0,3-0,5mm. Prin aplicarea lamelei, între suprafaţa pe
care se află gravată reţeaua şi suprafaţa lamelei se delimitează un spaţiu cu înălţimea de 1/10
mm.
-
Microscopul optic se foloseşte utilizând obiectiv uscat, 20x sau 40x , ocular 10 sau 7şi
iluminare slabă.

Tehnica de lucru implică următoarele etape:

1. Pregătirea camerei de numărat constă în degresarea camerei şi în aplicarea lamelei
după umezirea uşoară a marginilor acesteia astfel încăt să se realizeze un contact intim
între lama groasă şi lamelă, demonstrat prin apariţia inelelor Newton. O bună aderenţă
a lamei şi a lamelei este foarte importantă pentru realizarea unui volum constant al
camerei de numărat.
2. Din sângele recoltat se aspiră în pipeta Potain până la diviziunea 0,5 sau 1 citirea
făcându-se cu pipeta în poziţie verticală. Dacă sângele depăşeşte uşor diviziunea, prin
atingerea vârfului pipetei cu o hârtie de filtru coloana de sânge se poate potrivi exact
până la diviziunea dorită.
3. Se şterge sângele de pe pereţii exteriori ai pipetei şi se introduce pipeta în flaconul cu
lichid de diluţie. Se aspiră lichidul până la diviziunea 101. Pipeta se aşează în poziţie
orizontală şi se cuprinde între degetul mare şi cel mijlociu, apoi se agită viguros pentru
omogenizare. Până la numărătoare pipeta rămâne în poziţie orizontală.
4. Umplerea camerei de numărat se face după agitarea pipetei timp de 2-3 minute şi
îndepărtarea primelor picături din pipetă.Vârful pipetei se apropie de marginea lamelei
aplicată pe camera de numărat şi se lasă să intre prin capilaritate o cantitate de lichid
asfel încât reţeaua să fie acoperită în întrgime fără să intre bule de aer sub lamelă şi
fără ca lichidul să trecă în şanţurile laterale sau lamela să se deplaseze. Dacă toate
aceste condiţii nu sunt respectate operaţia se repetă după ştergerea camerei.
5. Numărarea hematiilor se realizează după câteva minute pentru sedimentarea
elementelor pe cadrilaj. Se examinează camera la microscop şi se numără elementele
ce se găsesc pe cadrilaj în pătrăţelele cu suprafaţa de 1/400 mm². Se numără de
exemplu hematiile de pe 5 grupări de 16 pătrăţele mici cu suprafaţa de 1/400 mm²,
cele din interiorul pătrăţelelor şi cele de pe două margini, mereu aceleaşi, de exemplu
stânga şi sus. pentru a evita dubla numărare a elementelor.
6. Calcul: pentru a stabili numărul elementelor de pe 1 mm² se înmulţeşte numărul
elementelor de pe 80 de pătrate mici de suprafaţă 1/400 mm² cu 5 ( 5 x 80 = 400 )
Numărul de hematii dintr-un mm³se calculează înmulţind cifra obţinută cu 10 pentru a
corecta înălţimea camerei (1/10mm) şi cu 200 pentru a corecta diluţia (1/200) dacă
 sângele a fost aspirat în pipetă până la diviziunea 0,5. Dacă diluţia a fost 1/100 se
înmulţeşte cu 100.

Valori normale ale numărului de hematii la diverse vârste:

vârsta Milioane/ mm³
Nou născut 5,4 +/- 1,0
6 luni 4,6
1 an 4,5
4 ani 4,6 +/- 0,6
6 ani 4,6
10 ani 4,8
16 ani 4,8
Adulţi B 4,9 +/- 0.7
Adulţi F 4,3 +/- 0,6

Erori în numărarea eritrocitelor pot fi erori de recoltare, de pipetare şi diluare, datorate

examinatorului, aparaturii şi erori inerente metodei.