Subiecte Micro

MICROBIOLOGIE
- subiecte -
An II
Semestrul 2
stud. Laura Stănescu

1. GENUL STAPHYLOCOCCUS
CARACTERE GENERALE – coci Gram +, aerobi, facultativ anaerobi, imobili, nesporulați,
catalază +
1. Specii principale: S. Aureus (pigment auriu), S. Epidermidis (pigment alb), S. Saprophiticus
(pigment citrin)
2. Habitat
- S. aureus – ln tegumentelor și mucoaselor
- aprox. 20% din persoanele sanatoase sunt purtătoare în mod permanent de S. aureus, iar în
circa 60% din cazuri e discutată situația portajului temporar
- Stafilococii coagulazo-negativi (SCN) formeaza microcolonii ln foliculilor piloși și ln gl. sebacee
- S. epidermidis – în vestibulul nazal
- au tropism special pentru derm => implicați în infecții însoțite de puroi ln tegumentelor și
anexelor pielii, dar pot fi implicați și în infecții localizate ln oricărui alt țesut sau organ
3. Morfologie
- coci gram+, cu ø de 0,6-1,5 μm
- pe frotiurile din culturi pe medii solide – dispuși în grămezi neregulate
- pe frotiurile din culturi pe medii lichide sau din produse patologice – dispuși în lanțuri scurte,
perechi sau coci izolați
- în culturile mai vechi de 2 zile, pot aparea gram-variabili sau chiar gram-negativi la limită
4. Caractere de cultură
- se dezvoltă pe medii de cultură obișnuite, în 18-24h, la 35˚C
- colonii de tip S, cu ø= 1-3 mm, pigmentate (pigmentarea devine mai pronunțată după
menținerea plăcii încă 24-48h la temperatura camerei)
- pe geloză-sânge – poate apare în jurul coloniilor o zonă de hemoliză clară (β hemoliză)
- S. aureus poate produce mai multe tipuri de hemolizine
- se pot multiplica pe medii hiperclorulate (7-10% NaCl, ex. Mediu Chapman)
5. Caractere biochimice
- au metabolism glucidic respirator și fermentativ: fermentează glucoza, mnitolul, xiloza,
lactoza, zaharoza etc. cu producere de acid
- S. aureus – catalază-pozitiv, manită-pozitiv
- sunt relativi rezistenți la agenții din mediul extern; în culturi (bulion, geloză), rezistă la
temperatura frigiderului câteva luni, în puroi uscat pot supraviețuii 2-3 luni
- rezistă peste 30 min la alcool 70˚ și peste 10 min în sol. fenol 2%
- sunt distruși în 60 de min la 60˚C
6. Constituție chimică și structură antigenică

A) Structuri Ag legate de corpul celular
a) Capsula (alcătuită din ac. glucozaminuronic)
- prezentă la un nr mic de tulpini de S. aureus (tulpina încapsulată prototip dă naștere spontan
la variante necapsulate)
- vrecventă in vivo
b) Polizaharid A – identificat la S. aureus
Polizaharid B – la S. epidermidis
c) Proteina A – componentă de suprafață la toate tulpinile de S. aureus
- este imunogenă – interacționează nespecific cu portiunea Fc a imunoglobulinelor de la toate
mamiferele => apare o serie de efecte biologice: anafilaxie locală și sistemică la animale, reacții
2
urticariene la om, activarea complementului pe calea clasică și alternativă, generarea de factori
chemotactici etc.
d) Factor de agregare – coagulază legată de ln suprafeței bacteriene
- majoritatea tulpinilor necapsulate de S. aureus agregă atunci când sunt suspensionate în
plasmă sau soluții de fibrinogen
e) Adezine – proteine de suprafață, prin care stafilococii se fixează pe proteinele matriceale de
la suprafața celulelor gazdei (laminină, colagen, elastină etc)
B) Structuri Ag extracelulare produse de stafilococi

a) Exoproteine imunogene – produse mai ales de S. aureus
- în condiții optime, sunt sintetizate la sfârșitul perioadei de creștere exponențială sau la
începutul fazei staționare
- în condiții suboptime (ex: deficit de Mg) – sintetizate în tot cursul fazei exponențiale
b) Coagulaze – filtratele culturilor de S. aureus coagulează plasma sub acțiunea coagulazei (cel
mai important marker pentru S. aureus)
- exista mai multe coagulaze antigenic distincte
- exista și tulpini de S. aureus coagulazo-negative care sunt implicate patogenic
- coagularea necesită prezența unui factor coagulazo-reactant (FCR), formând cu acesta un
complex ce convertește fibrinogenul în fibrină => cheag mai friabi ce nu se retractă
c) Hidrolaze – stafilokinaza (lizează cheagul), nucleaza (termonucleaza – activitate endo- și
exonucleazică asupra ADN și ARN, generând 3’-nucleotide), lipaze (evidențiate prin opacifierea
agarului cu gălbenuș de ou, contribuie la supraviețuirea stafilococului ln dermic), hialuronidaza,
ureaza, proteaze (serin protează, cistein protează, metaloprotează)
d) Hemolizine (4) – o tulpină poate produce mai multe hemolizine
1. α-hemolizina (a-toxina) - principala hemolizină produsă de S. aureus
-are activitate maximă asupra hematiilor de iepure (cele de om nu sunt susceptibile)
- afectează trombocitele şi celulele umane în cultură
- are efect dermonecrotic asupra animalul de experienţă (injectată local) şi efect letal
(injectată intravenos)
- efectul principal: producerea de spasme ale muşchilor netezi vasculari
2. β-hemolizina - produsă de majoritatea stafilococilor identificaţi la animale, dar nu-
mai de 10-20% dintre stafilococii umani
- hemoliză de tip „cald-rece
- efectul (în ordine descrescătoare) se exercită asupra hematiilor de oaie, om, cobai
(ceea ce corespunde cu concentraţia de sfingomielină a hematiilor)
- este citotoxică pentru diferite culturi de celule. În doze mari, este toxică pentru ani-
malele de experienţă.
3. γ-hemolizina - complex de două proteine bazice care acţionează în cooperare
- hematiile susceptibile sunt cele de iepure, om, oaie (nu şi cele de cal sau pasăre)
- efect inhibat de agar şi de diferiţi polimeri sulfataţi
- NU are efect atunci când se utilizează plăci cu agar-sânge
- acţiune inhibată de colesterol şi de alte lipide
4. δ-hemolizina - produsă de majoritatea tulpinilor umane de S. aureus
- acţionează pe diferite celule (hematii, leucocite, celule de mamifere cultivate) şi nu
are specificitate de specie
e) Exotoxine piretogene – grup de toxine cu mai multe activități patogene (efecte imunosupre-
soare, efect mitogen pronunțat ln LT supresoare)
- cresc toxicitatea endotoxinelor germenilor gram-negativi
- produc eritrodermie prin mecanisme de hipersensibilitate de tip întârziat
- efect piretogen: stimularea producerii de IL-2
- circa 50% din tulpiile de S. aureus produc una sau ++ enterotoxine
3
f) Leucocidina – produsă de majoritatea tulpinilor de S. aureus
- acționează asupra PMN și macrofagelor de om și iepure
g) Exfoliatina (toxina epidermolitică) – produce o varietate de leziuni dermatologice
- proteină termolabilă și acid-labilă, produsa de circa 5% din tulpinile de S. aureus
-acţionează prin clivarea stratului granular al epidermului, probabil prin scindarea
desmosomilor care unesc celulele acestui strat
C) Bacteriocine
- S. epidermidis produce epidermina (stafilococina 1580) și Pep5 (lantibiotice)
- lantibioticele au efecte în special asupra bacteriilor Gram-pozitive, chiar şi asupra unor tulpini de
stafilococi din altă specie decât cea producătoare
RĂSPUNS IMUN
- imunitatea postinfecţioasă este specifică faţă de produşii extracelulari (toxine, enzime) şi faţă
de antigenele legate de corpii bacterieni
- titrul anticorpilor antistafilococici este scăzut (creşte, eventual, în cursul unor infecţii
generalizate, dar nu influenţează evoluţia spre vindecare) şi nu are utilitate practică în diagnostic
- S. aureus are posibilitea de a îşi modifica fenotipul, prezentându-se sub forma de SCV (small
colony variants), pentru a scăpa sistemului imun şi pentru a genera o infecţie cronică; tehnici de
persistenţă: modificarea expresiei factorilor de virulenţă, auxotrofismul (inabilitatea unui
microorganism de a sintetiza un compus organic necesar procesului de creştere)
FACTORI DE PATOGENITATE ȘI PRINCIPALELE AFECȚIUNI PRODUSE

- S. aureus + o parte din SCN – condiționat patogeni
- S. aureus apare mai frecvent implicat în producerea unor infecţii, de obicei la nivelul
tegumentelor şi mucoaselor, însoţite de formarea de puroi, dar cu potenţial de generalizare.
Tulpinile de S. aureus au capacitatea de a adera la mucoase, epitelii, endotelii (datorită
prezenţei acidului lipoteichoic, proteinei A şi altor adezine). După aderare şi multiplicare, în
cursul infecţiilor pot fi produse o serie de substanţe cu rol în patogenitate.
- stafilococii reprezintă unele dintre primele microorganisme pentru care s-a descris
fenomenul apariţiei rezistenţei la antibiotice (rezistenţa la penicilină - mediată de o β-
lactamază)
- pe măsura utilizării în infecţiile stafilococice a unor diferite antibiotice (inclusiv a
„penicilinelor penicinilazo-rezistente“), s-au selectat tulpini rezistente la meticilină,
oxacilină, tetraciclină, cloramfenicol, macrolide, aminoglicozide etc.
- până în anul 1996, vancomicina reprezenta tratamentul de elecţie al infecţiilor cu S. aureus
rezistent la alte antibiotice şi chimioterapice. Au fost raportate tulpini stafilococice
intermediare sau rezistente la vancomicină și au fost descrise trei variante de S. aureus,
respectiv:
• S. aureus cu un nivel intermediar de rezistenţă la vancomicină (VISA),
• S. aureus cu hetero-rezistenţă la vancomicină (hVISA)
• S. aureus rezistent la vancomicină (VRSA).
- opţiunile de tratament în infecţiile cu VRSA sunt limitate; streptograminele pot fi utilizate
în tratamentul VRSA (quinupristin/dalfopristin, pristinamicina, virginiamicina, etamycin)
- a fost identificată rezistenţă şi la streptogramine, existând totuşi posibilitatea tratării S.
aureus rezistent la streptogramina B cu lincosamide
- stafilococii pot deveni patogeni şi se pot manifesta ca atare fie prin multiplicare şi
invazivitate, fie prin multiplicare şi toxinogeneză (fiind posibilă şi îmbinarea acestor
mecanisme)
- S. aureus este implicat ca agent etiologic într-o mare varietate de infecţii supurative (cu
puroi), începând cu infecţiile superficiale ale tegumentelor şi mucoaselor şi continuând cu
panariţii, furuncule, abcese profunde, infecţii ale diferitelor organe interne cu sau fără
4
generalizarea infecţiei. Pe de altă parte, ar fi de menţionat toxinozele (datorate în special
toxinelor elaborate) şi anume toxiinfecţiile alimentare, necroliza toxică a epidermului,
sindromul de şoc toxic etc.
- Toxiinfecţiile alimentare sunt provocate de exotoxinele preformate, existente în alimente în
care s-au multiplicat stafilococi enterotoxigeni. Simptomele principale sunt reprezentate de
greţuri, crampe abdominale, vărsături, diaree care apar la 1-4 (1-6) ore după ingestia
alimentelor contaminate. Se vindecă în general în circa 24 de ore. Alimentele sunt
contaminate în general de către cei care le manipulează (de exemplu bucătarul prezintă un
panariţiu). Alimentele mai frecvent incriminate sunt cremele, brânza, îngheţata, carnea şi
produsele din carne (acestea pot constitui adevărate medii de cultură pentru bacterii).
Enterotoxinele stafilococice sunt termostabile (rezistă 30 minute la 100°C), ceea ce impune
păstrarea alimentelor la frigider, atât înainte cât şi după preparare.
- dermatitele exfoliative - dermatita exfoliativă generalizată (boala Ritter - poate apărea la nou
născut); epidermonecroza toxică (la copii şi la adulţi); impetigo bulos şi „scarlatina
stafilococică” (spre deosebire de cea streptococică, nu afectează limba şi palatul); leziunile
apărute sunt extinse, dar este posibilă vindecarea fără cicatrici deoarece sediul leziunilor este
în stratul granular al pielii
- sindromul de şoc toxic - complex de simptome provocat ca urmare a unor infecţii locale cu
S. aureus producător de TSST-1 (toxina 1 a şocului toxic); principalele semne şi simptome:
stăre de şoc, febră mare, greţuri, vărsături, diaree, trombocitopenie, insuficienţă renală şi
hepatică acută, rash (erupţie) scarlatiniform urmat de descuamare (mai ales a palmelor şi
plantelor)
- SCN sunt implicaţi în infecţii apărute după manevre medico-chirurgicale care penetrează
bariera cutaneo-mucoasă (cateterisme, implante, protezări intravasculare etc)
- infecţiile tractului urinar şi genital cu S. saprophyticus (la femeile tinere)
- o infecţie gravă produsă de SCN este enterocolita postantibiotice a nou născutului (mai ales
a prematurului, situaţie în care administrarea necontrolată / abuzivă a antibioticelor poate
produce disbacteriemii cu consecinţe grave); în etiologia enterocolitei postantibiotice sunt
recunoscute mai multe specii de stafilococi, S. aureus ocupând primul loc
DIAGNOSTIC DE LABORATOR
- reprezentative sunt infecţiile purulente ale tegumentelor şi mucoaselor şi ne vom referi
numai la Staphylococcus aureus.
Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, cu următoarele etape:
1. Recoltare şi transport
- reguli generale (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice,
cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de
asepsie şi antisepsie etc)
- în funcţie de maladia provocată se pot recolta următoarele produse patologice: secreţii
purulente (din foliculite, abcese, celulite, fistule, infecţii ale plăgilor şi arsurilor), lichide (de
puncţie sinusală, otică, mastoidiană, articulară, peritoneală, pleurală, pericardică), exsudat nazal
sau exsudat faringian, sânge, LCR, spută, urină, secreţie vaginală, tampoane vaginale, lichid de
vomă, materii fecale, alimente, prelevate de pe suprafaţa cateterelor şi a inserţiilor iv. ale
acestora.
În continuare vom discuta cazul în care p.p. este reprezentat de puroi .
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic

- se realizează cât mai rapid şi în aşa fel încât să se poată obţine colonii izolate şi respectiv o
cultură pură, care se va identifica
5
- stafilococii se dezvoltă în general pe medii de cultură obişnuite (mediu geloză-sânge) în 18-24
ore, la 35-37°C
- se pot multiplica pe medii hiperclorurate, tolerând o concentraţie de 7-10% NaCl (ex. mediul
Chapman).
- în cazul în care produsul este recoltat de la nivel nazal (existând certitudinea că produsul
conţine mai multe specii de microorganisme) este recomandată utilizarea mediilor
hiperclorurate.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic

Se va realiza pe baza mai multor caractere:
• Caractere morfotinctoriale: coci Gram-pozitivi, cu diametrul de circa 0,6-1,5 mm,
dispuşi în lanţuri scurte, perechi, izolaţi sau în grămezi neregulate.
• Caractere de cultură: produc colonii de tip S, pigmentate auriu; pe mediile cu sânge pot
produce hemoliză.
• Caractere biochimice: au un metabolism glucidic atât respirator cât şi fermentativ.
Fermentează glucoza, manitolul, xiloza, lactoza, zaharozaetc. cu producere de acid.
Capacitatea de acidifiere a mediului conţinând manită este utilizată ca test de diferenţiere
între S. aureus (manită-pozitiv) şi SCN (manită-negativ). S. aureus este catalază-pozitiv
(la fel ca și ceilalți stafilococi; există sisteme multitest care se pot procura comercial (API,
Micro Scan etc).
• Caractere antigenice: Pentru diferențierea S. aureus de SCN utilizam teste comerciale
care includ fibrinogen şi IgG care cuplează coagulaza legată şi proteina A (tehnici de
aglutinare indirectă)
• Caractere de patogenitate:
o testul coagulazei: factorul care produce coagularea pe lamă poate fi prezent la circa 10%
dintre tulpinile de S. intermedius. În cazul în care în testul coagulazei pe lamă se foloseşte
plasmă umană, rezultatul poate fi pozitiv pentru S. lugdunensis şi S. schleiferi (subspecia
schleiferi).
o Pentru identificarea exotoxinelor se poate utiliza o tehnică de tip ELISA sau aglutinarea
pasivă inversată
• Sensibilitatea la bacteriofagi: există un set de bază de bacteriofagi, care permit încadrarea S. aureus
în unul din grupele I, II, III sau V
• Alte caractere / teste utilizate în identificare: teste care se bazează pe proprietăţi fenotipice sau
genotipice, tehnici pentru evidenţierea unor elemente ale peretelui celular (proteina A, coagulaza
legată) etc.
5. Antibiograma
- este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice
- în cazul unor infecţii grave trebuie să fie însoţită de alte determinări
- pentru a identifica tulpinile rezistente la meticilină (MRSA) se poate detecta prezenţa genei
mecA (după amplificare genică, prin PCR)
SENSIBILITATE LA ANTIBIOTICE
Tratamentul unei stafilococii, în cazul în care este necesară antibioterapia, se va face

conform antibiogramei.
Principial, dacă un stafilococ este sensibil la penicilină (majoritatea tulpinilor au devenit
rezistente prin producerea de beta-lactamază, dar nu toate), atunci tratamentul ar trebui să
includă acest antibiotic. Datorită rezistenței la penicilină au fost produse peniciline rezistente la
6
acțiunea beta-lactamazelor (penicilinele M – de la ”meticilină”), de ex. oxacilina, cloxacilina și
derivații acestora. Tulpinile meticilino-rezistente pot deveni destul de rapid multi-rezistente.
MRSA răspunde potențial la tratamentul cu vancomicină. VRSA poate răspunde la
streptogramine (de exemplu etamycin). Cu toate acestea, a fost identificată rezistenţă şi la
streptogramine (9), existând totuşi posibilitatea tratării S. aureus rezistent la streptogramina B
cu lincosamide.
În cazul colecţiilor purulente reamintim şi considerăm că este de reţinut ca fiind de primă
importanţă utilizarea inciziei şi drenajului, fără de care antibioterapia nu are nici un sens. De
multe ori, incizia şi drenajul sunt suficiente.
MĂSURI DE PROFILAXIE
Prevenirea transmiterii infecţiei are la bază metodele de igienă, asepsie şi antisepsie. În
spital, secţiile cu risc sunt cele de neonatologie, terapie intensivă, sălile operatorii şi saloanele
unde se află pacienţi cu cancer aflaţi sub chimioterapie / sau cu alte cauze de imunodepresie. În
aceste situaţii, personalul medical trebuie investigat prin metode de laborator şi este de preferat
ca persoanele purtătoare de stafilococi coagulază-pozitivi să nu aibă acces în aceste incinte şi să
nu aibă contact direct cu pacienţii în cauză.
Ca alternativă trebuie să se pună accentul pe proceduri adecvate, care să evite
contaminarea pacienților. Utilizarea substanţelor antiseptice şi încercarea de eradicare cu
ajutorul antibioticelor a portajului nazal (ex. lizostafină, mupirocină) ar putea fi utile.
Utilizarea vaccinului stafilococic poate să amelioreze starea clinică în anumite situaţii, de ex. la
pacienţi care necesită hemodializă, prezenţa de catetere etc. Din păcate la nivel internaţional
(EU) nu există un vaccin stafilococic care să fi primit autorizaţie de utilizare.
2. GENUL STREPTOCOCCUS
CARACTERE GENERALE - coci sferici Gram-pozitivi, formează perechi sau lanţuri în cursul
diviziunii celulare, imobili, nesporulaţi şi pot avea sau nu capsulă; sunt larg răspândiţi în natură
(unii fac parte din flora umană normală, alţii sunt asociaţi cu afecţiuni umane importante
datorate parţial infecţiei streptococice şi parţial răspunsului imun al gazdei)
1. Specii principale; Streptococcus pyogenes (grup A), S. agalactiae (grup B), S. viridans (care
aparţine florei normale), S. pneumoniae (pneumococul) etc
• S. pyogenes - cei mai mulţi dintre streptococii care conţin antigenul de grup A sunt
streptococi piogeni
- sunt beta-hemolitici (produc în mod caracteristic zone largi de hemoliză clară în jurul unor
colonii de dimensiuni mici, punctiforme)
- este principalul microb asociat cu invazia locală sau sistemică şi cu tulburări imunologice
poststreptococice
- de regulă sunt sensibili la bacitracină
• S. agalactiae - flora normală a tractului genital feminin

- poate reprezenta o importantă cauză de sepsis şi meningită neonatală
- sunt beta-hemolitici şi produc zone de hemoliză care sunt doar puţin mai extinse decât
coloniile (1-2 mm în diametru)
- hidrolizează hipuratul de sodiu şi dau o reacţie pozitivă în testul CAMP (folosind discuri
impregnate cu toxină β stafilococică)
• Grupele C şi G - izolaţi uneori din nazofaringe şi pot cauza sinuzită, bacteriemii sau
endocardită
7
- deseori formează colonii asemănătoare cu cele ale streptococilor piogeni şi sunt beta-
hemolitici
- sunt identificaţi prin reacţii cu antiser specific pentru grupele C sau G
• S. pneumoniae (pneumococi) - sunt alfa-hemolitici
- creşterea lor este inhibată de optochin, iar coloniile sunt distruse de bilă şi săruri biliare
- reprezintă o cauză importantă de morbiditate și mortalitate (prin pneumonie comunitară)
• S. viridans - flora normală la nivelul tractului respirator superior
- sunt alfa-hemolitici, dar pot fi nonhemolitici
- creşterea lor NU este inhibată de optochin
- pot ajunge în torentul sanguin ca urmare a unei traume şi reprezintă o cauză importantă
a endocarditei care survine la pacienţi cu valve cardiace patologice
- unii streptococi viridans (exempluS. mutans) sintetizează polizaharide care contribuie la
geneza cariilor dentare
2. Habitat - la nivelul tractului respirator superior uman; o parte dintre speciile de streptococi
colonizează exclusiv suprafaţa dentară şi devin detectabile numai după erupţia dentară
3. Morfologie - coci Gram-pozitivi, sferici sau ovoidali, cu diametrul de circa 1µm, imobili,
nesporulaţi
- se divid într-un plan perpendicular pe axa lor lungă şi sunt aranjaţi în lanţuri (de până la 50
elemente bacteriene)
- lungimea lanţurilor variază şi este condiţionată de factori de mediu
- unii streptococi elaborează o capsulă polizaharidică comparabilă cu cea pneumococică
- cele mai multe din speciile de grup A, B şi C produc capsulă din acid hialuronic
- capsulele sunt mai evidente în culturile tinere şi împiedică fagocitoza
- pilii streptococici sunt acoperiţi de acid lipoteichoic şi au rol în aderenţă
- cei mai mulţi streptococi cresc pe medii solide şi formează colonii discoide, de tip S, cu
diametrul de 1-2 mm
- Streptococul piogen beta-hemolitic de grup A formează colonii punctiforme
- speciile care produc material capsular adeseori dau naştere unor colonii mucoide (de tip M)
- cei mai mulţi streptococi sunt aerobi, facultativ anaerobi; peptostreptococii sunt strict
anaerobi.
- necesităţile nutritive variază mult în funcţie de specie: streptococii implicaţi în patologia
umană sunt în general germeni pretenţioşi, necesitând o varietate de factori de creştere
- un mediu de cultură util (atât ca mediu îmbogăţit cât şi ca mediu diferenţial) este mediul
geloză-sânge; pe acest mediu streptococii se pot diferenţia în funcţie de capacitatea de a produce
hemoliză
- distrugerea completă a eritrocitelor cu eliberarea de hemoglobină poartă numele de beta-
hemoliză şi reprezintă un caracter util în identificarea streptococilor piogeni (colonii mici, de
tip S, înconjurate de o zonă clară de hemoliză, cu un diametru mult mai mare decât diametrul
coloniei)
-liza incompletă a eritrocitelor cu formarea de pigment verde se numeşte alfa-hemoliză (sau
hemoliză viridans)
- hemoliza incompletă fără o nuanţă verzuie poartă numele de hemoliză alfa prim
- în cazul în care streptococii nu produc hemoliză sunt clasificaţi drept streptococi gama
- în funcţie de producerea hemolizei, mai frecvent implicaţi în patologia umană sunt streptococii
beta-hemolitici, iar dintre aceştia în mod special streptococii beta-hemolitici din grupul A
- streptococul piogen beta-hemolitic de grup A elaborează două hemolizine:
1) streptolizina O, o proteină antigenică, hemolitic activă în stare redusă (grupări –SH
disponibile), dar inactivată rapid în prezenţa oxigenului
8
2) streptolizina S care nu este imunogenă
- streptococul piogen este distrus în 30 de minute la 56ºC, dar poate supravieţui în secreţii uscate,
la temperatura camerei şi întuneric timp de câteva săptămâni
- deoarece nu este sensibil la acţiunea coloranţilor de tipul trifenil-metan, cristalul violet poate
fi utilizat în mediile de cultură selective
- producerea hemolizei
- streptococii piogeni sunt germeni pretenţioşi care necesită pentru dezvoltare adăugarea în
mediul de cultură a vitaminelor, aminoacizilor, glucozei sau cel puţin utilizarea ca mediu de
cultură a gelozei-sânge sau a bulionului nutritiv
- streptococii degradează glucoza pe calea glicolitică; o mare parte dintre specii pot fermenta şi
alte tipuri de zaharuri şi alcooli zaharaţi utilizând o serie de enzime inductibile (sintetizate doar
în prezenţa carbohidratului respectiv şi în absenţa glucozei)
- în mod uzual streptococii piogeni sunt sensibili la bacitracină, sunt catalază negativi

- streptococii hemolitici pot fi divizaţi în grupe serologice (peste 18 grupe serologice notate cu
literele mari ale alfabetului, A-U), pe baza carbohidratului C, prezent în structura peretelui
multor streptococi.
- specificitatea serologică a carbohidratului specific de grup este determinată de un zahar
aminat, care pentru streptococii de grup A este ramnoză-N-acetil-glucozamină, pentru grupul
B ramnoză-glucozamină-polizaharid etc. Cele mai importante sunt grupele A, B, C, F şi G
(includ streptococi β-hemolitici)
- streptococii beta-hemolitici din grupul A prezintă la nivel parietal proteina M, cel mai
important factor de patogenitate pentru acest grup streptococic
- anticorpii faţă de proteina M conferă imunitate specifică de tip
- deoarece există mai mult de 100 de tipuri de proteină M (dar nu toate au şi proprietăţi de
prevenire a fagocitozei), o persoană poate face infecţii repetate cu S. pyogenes de grup A, de
diferite tipuri
- proteina M a fost identificată şi la streptococi din grupul G
Alte structuri antigenice sunt reprezentate de către:

- proteina asociată proteinei M (MAP);
- substanţa T care permite diferenţierea anumitor tipuri de streptococi prin aglutinarea cu
antiser specific;
- peptidaza C5a (care clivează fragmentul C5a al sistemului complement);
- proteina R, care este un antigen de suprafaţă;
- proteina F, cu rol de adezină, ce interacţionează cu fibronectina;
- nucleoproteine (substanţe P) care probabil alcătuiesc cea mai mare parte din corpul
streptococic;
- diferite toxine şi enzime:
1. streptokinaza (fibrinolizina) - transformă plasminogenul în plasmină; poate fi utilă în
tratamentul administrat intravenos în embolia pulmonară, tromboza arterială şi venoasă şi în
infarctul miocardic acut; este o structură antigenică;
2. streptodornaza (dezoxiribonucleaza) depolimerizează ADN-ul; după infecţii streptococice,
în special după infecţii ale pielii, apar anticorpi anti-Dn-ază;
3. hialuronidaza scindează acidul hialuronic, o componentă importantă a substanţei
fundamentale din ţesutul conjunctiv;
4. toxina eritrogenă solubilă, distrusă prin fierbere într-o oră, stă la originea rash-ului (erupţiei
caracteristice) care apare în scarlatină; toxina eritrogenă este elaborată numai de streptococii
9
lizogenizaţi; există un singur tip de toxină eritrogenă;
5. difosfopiridin nucleotidaza este o enzimă elaborată şi eliberată în mediu de unii streptococi;
6. hemolizinele (streptolizinele) - semnificaţia biologică a streptolizinei O este încă neclară. Se
ştie că administrată intravenos duce la animalele de laborator la deces în câteva secunde prin
acţiunea sa directă la nivel cardiac. Totuși, nu este cert că streptolizina S ar fi produsă și in
vivo.
RĂSPUNS IMUN
- rezistenţa împotriva infecţiei streptococice are specificitate de tip
- imunitatea faţă de infecţia cu streptococi de grup A este legată de prezenţa anticorpilor specifici
anti-proteină M
- pentru că există mai mult de 80 de tipuri de proteină M, o persoană poate face infecţii repetate
cu S. pyogenes de grup A, de tipuri diferite
- au fost identificate două clase majore (I şi II) de proteină M
- anticorpii anti-proteină M pot fi identificaţi serologic
- deoarece există un singur tip de toxină eritrogenă, în cazul infecţiei streptococice care duce la
scarlatină imunitatea după boală este durabilă, menţinându-se eventual chiar şi pentru toată
viaţa
- în cursul infecţiilor streptococice apar anticorpi anti-streptolizină O; aceştia pot fi identificaţi
prin teste serologice (ex. reacţia ASLO)
- titrul anticorpilor poate fi util în diagnosticarea bolilor streptococice şi poststreptococice
- proteina F - rol de adezină (se leagă de fibronectina celulelor gazdei) şi rol în invazivitate.
- proteina M - cel mai important factor antigenic şi de patogenitate pentru streptococul beta-
hemolitic din grupul; apare ca o excrescenţă la nivelul peretelui celular și formează structuri
fibrilare care se extind cu 50-60 nm în afara celulei bacteriene, fiind ancorate cu cealaltă
extremitate în membrana citoplasmatică
- atunci când proteina M este prezentă, streptococii sunt virulenţi
- în absenţa anticorpilor specifici de tip anti-proteină M, streptococii sunt capabili să reziste
fagocitării de către leucocitele polimorfonucleare
- proteina M este implicată şi în aderarea la celulele epiteliale ale gazdei
- streptococii de grup A lipsiţi de proteina M sunt avirulenţi
- proteina M și alte antigene streptococice au un rol important în patogeneza „febrei reumatice”
(reumatismului articular acut)
- domeniile antigenice conservate din proteinele de clasă M (în special clasa I) reacţionează
încrucişat cu structuri ale muşchiului cardiac uman
- alte tipuri M au similarităţi cu miozina, keratina sau α-tropomiozina
- unele tulpini de S. pyogenes formează o structură capsulară compusă din acid hialuronic şi
produc colonii mucoide pe geloză-sânge (materialul capsular nu este imunogenic); poate avea
rol în virulenţa anumitor tulpini
- hialuronidaza facilitează răspândirea microorganismelor infectante
- difosfopiridin nucleotidaza - enzimă elaborată şi eliberată în mediu de unii streptococi; permite
microorganismului să distrugă leucocitele
- toţi streptococii piogeni produc C5a peptidază - serin-protează care scindează componenta C5a
(rezultată în cascada sistemului C’). C5a este unul dintre principalii factori care atrag PMN la
sediul procesului infecţios
- toxina eritrogenă, elaborată numai de către streptococii beta-hemolitici din grupul A
lizogenizaţi, este implicată în patogenia erupţiei din scarlatina streptococică
10
Boli invazive datorate streptococilor piogeni
Tabloul clinic este determinat de poarta de intrare. În fiecare caz poate apărea o extindere rapidă
şi difuză a infecţiei de-a lungul căilor limfatice, însoţită de o supuraţie minimă. Infecţia se poate
extinde la nivel circulator. În această categorie se pot include
• Erizipelul- când poarta de intrare este reprezentată de tegument (formă particulară de
celulită); leziuni „lucioase”, eritemtoase, indurate, sub forma unei plăci cu margini
distincte; adesea este cauzat de streptococii de grup A
• Febra puerperală - în cazul unei infecţii streptococice intrauterine.
• Sepsisul streptococic
• Infecţiile osoase şi articulare
• Meningita etc.
Boli localizate
• Faringita - cea mai obişnuită infecţie datorată streptococilor beta-hemolitici.
Streptococii virulenţi de grup A aderă la epiteliul faringian prin intermediul acidului
lipoteichoic. Extinderea la nivel amigdalian şi eventual la nivelul altor structuri poartă
numele de angină streptococică. Boala se manifestă cu durere în gât, rinofaringită,
amigdalită „roşie” şi purulentă, ganglioni limfatici cervicali măriţi şi dureroşi, febră (39-
40°C). Poate avea loc (în special la copiii mici) extinderea infecţiei către urechea mijlocie,
mastoidă şi meninge. Crca 10-20% din infecţii pot fi asimptomatice.
• Impetigo streptococic - infecţie localizată la nivelul straturilor superficiale ale pielii, în
special la copii; factori de risc generali: mediul umed şi igiena deficitară. Clinic avem de-
a face cu vezicule, pustule sau bule ce se rup şi formează o crustă gălbuie, durere uşoara
sau disconfort şi prurit.
• Celulita streptococică (aşa cum știm, poate fi şi stafilococica) este o infecţie acută a
pielii şi ţesutului subcutan. Clinic, pacientul se prezintă cu durere, eritem ce se extinde
rapid, edem, febră, limfadenopatie regională. Cel mai adesea este cauzată de S. pyogenes,
la pacienţii diabetici este întâlnit şi S. agalactiae. Infecţia apare mai des la nivelul
membrelor inferioare, tipic unilateral. Peteşiile sunt adesea întâlnite, se pot dezvolta
vezicule şi bule ce se pot rupe.
• Pneumonia poate fi rapid progresivă şi severă; de obicei apare ca o complicaţie, în urma
unei infecţii virale (de exemplu gripă, pojar etc.)
• Endocardita infecţioasă poate fi acută sau subacută. În cazul endocarditei acute, în
cursul bacteriemiei streptococii pot coloniza valvele cardiace normale sau lezate
anterior. Distrugerea rapidă a valvelor, în lipsa tratamentului antibiotic corespunzător şi
uneori a protezării valvulare, evoluează frecvent spre un deznodământ fatal în zile sau
săptămâni. Endocardita subacută implică mai frecvent valvele anormale (malformaţii
congenitale, leziuni reumatice sau aterosclerotice).
Boli datorate producerii de toxine
• Sindromul de şoc toxic streptococic, foarte asemănător celui produs de către S. aureus, apărut
datorită eliberării de toxine. Mortalitatea este mai ridicată ca în cazul sindromului stafilococic. Are
un debut brusc, febră 39°-40,5°C, hipotensiune, eritem difuz macular, coagulopatie, leziuni hepatice.
• Atunci când streptococii sunt lizogenizaţi (infectaţi cu un bacteriofag specific), produc toxină
eritrogenă. Dacă pacientul nu are imunitate antitoxică apar erupţia caracteristică şi scarlatina.
Antitoxinele faţă de toxina eritrogenă previn apariţia rash-ului, dar nu interferă cu infecţia
streptococică.
11
Bolile poststreptococice
După o infecţie acută cu streptococi beta-hemolitici de grup A urmează o perioadă de latenţă
(circa 1-4 săptămâni), după care se pot dezvolta bolile poststreptococice.
Perioada de latenţă sugerează faptul că boala poststreptococică nu se datorează efectului direct
al diseminării bacteriene, ci reprezintă un răspuns în cadrul unei stări de hipersensibilitate care
urmează unor infecţii repetate, netratate sau tratate necorespunzător, cu streptococi piogeni,
beta-hemolitici, din grupul A.
• Glomerulonefrita acută poate apărea la circa 3 săptămâni după infecția streptococică
(adesea tegumentară); se datorează unui mecanism de hipersensibilitate de tip III, prin
producerea în exces de complexe imune antigen-anticorp, care circulă şi se depun la
nivelul membranei bazale glomerulare. Toți glomerulii sunt afectaţi, mari şi infiltrați cu
PMN, monocite şi eozinofile. În nefrita acută apar hematurie microscopică şi
macroscopică, proteinurie pâna la sindrom nefrotic, edeme la nivelul feţei (ex.
periorbitale), hipertensiune arterială, retenţie de uree, oligurie şi anurie, ascită, congestie
sistemică (dispnee, tuse, stază în jugulare, cardiomegalie, galop, edeme
• Reumatismul articular acut (RAA) duce la afectarea valvelor şi a muşchiului cardiac.
Anumite tipuri de streptococi de grup A conţin antigene care reacţionează încrucişat cu
structuri din ţesutul cardiac uman sau cu structuri de la nivelul ganglionilor bazali.
RAA este precedat de o infecţie streptococică. În patogenia RAA sunt incluse toate
tipurile de hipersensibilitate, în special cele de tip II (citotoxică) şi de tip IV (mecanism
celular / întârziat), dar şi fenomene autoimune. Semnele şi simptomele specifice din RAA
includ febră, poliartrită migratorie şi semne legate de inflamaţia la nivel cardiac (cardita
reumatismală. RAA este o boală inflamatorie acută neinfecţioasă, nesupurativă. Apare în
comunităţi aglomerate, nivel economic scăzut, igienă precară, alimentaţie defectuoasă,
tulburări de imunitate. Incidenţa maximă a fost înregistrată la grupele de vârstă 5-15 ani.
Nu există predispoziţie de sex dar leziunile cardiace sunt diferite în funcţie de sex.
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
Diagnosticul de laborator este în mod uzual bacteriologic (direct) şi include recoltarea şi
transportul (în maxim 2 ore) produsului patologic, cu examinarea microscopică a acestuia,
cultivarea de obicei pe geloză-sânge şi identificarea pe baza caracterelor morfologice, de cultură,
biochimice şi antigenice a microorganismelor din coloniile izolate.
Antibiograma nu este, în general, necesară deoarece streptococii piogeni îşi menţin
sensibilitatea la penicilină.
Deşi cultivarea rămâne metoda standard în diagnostic, datorită faptului că rezultatul este
obţinut abia după circa 18 ore, au fost puse la punct teste rapide, care pot identifica antigenele
streptococice în circa 10 min. În vederea confirmării unei boli poststreptococice vom discuta
reacţia ASLO.
Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de streptococii piogeni - faringita streptococică
I. Diagnosticul de laborator bacteriologic, direct, în faringita streptococică.

1. Recoltarea şi transportul - secreţia purulentă de la nivelul faringelui, trebuie să se realizeze
respectând o serie de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit
antibiotice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate
normele de asepsie şi antisepsie, recoltarea se face preferabil dimineaţa înainte ca pacientul să
mănânce şi fără să se fi spălat pe dinţi, fără să fi utilizat gargarisme cu diferite soluţii, iar dacă
aceste condiţii nu au fost respectate, recoltarea se va face după minim 4 ore etc.
Produsul recoltat trebuie prelucrat cât mai repede posibil, însă în nici un caz nu trebuie să treacă
mai mult de 2-3 ore de la recoltare până la cultivare (preferabil 1-2 ore). În cazul în care se
estimează depăşirea acestui interval de timp trebuie folosit un mediu de transport, ex. mediul
12
Stuart. Chiar şi în această situaţie, nu ar trebui să treacă mai mult de 24 de ore până la prelucrarea
p.p.
2. Examinarea microscopică - realizarea a două frotiuri din produsul patologic recoltat şi
transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram.
Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează prezenţa celulelor de la
nivel faringian, prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) şi prezenţa cocilor Gram-
pozitivi aşezaţi separat, în perechi sau în lanţuri, dar şi a altor tipuri de microorganisme.
3. Cultivarea pe medii de cultură - se realizează în aşa fel încât să se poată obţine colonii
izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica. Streptococii piogeni sunt germeni
pretenţioşi care nu se dezvoltă pe medii de cultură obişnuite. Mediul cel mai frecvent folosit
este agar-sânge, pe care cultura apare în 18-48 ore, la 35-37°C. În cazul în care nu remarcăm
apariţia de colonii caracteristice după 24 de ore, reincubăm placa Petri pentru încă o zi.
Coloniile au aspect de tip S cu diametrul de 0,5-1 mm, înconjurate de o zonă de β-hemoliză
(zonă clară de hemoliză, cu un diametru mult mai mare decât diametrul coloniei). În cursul
însămânţării, pe cel puţin una dintre laturile „poligonului” descris trebuie să realizăm şi o
înţepare a mediului în aşa fel încât inoculul să ajungă mai în profunzime. Această manevră este
necesară pentru a permite activitatea hemolizinei O (hemolizina O este inactivată în prezenţa
oxigenului). Speciile care produc material capsular, din acid hialuronic, adeseori dau naştere
unor colonii mucoide (de tip M). Se pot folosi pentru cultivare şi medii selective (de ex. agar-
sânge plus trimetoprim-sulfametoxazol).
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor

caractere:
• Caractere morfotinctoriale: Sunt coci Gram-pozitivi, sferici sau ovoidali, cu diametrul
de circa 1µm. Se divid într-un plan perpendicular pe axa lor lungă şi se pot dispune în
lanţuri (de până la 50 elemente). Lungimea lanţurilor variază şi este condiţionată de
factori de mediu.
• Caractere de cultură: Produc colonii de tip S cu diametrul de 0,5-1 mm, înconjurate
de o zonă de β-hemoliză sau colonii de tip M.
• Caractere biochimice:
- Streptococii piogeni produc hemoliză de tip beta
- Prin testul PYR este identificată sinteza pirolidonil-amidazei
- Multiplicarea streptococilor de grup A este inhibată de bacitracină (antibiotic produs de
Bacillus licheniformis). Se apreciază că dintre tulpinile de Streptococcus pyogenes, mai puţin de
1% sunt rezistente la bacitracină
- Streptococii piogeni sunt rezistenţi la trimetoprim-sulfametoxazol
• Caractere antigenice:
o Se pot utiliza teste comerciale pentru detectarea rapidă a polizaharidului specific
de grup A al streptococilor piogeni în p.p., după extracţie chimică sau enzimatică.
Tehnicile utilizate pot fi aglutinarea indirectă (latex-aglutinare), coaglutinarea
sau ELISA.
o Prin reacţii de aglutinare pe lamă, sau precipitare se pot determina antigenele
streptococice de grup (Lancefield) sau de tip.
o S. pyogenes este împărţit în serotipuri pe baza antigenelor proteice M (peste 100
de serotipuri) prin reacţia de precipitare în tuburi capilare şi T (peste 28
serotipuri) prin reacţia de aglutinare pe lamă
• Alte teste utilizate în identificare:

o Se pot utiliza sondele nucleotidice pentru detectarea directă a streptococilor de
grup A în exsudatul faringian.
13
o După amplificare genică (PCR) pot fi identificate secvenţele genetice care
codifică pentru diferitele tipuri de proteină M (genele enm). Au fost descoperite
peste 120 de secvenţe genetice diferite.
5. Antibiograma
Streptococii piogeni îşi menţin sensibilitatea cunoscută la penicilină (au fost identificate tulpini
„tolerante”, care sunt inhibate dar nu distruse de către penicilină).
Pentru pacienţii cu hipersensibilitate ("alergici") la beta-lactamine se poate alege pentru
tratament eritromicina, dar au fost identificate tulpini rezistente la acest medicament
antimicrobian şi în acest caz antibiograma devine necesară. În general antibiograma se
realizează în scop epidemiologic, pentru supraveghere şi cercetare.
II. Diagnosticul de laborator serologic

Diagnosticul imunologic al infecţiilor produse de streptococii β-hemolitici din grupul A ar putea
consta din investigarea fie a răspunsului imun umoral (prezenţa şi titrul anticorpilor, în
cadrul diagnosticului serologic), fie a răspunsului imun de tip celular.
Diagnosticul serologic este util pentru certificarea etiologiei bolilor poststreptococice (RAA,
GNA), identificarea unei eventuale stări de hipersensibilitate, diagnosticul retrospectiv al unei
infecţii streptococice, evaluarea evoluţiei clinice şi eficacităţii tratamentului.
Pentru stabilirea diagnosticului pozitiv al RAA sau al GNA, criteriile de diagnostic sunt mai
complexe, dar includ dovedirea prin metode de laborator a unei infecţii streptococice în
antecedente.
Diagnosticul serologic se realizează prin reacţia ASLO, care identifică titruri ale anticorpilor
anti-streptolizină O. Testarea se face în dinamică, pe seruri recoltate la interval de 7-10 zile.
Pentru zona noastră geografică se acceptă ca normal un titru de 200 (maxim 250) unităţi ASLO.
Sunt strict necesare realizarea controlului intern şi extern de calitate și evaluarea rezultatelor în
contextul clinic.
Există teste serologice pentru determinarea prezenţei şi titrului anticorpilor faţă de alte structuri
antigenice (streptodornază, hialuronidază, streptokinază). Titrul anticorpilor anti-
streptodornază este crescut la pacienţii cu infecţii tegumentare şi trebuie investigat dacă se
suspicionează prezenţa unei glomerulonefrite acute.
3. STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
CARACTERE GENERALE
Streptococcus pneumoniae se prezintă sub formă de coci Gram-pozitivi, alungiţi, lanceolaţi,
dispuşi în general în diplo pe axul longitudinal, încapsulaţi, nesporulaţi, imobili. Pneumococii
sunt aerobi, facultativ anaerobi. Pe geloză-sânge determină a-hemoliză, la fel ca Streptococcus
viridans. Creşterea îi este favorizată în atmosferă de 5% CO2 la o temperatură de 37°C.
Streptococcus pneumoniae este unul dintre principalele microorganisme implicate în etiologia
otitei medii şi în alte infecţii respiratorii, incluzând pneumonia.
1. Habitat: flora normală a tractului respirator superior (în special bucală, nazală şi faringiană);
frecvenţa portajului orofaringian este de 30-70%
2. Morfologie: coci Gram-pozitivi, alungiţi, lanceolaţi, dispuşi în general în diplo, încapsulaţi

(cu o capsulă comună), imobili, nesporulaţi
- în coloraţia cu albastru de metilen, capsula apare ca un halou în jurul pneumococilor
- utilizând anticorpi anti-capsulari, se poate realiza o identificare rapidă inclusiv direct, pe
produsul patologic (de exemplu spută), prin reacţia de umflare a capsulei
14
- sunt germeni pretenţioşi, care nu se dezvoltă pe medii simple, aerobi, facultativ anaerobiâ
- pe geloză-sânge formează colonii de tip S sau de tip M, înconjurate de o zonă de a-hemoliză
(la fel ca Streptococcus viridans)
- multiplicarea este favorizată în atmosferă de 5% CO2 la o temperatură de 37°C
- glucoza reprezintă principala sursă de energie pentru pneumococi
- aceştia elaborează enzime zaharolitice, proteolitice şi lipolitice
- în mediile de cultură lichide pneumococii tulbură omogen mediul
- glucoza reprezintă principala sursă de energie pentru pneumococi, care elaborează enzime
zaharolitice, proteolitice şi lipolitice
- fermentarea inulinei reprezintă un caracter biochimic important, util în diferenţierea
pneumococilor de s. viridans (ambele tipuri de streptococi producând pe geloză-sânge o
hemoliză de tip viridans).
- produc enzime autolitice - autoliza este indusă şi accelerată de bilă, săruri biliare, acizi biliari;
testul este util în identificarea pneumococilor (testul bilolizei, Neufeld).
- sunt sensibili la optochin - utilă în identificare şi diferenţierea de Streptococcus viridans
- pneumococii pot supravieţui câteva luni în spută uscată, la întuneric; în mediul extern
rezistenţa lor este scăzută. În timp, microorganismele devin Gram-negative şi tind să se lizeze
spontan

- la nivelul peretelui există un polizaharid specific de grup, comun tuturor pneumococilor
- polizaharidul C include acidul teichoic (legat de peptidoglican)
- cel mai important determinant antigenic şi patogenic este capsula polizaharidică (antigenul
K), ce protejează pneumococul faţă de fagocitoză şi permite invazivitatea
- structura polizaharidului capsular este specifică fiecărui serotip în parte
- până în prezent au fost identificate peste 90 de serotipuri capsulare diferite, a căror structură
a fost determinată pentru majoritatea serotipurilor
- au fost produse seruri specifice anticapsulare polivalente şi monovalente, utile în identificarea
pneumococilor cu ajutorul reacţiei de umflare a capsulei.
- este descris şi acidul lipoteichoic numit şi antigen F (Forsman); anticorpii faţă de antigenul F
reacţionează încrucişat cu polizaharidul C de la streptococii piogeni
- fosfocolina (FC) se găseşte atât în acidul lipoteichoic, cât şi în acidul teichoic parietal
- prezenţa reziduurilor de FC este necesară atât în diviziune, în fenomenul de autoliză, cât şi în
fenomenul genetic de transformare
- FC are şi rol de adezină (se leagă de „choline-binding proteins” de pe suprafaţa celulelor
gazdei).
- toţi pneumococii secretă IgA1 protează (una dintre Zn-proteinazele produse de S. pneumoniae)
RĂSPUNS IMUN
Imunitatea faţă de infecţia pneumococică are specificitate de tip şi depinde atât de anticorpii
care apar împotriva polizaharidului capsular, cât şi de funcţia fagocitelor. Vaccinarea induce
producerea de anticorpi faţă de polizaharidul capsular.
15
S. pneumoniae este un microb condiţionat patogen care, atunci când este implicat în
patologia umană, se manifestă prin multiplicare şi invazivitate. Virulenţa pneumococilor
depinde de capsulă, care conferă rezistenţa la fagocitoză. Un ser care conţine anticorpi împotriva
polizaharidelor specifice de tip protejează împotriva infecţiei. Dacă un astfel de ser este absorbit
cu polizaharide specifice de tip îşi pierde puterea protectoare.
Alţi factori de patogenitate ar fi reprezentaţi de:

- IgA1 protează;
- hemolizina intracelulară (pneumolizina), eliberată prin autoliză (inhibă chemotactismul
pentru PMN, inhibă proliferarea limfocitelor şi sinteza de anticorpi);
- proteinele de suprafaţă (PspA) care au unele asemănări cu proteina M de la S. pyogenes;
- neuraminidazele (NanA şi NanB) şi hialuronidaza.
Deoarece circa 30-70% din oameni pot fi la un moment dat purtători de pneumococi,
mucoasa respiratorie normală are un grad important de rezistenţă naturală faţă de aceste
microorganisme. Printre factorii care predispun la infecţie ar fi de menţionat:
- anomalii constituţionale sau dobândite ale tractului respirator (infecţii virale, alergii locale,
obstrucţii bronşice, afectări ale tractului respirator datorate unor substanţe iritante etc.);
- intoxicaţia cu alcool sau droguri, care deprimă activitatea fagocitară şi reflexul de tuse;
- consumul de tutun (fumatul);
- malnutriţia, debilitatea generală, hiposplenismul sau deficienţele sistemului complement.
În majoritatea infecţiilor pneumococice există o fază iniţială bacteriemică, perioadă în

care microorganismul ar putea fi izolat prin hemocultură. Pneumococul este patogen prin
multiplicare şi invazivitate, conducând la apariţia unor variate infecţii ale tractului respirator
superior şi inferior, ale urechii medii, ale sinusurilor, dar şi alte infecţii produse prin diseminare
hematogenă (ex. meningită, endocardită, care pot fi foarte grave).
Pneumonia pneumococică se însoţeşte de prezenţa edemului alveolar şi a unui exsudat
fibrinos, urmat de apariţia de hematii şi leucocite. În exsudat se identifică prezenţa a numeroşi
pneumococi. Debutul pneumoniei este adesea brusc, cu febră mare, frison, junghi toracic. Sputa
caracteristică este ruginie (semn patognomonic). Aspectul radiologic este caracteristic atunci
când este prins un singur lob şi constă într-o opacitate cu aspect triunghiular, cu baza la periferie
şi vârful către mediastin (pneumonie francă lobară).
Diagnosticul pneumoniei pneumococice este clinic, radiologic iar din punct de vedere al
stabilirii etiologiei este un diagnostic bacteriologic (direct).
1. Recoltarea şi transportul
Trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca
pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor
utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie etc). În pneumonia pneumococică
agentul etiologic poate fi izolat şi prin hemocultură. În continuare vom discuta cazul în care p.p.
este reprezentat de spută.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic

Include realizarea a minim două frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat
corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. Frotiurile se
examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează prezenţa celulelor de la nivel alveolar
(ex. macrofage alveolare), prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite) şi prezenţa cocilor
gram-pozitivi, alungiţi, lanceolaţi, dispuşi în general în diplo, încapsulaţi (cu o capsulă
16
comună), nesporulaţi. Examinarea microscopică trebuie să demonstreze calitatea produsului
patologic şi să realizeze o identificare prezumtivă a microorganismului implicat. În coloraţia cu
albastru de metilen, capsula poate apărea ca un halou în jurul pneumococilor. Utilizând
anticorpi anti-capsulari, se poate realiza o identificare rapidă inclusiv direct, pe produsul
patologic (de exemplu spută), prin reacţia de umflare a capsulei.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic

Se realizează în aşa fel încât să se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care
se va identifica. Pneumococii sunt germeni pretenţioşi, care nu se dezvoltă pe medii simple, sunt
aerobi, facultativ anaerobi. Pe geloză-sânge formează colonii de tip S sau de tip M, înconjurate
de o zonă de a-hemoliză (la fel ca Streptococcus viridans). Multiplicarea este favorizată în
atmosferă de 5% CO2 la o temperatură de 35-37°C. În mediile de cultură lichide tulbură omogen
mediul. Produsul patologic se poate inocula şi la animale de laborator sensibile, respectiv la
şoareci albi.

· Caractere morfotinctoriale: Sunt coci gram-pozitivi, alungiţi, lanceolaţi, dispuşi în
general în diplo, încapsulaţi (cu o capsulă comună), nesporulaţi.
· Caractere de cultură: Pe geloză-sânge formează colonii de tip S sau M, înconjurate de o
zonă de a-hemoliză (la fel ca Streptococcus viridans).
· Caractere biochimice:
· Glucoza reprezintă principala sursă de energie pentru pneumococi. Aceştia elaborează
enzime zaharolitice, proteolitice şi lipolitice.
· Fermentarea inulinei reprezintă un caracter biochimic important, util în diferenţierea
pneumococilor de s. viridans (există tulpini de S. viridans care fermentează inulina). Se utilizează
un mediu în care există inulină şi un indicator de pH. În cazul reacţiei pozitive are loc o
modificare de pH şi respectiv modificarea culorii mediului.
· Pneumococii elaborează enzime autolitice. Autoliza este indusă şi accelerată de bilă, săruri
biliare, acizi biliari; testul este util în identificarea pneumococilor (testul bilolizei, Neufeld;
vezi capitolul 12, punctul 12.3).
· Sunt sensibili la optochin (etil-hidrocupreină), sensibilitatea la această substanţă fiind
de asemenea utilă în identificare şi diferenţierea de Streptococcus viridans (vezi capitolul 12,
punctul 12.13).
· Caractere antigenice:
· Cel mai important determinant antigenic şi patogenic este capsula polizaharidică
(antigenul K), ce protejează pneumococul faţă de fagocitoză şi permite invazivitatea. Structura
polizaharidului capsular este specifică fiecărui serotip în parte. Până în prezent au fost
identificate peste 85 de serotipuri capsulare diferite, a căror structură a fost determinată pentru
majoritatea serotipurilor. Au fost produse seruri specifice anticapsulare polivalente şi
monovalente, utile în identificarea pneumococilor cu ajutorul reacţiei de umflare a capsulei. În
acelaşi scop se poate utiliza şi reacţia de aglutinare.
· Datorită faptului că prin urină se elimină cantităţi destul de importante de Ag K, prezenţa
acestuia poate fi evidenţiată prin reacţii de latexaglutinare sau mai bine prin imunoelectroforeză.
· Caractere de patogenitate: Se poate utiliza inocularea la şoarecele alb (vezi capitolul 11).
· Alte teste utile în identificare: Se pot utiliza sonde nucleotidice pentru identificarea ARNr.
5. Antibiograma
Este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice pe medii suplimentate cu
sânge defibrinat de oaie. Pentru verificarea sensibilităţii / rezistenţei la penicilină se utilizează
microcomprimate cu oxacilină (1 mg). În cazul unor infecţii grave antibiograma trebuie să fie
însoţită de alte determinări.
17
4. GENUL NEISSERIA
CARACTERE GENERALE
1. Specii principale: N. meningitidis (meningococul) şi N. gonorrhoeae (gonococul), dar se pot

aminti şi N. lactamica, N. sicca, N. subflava, Neisseria bacilliformis etc.
2. Habitat
 N. lactamica - la nivel nazal sau faringian; prezența acestei bacterii poate avea efecte
favorabile, înregistrându-se activitate bactericidă serică îndreptată împotriva N.
meningitidis
 N. gonorrhoeaese - la nivelul mucoaselor genitale la gazdele infectate (indiferent dacă
infecţia este sau nu simptomatică). A fost remarcată pentru prima dată de Albert Neisser
(1879): coci intra-leucocitari la examenul secreţiei purulente din uretra masculină, la
pacienţi cu gonoree. Cultivarea a fost realizată cu 3 ani mai târziu. Cea mai recent definită
subspecie de N. gonorrhoeae a fost identificată în secreţii conjunctivale (N. gonorrhoeae
subspecia kochii). Nivele crescute de Lactobacillus, genul dominant în microbiota
vaginală, au fost evidenţiate în strânsă legătură cu un risc scăzut de infectare în urma
expunerii la N. gonorrhoeae. Lactobacillus scade aderenţa N. gonorrhoeae cu până la
50% şi inhibă invazia celulelor epiteliale cu până la 60%. Mai mult decât atât, lactobacilii
au posibilitatea să disloce gonococii aderaţi ceea ce ne poate conduce la ideea că ar putea
ajuta la profilaxia postexpunere.
 N. meningitidis - la nivel nazal sau faringian. La pacienţii cu meningită meningococică,
germenul se multiplică în lichidul cefalorahidian (LCR). Atât adulţii cât şi copiii pot fi
colonizaţi de mai multe specii de Neisserii, în acelaşi timp (de ex. Neisseria spp.
nepatogene şi N. meningitidis).
3. Morfologie - meningococul şi gonococul sunt diplococi Gram-negativi, reniformi, imobili,

înconjuraţi de o structură capsulară comună, cu o structură de polifosfat sau polizaharid-
polifosfat (în cazul meningococului), situaţie în care capsula este mai evidentă
- ambele microorganisme au nevoie medii de cultură îmbogăţite, necesităţile nutritive fiind

mult mai mari în cazul gonococului (există tulpini de meningococ care se pot dezvolta pe
medii simple, cu săruri minerale, lactat şi aminoacizi)
- principial se pot multiplica în cazul folosirii mediului Mueller-Hinton, la o temperatură de
incubare de 35-37ºC şi în condiţiile unei atmosfere de 3-10% CO2
- gonococul nu se multiplică în lipsa unor surse energetice (glucoză, piruvat, lactat), coloniile
apar în 24-48 de ore, mai rapid în cazul meningococului.
- gonococul produce colonii de tip S, cu dimensiuni de 0,5-1 mm sau colonii de tip M,
nepigmentate, transparente sau opace în aceeaşi placă pot apărea până la cinci tipuri de
colonii (T1-T5), ceea ce poate facilita identificarea; paca este eliminată în cazul în care nu se
dezvoltă colonii după 72 de ore
- coloniile de meningococ sunt de tip S, cu dimensiuni de circa 1 mm; tulpinile încapsulate (A,
C) pot conduce la apariţia unor colonii de tip M
- naisseriile sunt foarte sensibile la uscăciune, lumină solară şi la variaţii de temperatură,
precum şi la majoritatea antisepticelor şi dezinfectantelor; produc enzime autolitice
18
- metabolizează diferiţi carbohidraţi: gonococul poate metaboliza glucoza (nu şi maltoza), în
timp ce meningococul metabolizează ambele zaharuri menţionate
- produc citocrom-oxidază, ceea ce reprezintă un test cheie în identificare, se utilizează de
exemplu benzi de hârtie de filtru îmbibată cu reactiv, respectiv tetrametil-p-fenilendiamină;
reacţia pozitivă apare în circa 10 secunde
6. Structura antigenică
În cazul germenilor Gram-negativi, la nivelul membranei externe se găseşte lipopolizaharidul

(endotoxina). Spre deosebire de lipopolizaharidul (LPZ) din structura enterobacteriilor, care
conţine multiple unităţi repetitive, neisseriile au lanţuri zaharidice scurte, motiv pentru care
denumirea corectă ar fi cea de lipooligozaharid (LOZ). În funcţie de structura
lipooligozaharidului există mai multe serotipuri, 6 în cazul gonococului şi 12 în cazul
meningococului. Gonococii pot exprima simultan mai multe structuri antigenic diferite.
Lipopolizaharidul (lipooligozaharidul) a fost denumit şi endotoxină, deoarece este eliberat din
perete după distrugerea germenilor. Lipooligozaharidul se fragmentează în lipidul A
(responsabil pentru toxicitate) şi respectiv în polizaharidul (oligozaharidul) O.
Neisseria gonorrhoeae
Gonococului este capabil să îşi modifice structurile de suprafaţă „in vitro” (probabil şi „in vivo”),
evitând mecanismele de apărare ale gazdei. Structuri antigenice:
- pilii, cu rol în ataşarea de celulele gazdei, care protejează gonococul faţă de fagocitoză şi au o
structură proteică. Există şi pili cu rol în procesul de conjugare genetică;
- mai multe tipuri de proteine, spre exemplu porinele (proteina I), care formează pori la
suprafaţa celulei bacteriene. Fiecare tulpină prezintă un tip de porină, dar porinele diferă de la
o tulpină la alta. Această structură este utilă pentru serotiparea gonococilor. Proteina II (OPA)
este identificată la tulpinile care produc colonii opace şi este utilă pentru aderarea gonococului.
- proteina care leagă fierul (iron binding protein) este similară ca greutate cu porinele; se
exprimă atunci când aportul de Fe este insuficient;
- adezina
- proteina Rmp, localizată la suprafaţa membranei externe; are secvenţe care prezintă omologie
parţială cu proteine identificate la Shigella dysenteriae sau E. coli; anticorpii anti-Rmp pot fi puşi
în evidenţă la pacienţi sau convalescenţi cu gonoree, la nivel sanguin sau în secreţiile genitale;
- IgA1 proteaza;
- pseudo-capsula din polifosfat;
- proteine de stres asemănătoare proteinelor de şoc termic
Sunt prezente anumite plasmide implicate în rezistenţa la antibioticele beta-lactamice.

Gonoreea apare adesea în cadrul coinfecţiei cu HIV. LOZ induce imunitatea înnăscută legându-
se de TLR4. S-au investigat efectele LOZ din 5 tulpini diferite de Neisseria gonorrhoeae asupra
infecţiei HIV şi a provirusului din macrofage. Macrofagele care conţineau LOZ au devenit
rezistente la infecţia HIV şi la provirus.
Neisseria meningitidis
În cazul meningococului, pe lângă LOZ mai este important de menţionat structura capsulară,
care permite subdivizarea speciei în 13 serogrupuri. Atât pilii, cât şi tipurile de proteine
menţionate mai sus sunt prezente şi în cazul meningococului (piline de clasa I şi II, porine de
clasa 1, 2 şi 3, proteina Rmp, proteina OPA de clasă 5 etc).
19
RĂSPUNS IMUN
În infecţiile cu gonococ apare un răspuns imun, dar datorită fenomenelor prezentate mai sus,
practic nu există imunitate postinfecţioasă; aceeaşi persoană poate face infecţii repetate.
În cazul meningococului, imunitatea este asociată cu prezenţa serică a anticorpilor anti-

capsulari, anti-lipooligozaharid şi anti-membrană externă, care apar după infecţii subclinice.
Nou-născuţii sunt în general protejaţi datorită anticorpilor de tip IgG proveniţi de la mamă.
Infecţiile meningococice reprezintă o problemă în special pentru persoanele care au un deficit
al sistemului complement (mai ales componentele C6-C9).
LCR conţine molecule implicate în imunitatea înnăscută (ex. sistemul complement), molecule
esenţiale în controlul infecţiei şi în activarea infiltrării cu fagocite (neutrofile, monocite). Totuşi,
celulele epiteliale ale stratului ependimal care intră în structura tubului neural sau ale plexului
coroid ar putea fi foarte vulnerabile la atacul citotoxic şi citolitic al componentelor
complementului.
Anumite defecte ale sistemului complement au fost asociate cu o creştere a incidenței infecţiilor
cu Neisseria meningitidis. S-au făcut teste în acest sens şi s-a recoltat sânge şi ser de la pacienţi
adulţi care aveau deficit complet de C2 sau C5. Pacienţii aveau de asemenea deficit de mannose-
binding lectin (MBL). Proliferarea meningococilor introduşi în sânge a fost evaluată prin
numărul de CFU (colony-forming unit) şi prin Real-time PCR. S-a investigat activitatea
bactericidă serică şi cea opsono-fagocitică a granulocitelor incluzând ser inactivat termic
postvaccinare pentru a evalua influenţa anticorpilor antimeningococici
Imunitatea adaptativă este pilonul cel mai important. Ţesutul limfoid asociat nazofaringelui
(NALT) este locul principal al răspunsului imun. LTCD4+ interacţionează în cele din urmă cu
LB şi duc la secreţie de IgA şi IgG. IgA facilitează clearance-ul microciliar, aglutinarea
patogenilor şi împiedicarea adeziunii epiteliale precum şi neutralizarea toxinelor secretate.
În cazul ambelor microorganisme, patogenitatea se datorează existenţei factorilor care

permit ataşarea de celulele gazdei, multiplicării la poarta de intrare şi respectiv capacităţii de
invazivitate. Prezenţa capsulei şi a lipooligozaharidului contribuie în mod diferenţiat (mai
important în cazul meningococului) în patogenia bolilor produse.
Pentru câteva detalii, luăm în discuție Neisseria meningitidis unde aderarea are loc la nivelul
nazofaringelui. Acest prim pas este mediat de pili. Aceştia se leagă de o proteină reglatoare a
complementului de pe membrana celulară, CD46. Pilii duc la modificări post-transcripţionale.
În cele din urmă, glicozilarea acestora poate accelera detaşarea bacteriană de pe suprafaţa celulei
unde deja s-au format colonii. Prin alterearea acestui mecanism, de adeziune, bacteriile scapă
din agregate şi pot disemina şi forma noi agregate în noi locuri.
Vom lua drept exemplu infecția cu N. meningitidis. În timpul invaziei, meningococul se
localizează preferenţial în capilarele cerebrale unde viteza de curgere a sângelui este redusă, la
fel ca în capilarele din nazofaringe, viteza căreia trebuie sa îi reziste în timpul colonizării. De
asemenea, el trebuie să reziste şi forţelor mecanice, mucusului, răspunsului inflamator şi tusei.
Prin intermediul anumitor structuri pe care le deține, meningococul duce la polimerizarea
actinei şi auto-protecţie (formarea unor structuri de protecție). În plus, meningococii formează
la suprafaţa celulei biofilme alcătuite din lipide şi polizaharide (evitând astfel contactul cu
sistemul imun). Procesul poate continua pe 2 căi: transcelulară sau paracelulară. Nu doar LOZ
este util în aderare, dar şi proteinele Opa şi Opc. Opc se leagă de proteinele matrixului
extracelular, precum vibronectina. Opa se leagă de moleculele de adeziune celulară a antigenului
carcinoembrionar, de heparan sulfat şi integrine. O altă moleculă cu o importanţă foarte mare
este TspA (T-cell stimulating protein A) care duce la proliferarea LT și LB. Nu este cunoscut
20
bine mecanismul de acțiune. Luând în discuție capsula, portajul este favorizat de pierderea
capsulei (aceasta inhibă aderenţa şi formarea biofilmului), în schimb, în cursul procesului
infecțios prezența capsulei este necesară.
Neisseria gonorrhoeae
Infecţiile gonococice continuă să reprezinte o problemă importantă de sănătate publică inclusiv

în ţările cu o economie dezvoltată. Acest fapt se datorează şi apariţiei / răspândirii tulpinilor de
gonococ rezistente la antibiotice/chimioterapice şi existenţei unui număr important de infecţii
asimptomatice (în special la femei).
După pătrunderea în organismul receptiv, în funcţie de calea de transmitere, gonococul se
ataşează de mucoase (genito-urinară, oculară, rectală, faringiană etc.) şi produce, local, o
supuraţie acută. În timp poate apărea invazia tisulară şi în consecinţă, instalarea unor fenomene
inflamatorii cronice şi apariţia fibrozei (în special în cazurile netratate).
La bărbaţi apare, de regulă, uretrita gonococică (manifestată prin secreţie galben-verzuie,
cremoasă, însoţită de usturimi şi dureri la micţiune); în lipsa tratamentului, aceasta poate afecta
prin invazie epididimul şi prin fibroză poate determina apariţia stricturilor uretrale.
În cazul sexului feminin, gonoreea se localizează endocervical, dar se poate extinde la nivelul
uretrei, vaginului, glandelor Bartholin, trompelor uterine (în ultimul caz, cu posibilitatea
apariţiei unor fibroze şi obstrucţii care conduc la sterilitate). Dacă mama are gonoree şi nou-
născutul se naşte pe cale naturală, va apărea oftalmia gonococică (prevenită de ex. prin
instilaţii cu soluţie de nitrat de Ag 1% în sacul conjunctival).
Rareori gonococul poate disemina pe cale sanguină (bacteriemie), cu apariţia unor leziuni
dermice, artrite, tenosinovite gonococice etc.
Neisseria meningitidis
Meningococul poate produce şi alte infecţii, dar este important de menţionat că reprezintă una
din primele trei cauze de meningită infecţioasă la adulţi (alături de Haemophilus influenzae şi
Streptococcus pneumoniae). Contagiozitatea este mare, dar se estimează că meningita
meningococică apare la 1/1.000 din persoanele contaminate.
În producerea meningitei sunt implicate succesiv colonizarea mucoasei respiratorii (portaj = o
relaţie de comensalitate între bacterie şi gazdă, fără ca gazda să prezinte vreun semn sau
simptom care să ne ducă cu gândul la patologie), invazia locală, bacteriemia (favorizată de
prezenţa capsulei), invazia meningeală, alterarea barierei hemato-encefalice, inflamaţia în
spaţiul subarahnoidian şi creşterea presiunii intracraniene. Apariţia vasculitei cerebrale şi
scăderea fluxului sanguin la nivel cerebral reprezintă factori de agravare. Activarea mai multor
cascade inflamatorii (în special datorită eliberării unor cantităţi importante de endotoxină) pot
conduce la instalarea unui sindrom de coagulare intravasculară diseminată şi la o evoluţie
nefastă spre deces.
DIAGNOSTIC DE LABORATOR - GONOREE
Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct) atât în gonoree cât şi în meningita

meningococică, dar trebuie să fie orientat de examenul clinic.
Trebuie să se realizeze respectând regulile cunoscute (cât mai aproape de debutul bolii, înainte
ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor
utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie etc). La bărbat se prelevează secreţia
uretrală (eventual „picătura matinală”), iar la femeie recoltarea trebuie efectuată pe masă
ginecologică de la nivelul colului uterin şi glandelor Bartholin. Secreţiile au de obicei un
21
aspect purulent. Este de preferat cultivarea imediat, pe medii de cultură potrivite şi în
atmosferă de CO2. În cazul în care p.p. urmează a fi transportat către laborator, transportul
trebuie realizat fără întârziere (la o temperatură apropiată de 37°C). Chiar şi în cazul utilizării
mediilor de transport (ex. mediul Amies plus cărbune activat), acesta nu ar trebui să dureze
mai mult de 6 ore. Gonococul ar putea fi izolat şi prin hemocultură, cultivarea secreţiilor
conjunctivale, faringiene, cultivarea urinei etc. În cazul în care nu există nici o secreţie, se poate
utiliza urina care trebuie centrifugată şi însămânţată imediat pe medii de cultură.
2. Examinarea microscopică
examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează prezenţa celulelor, a celulelor
inflamatorii (ex. leucocite) şi prezenţa cocilor Gram-negativi, dispuşi în diplo, reniformi,
imobili, înconjuraţi de o structură capsulară comună, situaţi intra sau extraleucocitar. Aspectul
microscopic este acelaşi ca şi în urmă cu aproape 130 de ani.
3. Cultivarea pe medii de cultură

Se realizează în aşa fel încât să se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care
se va identifica. Gonococii sunt germeni pretenţioşi, care nu se dezvoltă pe medii simple, sunt
aerobi, facultativ anaerobi. Se pot utiliza medii selective (ex. medii în care se include
vancomicină, colistin, trimetoprim şi nistatin) sau neselective (ex. mediul GC, geloză-sânge sau
geloză-chocolate cu diferite suplimente nutritive; se recomandă utilizarea pulberii de
hemoglobină şi nu a sângelui proaspăt). Este preferată cultivarea „în dublu”, pe medii selective
şi neselective; în cazul în care p.p. este reprezentat de secreţie de la nivelul rectului sau de
secreţie faringiană se vor folosi numai medii selective. Este necesară o atmosferă de 3-10%
CO2, la o temperatură de 35-37°C. Coloniile apar în 24-48 de ore. Gonococul produce colonii de
tip S, cu dimensiuni de 0,5-1 mm sau colonii de tip M, nepigmentate, transparente sau opace.
Este de remarcat faptul că în aceeaşi placă pot apărea până la cinci tipuri de colonii (T1-T5), ceea
ce poate facilita identificarea. Placa este eliminată în cazul în care nu se dezvoltă colonii, după
72 de ore.

· Caractere morfotinctoriale: coci Gram-negativi, dispuşi în diplo, reniformi, imobili,
eventual înconjuraţi de o structură capsulară comună, nesporulaţi
· Caractere de cultură: coloniile de gonococ sunt de tip S sau M
· Caractere biochimice: metabolizează diferiţi carbohidraţi, activitate care poate fi utilă în
identificare. Gonococul metabolizează glucoza dar nu şi maltoza. Produc citocrom-oxidază, un
test cheie în identificare.Testul catalazei (superoxol) este intens pozitiv. Auxotipia evaluează
necesităţile nutriţionale ale gonococului.
· Caractere antigenice: în funcţie de structura lipooligozaharidului există 6 serotipuri.
Gonococii pot exprima simultan mai multe structuri antigenic diferite, ceea ce creează probleme
tehnice. Aceste testări se realizează în centre de referinţă.
Prezenţa gonococului poate fi detectată direct în produsul patologic prin coaglutinare sau
printr-o tehnică imunoenzimatică, ELISA (cu Ac policlonali). Se pot utiliza Ac monoclonali
cunoscuţi, pentru identificare gonococului prin tehnica imunofluorescenţei directe.
· Caractere utilizate în tiparea (tipizarea) tulpinilor izolate sau direct pentru p.p.:
există diferite tehnici (imunologice, biochimice, de biologie moleculară) care sunt practicate
numai în centrele de referinţă.
· Metodele biologiei moleculare au atât o specificitate cât şi o sensibilitate foarte bună;
se pot utiliza fie pornind de la culturi fie de la p.p.
- Sondele nucleotidice (ADN) pot hibridiza cu ARNr extras din celulele microbiene.
22
- PCR
- LCR (Ligase Chain Reaction); această metodă se poate utiliza pornind de la urină sau de la
secreţii vaginale dar are un dezavantaj - costul.
5. Antibiograma (testarea sensibilităţii tulpinilor izolate în vederea stabilirii tratamentului)

este recomandată şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice (mediul utilizat este GC
suplimentat nutritiv dar fără pulbere de hemoglobină). Au fost identificate tulpini rezistente la
penicilină (fie datorită unui plasmid care codifică o β-lactamază de tipul TEM, fie datorită unor
mutaţii cromozomiale). Este necesară testarea producerii de β-lactamază (de ex. folosind discuri
cu nitrocefin). Determinarea CMI se poate realiza prin metode clasice sau cu ajutorul testului E.
DIAGNOSTIC DE LABORATOR – MENINGITĂ MENINGOCOCICĂ
Trebuie să se realizeze respectând regulile cunoscute (cât mai aproape de debutul bolii, înainte
ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor
utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie etc). Aşa cum am menţionat,
recoltarea LCR prin puncţie (după verificarea presiunii din artera centrală a retinei prin
examinarea fundului de ochi) trebuie făcută pe cât posibil la patul bolnavului, având la dispoziţie
tot ce este necesar pentru pregătirea frotiurilor, cultivarea pe diferite medii de cultură,
repartizarea unei cantităţi de LCR pentru examenul citologic şi biochimic. LCR poate fi purulent.
În cazul în care p.p. urmează a fi transportat către laborator, transportul trebuie realizat fără
întârziere (la o temperatură apropiată de 37°C). Meningococul ar putea fi izolat şi prin
hemocultură, cultivarea secreţiilor nazale sau faringiene etc. Prezenţa meningococului poate fi
detectată direct în produsul patologic prin latex aglutinare, coaglutinare sau
contraimunoelectroforeză utilizând seruri polivalente anti - A, C, Y, W-135 şi respectiv seruri
monovalente anti - B (care pot fi utile şi în identificarea „încrucişată” a antigenului K1 al E. coli).
corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. Dacă LCR este
franc purulent, frotiurile se pot executa direct din p.p., în caz contrar realizăm iniţial
centrifugarea LCR. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează
prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite) şi prezenţa cocilor Gram-negativi, dispuşi în
diplo, reniformi, imobili, înconjuraţi de o structură capsulară comună, situaţi intra sau
extraleucocitar.

Meningococii sunt germeni pretenţioşi, care nu se dezvoltă pe medii simple, sunt aerobi,
facultativ anaerobi. Se pot utiliza medii selective (ex. medii în care se include vancomicină,
colistin, trimetoprim şi nistatin) sau neselective (ex. Mueller-Hinton, geloză-sânge sau geloză-
chocolate) pe care formează colonii de tip S sau de tip M. Este necesară o atmosferă de 3-5%
CO2, la o temperatură de 37°C.

· Caractere morfotinctoriale: coci Gram-negativi, dispuşi în diplo, reniformi, imobili,
înconjuraţi de o structură capsulară comună, nesporulaţi.
· Caractere de cultură: Coloniile de meningococ sunt de tip S, cu dimensiuni de circa 1-2
mm. Tulpinile încapsulate (ex. grupele A, C) pot conduce la apariţia unor colonii de tip M.
23
· Caractere biochimice: metabolizează diferiţi carbohidraţi, activitate care poate fi utilă în
identificare. Spre exemplu meningococul metabolizează atât glucoza cât şi maltoza. Produc
citocrom-oxidază, un test cheie în identificare.
· Caractere antigenice: în funcţie de structura lipooligozaharidului există 12 serotipuri. Cel
mai important determinant antigenic este capsula polizaharidică. Structura capsulară permite
subdivizarea speciei în 13 serogrupuri. Dintre acestea mai importante sunt grupele: A, B, C, Y şi
W-135. Prezenţa meningococului poate fi detectată direct în produsul patologic prin latex
aglutinare, coaglutinare sau contraimunoelectroforeză utilizând seruri polivalente anti -A, C, Y,
W-135 şi respectiv seruri monovalente anti-B (se pot detecta 0,02-0,05 mg de Ag / ml). De notat
posibilitatea unei reactivităţi încrucişate faţă de Ag grupului B, respectiv Ag K1 de la E. coli.
· Caractere utilizate în tiparea (tipizarea) tulpinilor izolate: există diferite tehnici
(imunologice, electroforetice, de biologie moleculară) care sunt practicate numai în centre de
referinţă. Utilizarea PCR are o sensibilitate şi specificitate de circa 91%; foarte utilă la pacienţii
pentru care s-a iniţiat deja antibioticoterapia.
5. Antibiograma (testarea sensibilităţii tulpinilor izolate în vederea stabilirii tratamentului)

este recomandată şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. Majoritatea tulpinilor
de meningococ au rămas sensibile la penicilină. Totuşi, realizarea antibiogramei poate fi utilă,
orientând continuarea tratamentului. În cazul unor infecţii grave antibiograma trebuie să fie
însoţită de alte determinări.
5. ENTEROBACTERIACEAE – generalități
DEFINIȚIE + ÎNCADRARE
Familia Enterobacteriaceae cuprinde un număr foarte important de genuri şi specii de

microorganisme semnificative din punct de vedere medical. Această familie reprezintă probabil
cea mai larg reprezentată grupare taxonomică, intens studiată, atât din punct de vedere al
microbiologiei fundamentale cât şi datorită implicaţiilor practice, clinice. Familia
Enterobacteriaceae cuprinde peste 40 de genuri de microorganisme semnificative din punct de
vedere medical şi peste 150 de specii (în cazul în care nu luăm în considerare clasificarea genului
Salmonella în peste 2.390 de specii).
CARACTERE GENERALE
1. Habitat
Enterobacteriile se pot găsi în apă, pe sol, pe plante sau pot coloniza în mod normal intestinul
omului şi animalelor. Peste 90% din flora intestinală normală umană este formată de germeni
anaerobi. Unele dintre genuri (Shigella, Salmonella, Yersinia) cuprind specii patogene pentru
om, în timp ce altele (Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Proteus etc) cuprind specii saprofite
sau condiţionat patogene (cu excepţia anumitor tulpini, patogene) şi se găsesc în flora normală
gastrointestinală, sau de ex. în flora tractului respirator superior.
2. Morfologie
Sunt bacili Gram-negativi (multe dintre specii având o dimensiune de aproximativ 2-3 / 0,6μm),
cu capete rotunjite, care nu se pot diferenţia prin microscopie optică, mobili cu cili peritrichi
(ex. Salmonella spp, Proteus spp.), sau imobili (ex. Shigella spp., Yersinia pestis, Klebsiella spp.),
nesporulaţi; unele specii pot prezenta capsulă (ex. Klebsiella pneumoniae).
24
3. Caractere biochimice și caractere de cultură
Sunt germeni nepretenţioşi care se pot multiplica pe medii simple, aerobi facultativ anaerobi,
utilizează fermentativ glucoza cu sau fără producere de gaz, sunt oxidază-negativi, catalază-
pozitivi, reduc nitraţii la nitriţi, se pot cultiva pe medii obişnuite formând colonii de tip S, R
(„vechi”) sau M (pentru speciile capsulate), pot fermenta (ex. Escherichia coli, Klebsiella spp.)
sau nu lactoza (ex. Salmonella spp., Shigella spp.).
4. Structura antigenică
Lipopolizaharidul (LPZ) caracteristic microorganismelor Gram-negative este format din:
- lipidul A, responsabil pentru activitatea toxică, format din unităţi dizaharidice de

glucozamină fosforilată de care se ataşează acizi graşi cu lanţ lung de atomi de carbon (ex. acidul
β-hidroximiristic), care este prezent la toate enterobacteriile şi care se găseşte în natură numai
în această structură particulară, lipidul A. De lipidul A se ataşează:
- polizaharidul format dintr-un miez (core) similar la toate bacteriile Gram-negative şi o
serie de unităţi terminale repetitive care diferă de la specie la specie (antigenul O). Antigenul
O este termostabil, rezistent la alcool. Poate fi detectat prin reacţii de aglutinare cu antiseruri
specifice. Antigenul O este asimilat cu termenul de endotoxină. Formele „R” sintetizează un LPZ
care nu conţine elementele repetitive ale polizaharidului O, caracteristice culturilor „S”.
Faţă de antigenul O apar în special anticorpi din clasa IgM. Fiecare gen cuprinde antigene
O specifice, dar un microb poate avea mai multe structuri antigenice diferite, de exemplu:
- pot exista antigene O comune la E. coli, Shigella;
- pot exista reacţii încrucişate între E. coli, Klebsiella, Providencia, Salmonella;
- anumite structuri antigenice O de la E. coli reacţionează încrucişat cu structuri antigenice
izolate de la genul Vibrio, cu structuri antigenice de grup sangvin sau alte antigene de suprafaţă
de la celulele animale.
Antigenul H este de natură proteică; denaturat de alcool (50°) şi de temperatură (70°C). Este
localizat la nivelul flagelilor (nu există la speciile imobile). Are antigenicitate mai mare decât
antigenul O (dominant); de aceea, pentru a putea apărea combinaţia cu antigenul O, în anumite
situaţii, antigenul H trebuie denaturat în prealabil. Antigenul H poate fi detectat prin reacţii de
aglutinare cu antiseruri specifice (în special cu anticorpi din clasa IgG). Anticorpii anti-H
imobilizează bacteria, atenuând virulenţa microorganismelor mobile, fiind probabil cauza
apariţiei variaţiei de fază la Salmonella. Variaţia de fază este proprietatea bacteriei de a altera
exprimarea unui anumit tip de antigen flagelar.
Antigenul K se situează extern faţă de antigenul O, la bacteriile capsulate. Este un antigen

polizaharidic, parţial stabil la temperatură. Dacă este organizată o structură capsulară,
aglutinarea cu antigenul O va fi inhibată. Au fost identificate şi structuri asemănătoare
antigenului tipic capsular; spre ex. la E. coli există antigenul K1. Antigenul K este implicat şi în
patogenitate, favorizând rezistenţa la fagocitoză a bacteriei şi contribuind la invazivitate.
La Salmonella typhi există în mod suplimentar antigenul Vi (de virulenţă) care face parte din
antigenele „de înveliş” ale acestei bacterii, are structură polizaharidică şi este implicat în
scăderea complementului seric, leucopenie, capacitatea de multiplicare intramacrofagică. Poate
„masca” antigenul O, acoperindu-l. Antigenul Vi se poate identifica prin reacţii de aglutinare cu
antiseruri specifice.
25
Unele enterobacterii elaborează şi exotoxine, spre exemplu toxina shiga produsă de Shigella
dysenteriae tipul 1, verotoxina produsă de E. coli O157:H7 etc. Majoritatea enterobacteriilor
prezintă fimbrii, de natură proteică (există 6 tipuri de fimbrii); unele enterobacterii prezintă şi
proteine filamentoase (ex. E. coli) care par să aibă rol în patogenitate.
CARACTERE DE PATOGENITATE
Adezinele
Toate bacteriile Gram-negative prezintă fimbrii (pili), indispensabili pentru aderarea de
mucoase, acesta fiind primul pas în vederea colonizării şi multiplicării iniţiale.
Toxinele
a) Exotoxinele: toxina Shiga (Shigella shiga), toxina Shiga-like (la Shigella şi la unele tulpini de
E. coli), toxina LT (termic labilă) la E. coli (asemănătoare cu exotoxina vibrionului holeric) etc.
Ar mai fi de menţionat existenţa unor citotoxine produse de E. coli care sunt alfa-hemolizine
(exotoxine); beta-hemolizinele rămân legate de celulă şi inhibă fagocitoza şi chemotaxia
leucocitelor.
b) Endotoxinele (Antigen O) sunt incluse în peretele tuturor germenilor Gram-negativi,
putând determina în cazul unei eliberări masive (distrugerea brutală a unui număr mare de
bacterii) şocul endotoxic. Administrarea experimentală a lipopolizaharidului la animal
determină febră, leucopenie, trombocitopenie, CID (coagulare intravasculară diseminată),
activarea sistemului complement şi eliberarea de substanţe vasoactive proinflamatorii.
Achiziţia de fier
O serie de enterobacterii sintetizează o componentă care are capacitatea de a chela fierul
(siderofor), complexul format fiind apoi recaptat de către bacterie (de exemplu, aerobactina de
la E. coli).
Structurile capsulare
Antigenele de tip K ale E. coli au structură proteică şi sunt importante în colonizare; diminuă
opsonizarea şi fagocitoza. Antigenul K1 este un polimer al acidului N-acetil-neuraminic. Este
similar cu structuri proprii gazdei şi este slab imunogen.
Klebsiella prezintă un antigen K (şi respectiv o capsulă) bine reprezentat.
Antigenul Vi de la Salmonella typhi acoperă (maschează) antigenul O şi are importanţă în
invazivitate.
Plasmidele
Transmit atât informaţii genetice legate de rezistenţa la antibiotice (factor R) cât şi pentru
virulenţă.
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR - COPROCULTURA

Infecţiile enterobacteriene sunt destul de variate. Pot fi localizate la nivel digestiv (dizenterie şi
sindroame asemănătoare dizenteriei, sindroame asemănătoare holerei, toxi-infecţii alimentare
etc), la nivelul tractului urinar, la nivelul aparatului respirator sau la nivelul sistemului nervos.
Infecţiile enterobacteriene pot avea şi alte localizări sau pot fi generalizate (de ex. în febra tifoidă,
febrele paratifoide, pestă). În majoritatea infecţiilor produse de enterobacterii diagnosticul este
bacteriologic, direct. În febra tifoidă diagnosticul poate fi atât bacteriologic cât şi imunologic
(serologic).
Datorită faptului că în multe dintre aceste infecţii produsul patologic este reprezentat de către
materiile fecale, în continuare vom discuta examenul bacteriologic al materiilor fecale.
Coprocultura
26
În multe dintre infecţiile produse de enterobacterii, care se manifestă prin sindrom diareic,
utilizăm coprocultura. În cele ce urmează vom discuta coprocultura în general, nu numai din
punctul de vedere al unei infecţii enterobacteriene.
Boala diareică acută
Boala diareică acută (BDA) a fost şi rămâne o entitate patologică foarte răspândită la nivel
mondial. Sindromul diareic include eliminarea a peste 3 scaune în 24 de ore iar scaunele au
consistenţa diminuată (până la emiterea unor scaune apoase, cu pierderea a până la 20-30 litri /
zi în holeră). Materiile fecale pot avea aspect patologic (apos, mucos, purulent, sanguinolent
etc), culoare modificată, miros particular etc. De regulă sindromul diareic asociază şi alte semne
şi simptome digestive (dureri abdominale, tenesme, greaţă, vărsături etc) sau generale (febră,
stare generală alterată etc). Foarte important şi obligatoriu de reţinut este că BDA duce la
pierderi de apă şi electroliţi iar intervenţia cea mai importantă care trebuie avută în vedere este
reechilibrarea hidroelectrolitică.
Agenţi etiologici
Boala diareică acută poate fi de etiologie infecţioasă şi neinfecţioasă. Marea majoritate a BDA
infecţioase au etiologie virală.
Etiologia bacteriană include: Salmonella spp, Shigella spp, Escherichia coli, Klebsiella spp, alte
enterobacterii (Yersinia enterocolitica, Citrobacter spp., Proteus spp. etc, Vibrio cholerae şi alţi
vibroni, alţi bacili gram negativi (Aeromonas spp., Alcaligenes spp., Pseudomonas spp. etc),
Bacillus cereus, Campylobacter jejuni , Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium
botulinum, Staphylococcus aureus etc
Etiologia fungică include: Candida albicans (la pacienţi cu SIDA) etc
Etiologia parazitară include: Giardia lamblia, Trichinella spiralis, Cryptosporidium parvum etc
Etiologia virală include: rotavirusurile, coronavirusurile, enterovirusurile, adenovirusurile etc.
Gruparea agenţilor etiologici în funcţie de mecanismul patogenic

Atât din punct de vedere diagnostic cât şi pentru tratament poate fi importantă elucidarea
tipului de mecanism implicat. Astfel, BDA ar putea fi produse prin:
· mecanism neinflamator, atunci când din punct de vedere microscopic în preparatul între
lamă şi lamelă nu se evidenţiază leucocite (ex. BDA produse de Vibrio cholerae, ETEC,
Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Giardia lamblia, rotavirusuri, virusuri Norwalk,
Cryptosporidium parvum etc)
· mecanism inflamator, atunci când din punct de vedere microscopic în preparatul între
lamă şi lamelă se evidenţiază leucocite polimorfonucleare (ex. BDA produse de Shigella spp.,
EIEC, Salmonella enteritidis, Vibrio parahaemolyticum, Entamoeba hystolitica etc)
· mecanism de “penetrare”, atunci când din punct de vedere microscopic în preparatul
între lamă şi lamelă se evidenţiază leucocite mononucleare (ex. BDA sau sindrom diareic produs
de Salmonella typhi, Yersinia enterocolitica etc).
După cum se poate remarca, simpla recoltare a produsului patologic urmată de realizarea unui
preparat nativ şi examinarea microscopică a acestuia pot da informaţii importante cu privire la
etiologia probabilă precum şi atitudinea terapeutică de urmat. Este evident că într-o BDA pentru
care agenţii etiologici sunt virali sau mecanismul patogenic include acţiunea unei toxine este
contraindicată administrarea de antibiotice sau chimioterapice antibacteriene.
Indicaţiile coproculturii în bacteriologie
· atunci când este suspicionată o infecţie cu Shigella spp., Vibrio cholerae, E. coli (tipurile
patogene), Campylobacter spp., Yersinia enterocolitica sau Salmonella spp. în special la pacienţi
cu vârste extreme sau imunodepresie
· după circa 1 săptămână de la debutul febrei tifoide etc
· atunci când BDA prezintă riscul extinderii la nivelul unei colectivităţi (creşe, grădiniţe,
tabere, unităţi de alimentaţie publică, staţii de distribuţie a apei potabile etc)
27
· atunci când BDA apare la pacienţi care au fost trataţi cu antibiotice iar sindromul diareic
persistă şi după întreruperea antibioticoterapiei
· atunci când sindromul diareic persistă mai mult de o săptămână sau are loc o recădere
· în scopul verificării stării de sănătate a persoanelor care lucrează în unităţi de alimentaţie
publică (conform normativelor stabilite de către ministerul sănătăţii)
· în scop de cercetare etc.
Recoltarea şi transportul materiilor fecale
Se pot recolta şi examina:
· scaunul emis spontan reprezintă produsul patologic utilizat cel mai frecvent. Defecaţia are
loc într-un recipient de carton sau într-un container din material plastic de unică întrebuinţare
(care poate fi apoi decontaminat şi eliminat fără probleme). În acelaşi timp efectuăm şi
examinarea macroscopică a p.p. din punctul de vedere al mirosului, culorii sau aspectului.
Utilizăm pentru prelevare linguriţa recoltorului alegând porţiuni care permit cu o mai mare
şansă izolarea agentului patogen (fragmente mucopurulente, porţiuni cu sânge, flocoane
riziforme etc) sau porţiuni diferite dintr-un scaun în care nu se remarcă aspectele menţionate
anterior. Prelevăm o cantitate de aproximativ 1 gram pe care o suspensionăm în mediul de
transport (minim 2 ml în cazul scaunelor apoase).
· tamponul rectal este recomandat în cazul unei infecţii cronice cu Shigella spp., atunci când
suspicionăm portajul de Shigella spp. sau Salmonella spp. Tamponul steril se introduce cu
blândeţe şi se prelevează secreţiile de la nivelul mucoasei rectale, prin rotire, pentru a recolta
material din criptele rectale. Apoi introducem. tamponul în mediul de transport. Pentru a putea
închide recoltorul, tăiem în mod corespunzător tija tamponului.
· sonda Nelaton se poate utiliza atunci când urmărim recoltarea p.p. de la nivelul colonului
sigmoid. Introducem cu blândeţe sonda până la nivelul dorit (circa 10-12 cm la copil şi respectiv
circa 15-20 cm la adult), adaptăm la celălalt capăt al sondei o seringă şi aspirăm p.p.de la nivel
sigmoidian. Introducem p.p. în mediul de transport.
În cazul în care p.p. nu poate fi prelucrat imediat sau în maxim 1 oră, utilizăm un mediu
de transport, transportul la rece (+4º C) sau transportul în mediu de transport menţinut la 4º C.
Cel mai frecvent utilizăm mediul Cary-Blair. Acest mediu asigură supravieţuirea
enterobacteriilor patogene timp de 24-48 de ore, inhibând în acelaşi timp multiplicarea florei de
asociaţie. Atunci când este suspicionată infecţia cu V. cholerae, apa peptonată alcalină serveşte
în acelaşi timp drept mediu de transport şi mediu de îmbogăţire.
Examinarea materiilor fecale

Materiile fecale sunt examinate macroscopic şi microscopic. Din punct de vedere microscopic,
de fiecare dată se vor realiza preparate native (între lamă şi lamelă). Materiile fecale sunt
suspensionate într-o picătură de lugol sau de albastru de metilen 1% iar preparatul se va examina
iniţial cu obiectivul 10´, apoi cu obiectivul 40´. Spre exemplu, evidenţierea a peste 40 PMN /
câmp, însoţite de macrofage şi hematii, conduce la suspicionarea unei dizenterii bacteriene.
Frotiurile colorate pot fi utile în suspicionarea diagnosticului de enterocolită cu Campylobacter
spp. sau al colitei pseudomembranoase, post antibioticoterapie.
Cultivarea materiilor fecale

În mod obişnuit, pentru cultivare vom utiliza 3 medii diferite, respectiv o eprubetă cu bulion
selenit acid de sodiu şi 2 plăci Petri, una cu mediu cu selectivitate scăzută (ex. Mac Conkey) şi
alta cu mediu cu selectivitate medie (ex. ADCL sau XLD). Aceste medii selective sunt în acelaşi
timp şi medii diferenţiale.
Alegem fragmente caracteristice din p.p. (mucus, puroi etc) şi însămânţăm 2-3 anse în
mediul cu bulion selenit (mediu de îmbogăţire în special pentru Salmonella spp.). Realizăm o
suspensie omogenă în mediul lichid. Prelevăm o ansă (sau o picătură) din suspensie şi o
depunem pe mediul MacConkey. Întindem p.p. în striuri paralele pe o jumătate de placă, până
28
aproape de marginile plăcii fără să le atingem. Fără să sterilizăm ansa, atingem ultimile 3-4 striuri
şi dispersăm p.p. în alte striuri paralele, perpendiculare pe primele, pe jumătate din mediul
disponibil, până aproape de marginile plăcii fără să le atingem. Atingând din nou ultimele 3-4
striuri, dispersăm p.p. în mod similar pe mediul încă neînsămânţat. Incubăm timp de 18-24 de
ore la 35-37º C. În ziua următoare, pornind de la tubul cu bulion selenit însămânţăm aşa cum am
menţionat mai sus o placă cu MacConkey şi o placă cu ADCL (sau XLD); incubăm aceste plăci
timp de 18-24 de ore la 35-37º C. Examinăm plăcile însămânţate precedent în vederea selectării
coloniilor suspecte.
Pe mediul MacConkey coloniile lactozo-pozitive au dimensiuni de 1-3 mm, sunt roşii, pot
prezenta un halou opalescent, de regulă sunt de tip S dar pot fi şi de tip M. Coloniile lactozo-
negative au dimensiuni de 1-2 mm, nu sunt colorate, sunt transparente, de regulă sunt de tip S.
Pe mediul ADCL majoritatea bacteriilor lactozo-pozitive sunt inhibate; pot apărea tardiv colonii
de dimensiuni mai mici, roşii, de tip S. Coloniile lactozo-negative au dimensiuni de 1-2 mm, nu
sunt colorate, sunt semitransparente, de tip S; dacă produc H2S centrul coloniei este de culoare
neagră.
De regulă urmărim apariţia coloniilor lactozo-negative, iar pentru etapele de identificare
vom repica (fără a atinge mediul de cultură) 3 colonii în cazul în care pacientul este copil şi 3-5
colonii în cazul în care pacientul este adult. În cazul în care nu există colonii lactozo-negative,
pentru identificare vom repica (fără să atingem mediul de cultură) 10 colonii la copil şi respectiv
10 colonii la adult (dacă se consideră că identificarea este necesară, de ex. în izbucniri epidemice
de BDA).
Aşadar, după apariţia coloniilor izolate pe mediile selectivo-diferenţiale trecem la
identificarea speciilor implicate patogenic pe baza caracterelor morfo-tinctoriale, de cultură,
biochimice, antigenice, de patogenitate, pe baza sensibilităţii la bacteriofagi şi eventual pe baza
unor caractere moleculare. Pentru interpretare vom utiliza diferitele tabele disponibile în
tratatele de specialitate sau recomandările producătorilor în cazul utilizării unor sisteme
comerciale de diagnostic. Pentru tulpinile considerate a fi implicate patogenic vom realiza
studiul sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice, de regulă prin metode difuzimetrice
(antibiograma difuzimetrică standardizată, comparativă, E test).
6. GENUL ESCHERICHIA
CARACTERE GENERALE
Genul Escherichia, considerat genul tip pentru familia Enterobacteriaceae, cuprinde germeni
comensali care se găsesc ubicuitar (în apă, pe sol, etc). La nivelul intestinului uman au rol în
sinteza unor vitamine (simbioză). Sunt bacili Gram-negativi mobili sau imobili, aerobi facultativ
anaerobi, lactoză pozitivi. Sunt grupați în şase specii: E. coli, E. blattae, E. fergusonii, E.
hermannii, E. vulneris și E. albertii. Cu excepţia speciei E. blattae, izolată de la insecte, toate
celelalte specii de Escherichia au fost izolate din prelevate umane.
Specia tip este reprezentată de Escherichia coli.
1. Habitat
E. coli se găsește în intestinul animalelor homeoterme, inclusiv al omului, fiind considerată

componentă a florei intestinale normale. Acest rezervor primar a făcut ca E. coli să fie selectată
de Organizaţia Mondială a Sănătaţii ca indicator de poluare fecală. Studii întreprinse în ultimii
ani indică însă o mult mai mare complexitate a populaţiei genului Escherichia, ai cărui membri
pot circula şi persista autonom, în afara tractului gastrointestinal, fiind prezenţi în rezervoare
secundare din mediul ambiant.
29
2. Morfologie
Sunt bacili Gram-negativi drepţi sau uşor incurbaţi, cu capete rotunjite şi dimensiuni cuprinse
între 2-5µm / 0,5-1µm (pot avea uneori aspect filamentos, pot exista şi forme cocobacilare). În
majoritate sunt mobili, prin prezența flagelilor (în preparatele native). Unele tulpini prezintă
capsulă (antigene capsulare de tip K).
Germenii sunt aerobi, facultativ anaerobi, se dezvoltă în limite largi de temperatură şi pH.
Asemenea celorlalte enterobacterii, specia E. coli este catalază pozitivă, oxidază negativă şi
fermentează glucoza. Capacitatea majorităţii tulpinilor de E. coli de a fermenta lactoza este utilă
în diferenţierea de alte enterobacterii (ex. Salmonella, Shigella). Tipic, tulpinile de E. coli testate
pe medii de identificare biochimica precum TSI, MIU si/sau MILF nu produc H2S, produc indol
şi lizindecarboxilază, dar nu urează si fenilalanindezaminază. În plus, E. coli nu poate creşte pe
un mediu care are ca unică sursă de carbon citratul (caracter metabolic important pentru
diferenţierea de alte enterobacterii).
Germenii supravieţuiesc în mediul extern (sol, apă) luni de zile. E. coli este distrus prin expunere
la 60ºC în 30 minute. Este sensibil la acţiunea antisepticelor şi dezinfectantelor uzuale.
4. Caractere antigenice
Ca şi în cazul celorlalte enterobacterii, diversele structuri antigenice situate la suprafața

tulpinilor de E. coli servesc aşa numitei serotipizări, metodă utilă în epidemiologia infecţiilor
cauzate de aceste microorganisme. Cele trei tipuri de antigene detectate prin reacţii serologice
antigen-anticorp (ex. reacţia de aglutinare) sunt: antigenul O (somatic), antigenul H (flagelar)
și antigenul K (capsular).
Antigenul O (LPZ) a fost descris la caracterele generale ale enterobacteriilor şi defineşte
serogrupul (numerotarea grupului antigenic este de utilitate epidemiologică; ex. serotipurile
O55 şi O111 sunt implicate în izbucniri epidemice de meningită neonatală). Există peste 170 de
variante de Ag O.
În cadrul unui serogrup O, pe baza diversităţii antigenelor H (prezente numai la tulpinile
mobile, care posedă flageli) şi K (prezente la tulpinile care posedă capsulă) se definesc serotipuri.
Serogrupurile şi serotipurile se notează printr-o combinaţie de litere şi cifre (ex. O55:K59:H6).
Structurile de suprafaţă pot masca prezenţa antigenului somatic O. În majoritatea cazurilor,
tipizarea serologică a tulpinilor de E. coli se rezumă la identificarea antigenelor O şi H (ex.
O157:H7).
Anumite serotipuri sunt asociate frecvent cu sindroame clinice bine definite, dar trebuie
menţionat că nu antigenele de suprafaţă conferă virulenţă bacteriei. Cu toate acestea, definirea
serotipului poate fi sugestivă pentru identificarea unor clone virulente. Datorită faptului că au
fost identificate peste 170 de variante de antigen O, peste 50 de tipuri de antigen H, peste 90 de
tipuri de antigen de tip K şi o serie de tipuri antigenice fimbriale (antigene F), prin combinaţiile
acestora rezultă peste 1.000 de tipuri antigenice de Escherichia coli.
Unele dintre tulpinile de E. coli elaborează exotoxine. Acestea pot fi, la rândul lor,
structuri antigenice identificate in vitro prin reacţii antigen-anticorp.
RĂSPUNS IMUN
Apare un răspuns imun umoral care nu are semnificaţie nici în ceea ce priveşte protecţia faţă de
boală şi cel mai adesea nici în diagnostic.
30
Tulpinile de E. coli domină microflora facultativ anaerobă a colonului la individul
sănătos, marea majoritate întreţinând cu aceasta relaţii de simbioză benefice ambilor. Ele pot
produce infecţii în condiţiile în care gazda este imunodeprimată sau când depăşesc bariera
intestinală şi ajung în zone normal sterile.
Există însă şi tulpini de E. coli care au o virulenţa intrinsecă, putând declanşa variate
procese infecţioase la indivizii imunocompetenţi. Tulpinile patogene de E. coli sunt clasificate
în aşa numite patotipuri. Ele generează simptomatologii similare prin mecanisme de
patogenitate comune.
În prezent sunt descrise şase patotipuri de E. coli implicate în sindromul diareic
(patotipuri intestinale) şi un patotip implicat în infecţii extraintestinale (ex. infecţiile tractului
urinar, meningite, septicemii, etc.) şi denumit E. coli cu patogenitate extraintestinală (ExPEC).
Patotipurile intestinale sunt: E. coli enteropatogen (EPEC), E. coli enterotoxigen (ETEC), E. coli
enteroinvaziv (EIEC), E. coli producător de verotoxine (VTEC), E. coli enteroagregativ (EAEC)
și E. coli cu aderenţă difuză (DAEC). În cadrul patotipului VTEC se distinge, pentru a se sublinia
în principal asocierea cu manifestări clinice severe (ex. colita hemoragică), subgrupul de tulpini
de E. coli enterohemoragic (EHEC), care are ca prototip serotipul O157:H7.
Tulpinile patogene de E. coli produc factori de virulenţă, care afecteaza variatele procese
desfăşurate la nivelul celulelor gazdei (ex. sinteza de proteine, funcţia citoscheletului, diviziunea
celulară, secreţia de ioni, funcţia mitocondriilor, apoptoza etc.). Aceşti factori de virulenţă sunt
codificaţi de structuri genetice localizate în cromozom sau pe plasmide şi intervin în
mecanismele de patogenitate folosite de bacterie pentru a învinge sistemele de apărare ale
gazdei.
Adezinele sunt structuri de aderenţă aflate pe fimbrii/pili (ex. fimbriile P din tulpinile
de E. coli uropatogene, factorii de colonizare CFA din tulpinile de ETEC, etc.) sau la suprafaţa
membranei externe (ex. adezinele afimbriale Afa din tulpinile de DAEC) bacteriene. Ele
reprezintă factori de virulenţa importanţi, care permit bacteriei să colonizeze zone din
organismul uman (ex. intestin subţire, tract urinar, vagin), in care nu rezidă în mod normal.
Toxinele sunt o altă categorie de factori de virulenţă. Endotoxinele fac parte din
structura membranei externe (lipidul A din complexul LPZ) şi sunt invariabil prezente la toate
bacteriile Gram negative, nu numai la E. coli, indiferent de potenţialul lor de patogenitate.
Eliberate în urma distrucţiei peretelui bacterian îşi manifestă efectele toxice, fiind implicate în
apariţia febrei şi şocului toxic din septicemii. Exotoxinele sunt sintetizate şi secretate în cursul
metabolismului bacterian, fiind specifice nu numai speciei, ci diverselor patotipuri de E. coli. În
prezent se cunosc structura si funcţiile a numeroase toxine responsabile de patogenitatea
tulpinilor de E. coli (ex. enterotoxina termolabilă şi termostabilă produse de tulpinile ETEC,
verotoxinele 1 şi 2 sintetizate de tulpinile VTEC, enterotoxina termostabilă enteroagregativă 1 a
tulpinilor EAEC, etc.).
Multe dintre tulpinile ExPEC implicate în producerea meningitei neonatale sau a
infecţiilor urinare prezintă capsulă, o altă componentă importantă pentru patogenitatea speciei.
Rolul principal al capsulei este de a inhiba acţiunea complementului seric şi fagocitoza,
conferind astfel rezistenţă bacteriei. Antigenul polizaharidic capsular K1 este prezent în 80% din
tulpinile de E. coli izolate din cazuri de meningită neonatală.
Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu localizare digestivă
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic

Trebuie să se realizeze respectând regulile cunoscute. Produsul patologic este reprezentat de
obicei de scaunul diareic dar am putea recolta şi lichid de vărsătură sau un anumit aliment
incriminat. Materiile fecale se examinează macroscopic şi se trimit către laborator aşa cum am
menţionat în capitolul precedent. În continuare vom discuta diagnosticul unei infecţii produsă
31
de EHEC (ex. O157:H7) dar, subliniem faptul că în practica medicală, pornind de la p.p.
reprezentat de materiile fecale, putem izola orice microorganism implicat etiologic în BDA, după
caz. Materiile fecale pot avea aspect hemoragic iar la examinarea macroscopică a p.p. putem
observa prezenţa unor lambouri de mucoasă epitelială.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea preparatului nativ,

între lamă şi lamelă; remarcăm prezenţa hematiilor şi leucocitelor PMN.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se

poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica. În vederea izolării
EHEC, pe lângă mediile menţionate în capitolul precedent se recomandă utilizarea mediului
MacConkey cu D-sorbitol, deoarece spre deosebire de majoritatea tulpinilor de E. coli EHEC nu
fermentează sorbitolul (sau îl fermentează tardiv). În acest sens, coloniile suspecte, repicate (fără
a atinge mediul) în vederea identificării vor fi necolorate, cu dimensiuni de 1-3 mm, de regulă de
tip S (coloniile sorbitol-pozitive vor avea o culoare roz).

caractere:
· Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativi.
· Caractere de cultură:
· Produc colonii de tip Scu caracterele menţionate mai sus.
· Caractere biochimice (pentru EHEC se vor examina la nivelul centrului de referinţă;
procesarea unor culturi în care este prezent EHEC necesită măsuri suplimentare de siguranţă):
· Fermentează glucoza (cu producere de gaz), sunt lactozo-pozitivi, nu fermentează (sau
fermentează tardiv) sorbitolul, nu produc H2S
· Pot produce indol, sunt urează-pozitivi, mobili (dar există şi tulpini imobile) etc.
· Se pot folosi mediile multi-test convenţionale (TSI, MIU, MILF) sau galeriile multi-test API
10 S, API 20 E, API Rapid 20 E sau alte variante
· Alte teste ce pot fi studiate în scopul identificării germenilor:
· Testarea caracterelor antigenice: Ag somatice pot fi identificate prin reacţii de aglutinare
sau latex aglutinare (se pot utiliza şi seruri monovalente anti O157 şi respectiv anti H7); toxinele
pot fi identificate prin tehnici de tip ELISA, latex aglutinare, latex aglutinare pasivă inversată
(VET-RPLA), sau prin seroneutralizarea efectului citotoxic pe celule Vero
· Testarea caracterelor de patogenitate: EHEC produce enterocolită hemoragică letală la
purcel; se poate studia efectul citopatic pe celule Vero
· Teste de biologie moleculară (PCR, detectarea genelor de patogenitate pornind de la p.p.
sau de la coloniile izolate pe MacConkey cu D-sorbitol).
5. Antibiograma este recomandată de regulă numai pentru supravegherea apariţiei

fenomenului de rezistenţă la antibiotice şi chimioterapice; se realizează prin metode
difuzimetrice.
UROCULTURA
Realizarea uroculturii
Recoltarea şi transportul produsului patologic
În ITU se pot recolta urină, sânge (ex. în pielonefrita acută) sau chiar şi LCR. În continuare vom
discuta despre recoltarea şi transportul urinei.
În afară de recomandările generale menţionate anterio, trebuie să subliniem unele aspecte
particulare
· În cazul în care nu se poate recolta prima urină de dimineaţă, trebuie aşteptat pentru
recoltare 3-4 ore după micţiune
32
· Recoltarea se realizează după spălarea cu apă şi săpun a organelor genitale şi a perineului;
există recomandări specifice pentru sexul feminin şi masculin şi respectiv pentru copilul mic
· Este preferabil ca recoltarea să aibă loc într-un spaţiu corespunzător în apropiere de
laborator iar personalul medical trebuie să explice şi eventual să asiste recoltarea
· Este contraindicată recoltarea urinei la domiciliu (pot exista erori de recoltare iar
prelungirea timpului de transport va conduce la multiplicarea bacteriilor, aşa cum am menţionat
mai sus); după recoltare, în cazul în care urina nu este prelucrată imediat (sau în cel mult 30 de
minute după recoltare), p.p. trebuie menţinut la temperatura frigiderului iar transportul trebuie
realizat la +4° C
· De regulă se recoltează urina “din mijlocul jetului”; după spălarea organelor genitale şi a
perineului, prin micţiune se elimină circa 100 ml urină (îndepărtând astfel o parte a germenilor
de la nivelul uretrei distale) şi abia apoi se recoltează 20-50 ml (preferabil 50 ml) urină în
recipientul steril, după care micţiunea continuă
· Există şi alte tehnici de recoltare, neinvazive sau invazive (puncţie şi aspiraţie
suprapubiană, cateterizare uretrală, cu riscurile respective).
Examinarea macroscopică şi microscopică a urinei

Realizăm iniţial examenul macroscopic; p.p. poate fi tulbure, opalescent, poate prezenta un
anumit miros etc. În vederea examenului microscopic al urinei omogenizăm urina prin
“răsturnare”, de 2-3 ori. Punem o picătură de urină pe lamă, acoperim cu o lamelă şi examinăm
cu microscopul cu imersie (sau microscopul cu contrast de fază). În cazul în care identificăm
prezenţa a cel puţin unei bacterii pe fiecare câmp, în fiecare dintre 5 câmpuri succesive, putem
cu o bună aproximaţie să considerăm că avem o bacteriurie de 105 bacterii / ml. Alternativ se
poate utiliza preparatul colorat Gram. Este necesar să apreciem concomitent şi prezenţa piuriei
(peste 10 leucocite / mm3 de urină). Au fost imaginate o serie de alte teste pentru aprecierea
piuriei şi bacteriuriei, spre exemplu testul Griess (detectarea nitriţilor în urină), detectarea
esterazei leucocitare, teste bioluminiscente etc. Piuria şi bacteriuria trebuie interpretate în
contextul clinic.
Examenul sedimentului urinar permite vizualizarea de celule epiteliale (malpighiene, vezicale,
uretrale etc), celule sanguine (leucocite, hematii), cilindrii urinari (hialini, leucocitari,
eritrocitari, epiteliali, granulari etc), cristale urinare, levuri (eventual înmugurite, cu
blastoconidii), Trichomonas vaginalis etc; examenul sedimentului urinar este foarte util şi
trebuie realizat de fiecare dată.
Cultivarea urinei
În mod obişnuit, pentru cultivare putem utiliza 3-4 medii diferite. Din motive de economie am
putea însămânţa o jumătate de placă cu mediu MacConkey (fără cristal violet), o jumătate de
placă cu geloză-sânge şi câte un sector de placă cu mediu agar telurit şi respectiv agar cu eozină
şi albastru de metilen (EMB) în cazul în care examenul microscopic al urinei este pozitiv. Dacă
examenul microscopic este negativ, însămânţăm doar o jumătate de placă Petri cu mediu
MacConkey.
O variantă de însămânţare pentru mediile MacConkey şi geloză-sânge este utilizarea unei anse
calibrate de 1 µl cu ajutorul căreia prelevăm urină prin atingerea suprafeţei p.p. după
omogenizare. Însămânţăm iniţial un striu pe centrul jumătăţii de placă după care întindem p.p.
în striuri paralele, perpendiculare pe primul striu. În final fără sterilizăm ansa întindem p.p în
striuri paralele în unghi de 45° faţă de striurile precedente. După o incubare de 18-24 ore la 35-
37° C, înmulţind cu 1000 numărul de UFC dezvoltate, putem aprecia care este numărul de
bacterii / ml de urină.
Frecvent este utilizată însămânţarea urinei după diluare (ex. 1/100) cu ajutorul pipetei gradate.
Însămânţăm de ex. pe o placă cu mediu MacConkey 0,1 ml de urină diluată 1/100, incubăm în
condiţiile cunoscute şi după apariţia coloniilor calculăm numărul de bacterii / ml prin înmulţirea
numărului de UFC ´ inversul diluţie ´ inversul volumului însămânţat.
33
Interpretarea rezultatelor uroculturii cantitative
· Izolarea unei bacterii cu o concentraţie de peste 105 / ml de urină confirmă ITU la bărbat
sau la femeie (cu simptome caracteristice); în cazul că pacienta este asimtomatică, certificarea
ITU este dată de izolarea aceleaşi bacterii în a doua probă de urină
· Izolarea a două bacterii diferite, fiecare cu o concentraţie de peste 105 / ml de urină, impune
repetarea recoltării şi însămânţării; în cazul în care rezultatul este similar şi pentru a doua probă
de urină este posibilă ITU mixtă (în caz contrar este o foarte probabilă contaminare)
· Izolarea a trei bacterii diferite, chiar şi în cazul în care concentraţiile pentru fiecare în parte
depăşesc 105 / ml de urină, impune repetarea analizei; extrem de probabil este vorba de o
contaminare sau de un p.p. recoltat cu mai mult timp în urmă şi menţinut la temperatura
camerei şi nu la frigider
· Izolarea unei bacterii cu o concentraţie de 104 / ml de urină conduce la recomandarea
repetării analizei (există şi unele excepţii, în care rezultatul este considerat pozitiv, spre ex.
pentru levuri în concentraţie de peste 104 / ml de urină, stafilococii coagulazo-negativi în
concentraţie de peste 5´104 / ml de urină etc)
· Lipsa multiplicării bacteriene sau dezvoltarea de UFC în concentraţie de 103 / ml de urină
reprezintă o urocultură negativă
· Dorim să subliniem din nou că rezultatul microbiologic trebuie să fie analizat în contextul
clinic şi corelat cu rezultatul microscopiei iar în cazul anumitor bacterii (ex. Salmonella typhi)
rezultatul este pozitiv indiferent de concentraţia UFC / ml de urină.
În cazul unei uroculturi pozitive, bacteria izolată se identifică (pe baza caracterelor
morfotinctoriale, de cultură, biochimice, alte caractere) şi se testează sensibilitatea la antibiotice
şi chimioterapice, de regulă prin metoda difuzimetrică (vezi capitolul 14).
Există o serie de încercări pentru optimizarea diagnosticului ITU, inclusiv abordarea unor
tehnici miniaturizate. Dintre acestea vom aminti metoda imaginată în Institutul de boli
infecţioase “Matei Balş” (prof. Florin Căruntu), metoda “Uriline” etc. Spre exemplu ultima dintre
metode utilizează o lamă de plastic acoperită pe ambele părţi cu mediu de cultură, protejată
într-un tub de plastic.
Principiu:
Mediul CLED de pe prima parte a lamei (Cysteine - Lactose - Electrolyte Deficient agar) are
culoare verde şi permite numărarea coloniilor bacteriene (indirect a numărului de UFC / ml
urină) şi identificarea prezumtivă. Concentraţia scăzută de electroliţi inhibă invazia Proteus spp.
Mediul MacConkey fără cristal violet de pe a doua parte a lamei are culoare roz; inhibă
majoritatea bacteriilor gram pozitive.
Tehnica de lucru:
Deşurubăm capacul şi extragem lama fără să atingem suprafaţa agarului. Imersăm lama în proba
de urină recoltată (dacă urina nu este suficientă cantitativ, repartizăm p.p. pe cele 2 părţi ale
lamei cu ajutorul unei pipete Pasteur). Îndepărtăm excesul de urină pe o hârtie de filtru curată
şi punem la loc în dispozitiv lama însămânţată. Incubăm în poziţie dreaptă, timp de 18-24 ore la
35-37°C. A doua zi citim rezultatele, comparând numărul de colonii apărute pe mediul CLED cu
modelul producătorului.
Interpretare:
În cazul în care numărul de UFC / ml este mai mare de 105 realizăm teste suplimentare pentru
identificare şi respectiv antibiograma. Alte elemente privind interpretarea au fost prezentate
anterior.
Control de calitate:
· Pregătim o suspensie bacteriană în soluţie salină fiziologică sterilă cu 105-106 bacterii pe ml
din fiecare dintre tulpinile de referinţă
· Staphylococcus aureus ATCC 25923
· Escherichia coli ATCC 25922
34
· Proteus mirabilis ATCC 12453
· Inoculăm suspensiile astfel pregătite pe suprafaţa mediilor de cultură Uriline, iar după 18-
24 ore incubare citim şi interpretăm rezultatele
· Staphylococcus aureus: apar colonii doar pe mediul CLED. Fermentarea lactozei este
indicată de prezenţa culorii galbene în jurul coloniilor dezvoltate.
· Escherichia coli: apar colonii galbene pe CLED şi colonii roz pe MacConkey.
· Proteus mirabilis: apar colonii translucide iar culoarea CLED este albastră; pe Mac Conkey
apar colonii incolore.
7. GENUL KLEBSIELLA
Microorganismele din genul Klebsiella sunt enterobacterii imobile, nesporulate, caracterizate
printr-o intensă activitate metabolică asupra hidraţilor de carbon pe care îi hidrolizează cu
producerea de acizi şi uneori de gaz. Glucoza este degradată cu producere de gaz.
1. Specii principale: K. pneumoniae, K. ozaenae, K. rhinoscleromatis şi K. oxytoca
2. Habitat: este larg răspândită în natură (sol, apă), dar şi în intestinul omului şi animalelor; în
mediul spitalicesc se selectează tulpini multirezistente ce pot coloniza tractul urinar sau
respirator la adult sau tractul intestinal la copil, mai ales după terapia prelungită cu antibiotice
cu spectru larg.
Mai multe studii au urmărit „pattern-ul” de colonizare cu cu Klebsiella pneumoniae a indivizilor,
cu scopul de a determina factorii de risc pentru infecţii. S-a demonstrat astfel că aproximativ o
treime din persoanele testate prezintă portaj de Klebsiella în fecale. Spitalizarea şi folosirea de
antibiotice a crescut numărul celor colonizaţi de bacterii din genul Klebsiella, cât şi numărul
acestor bacterii per gram de fecale. Personalul medical prezintă Klebsiella pe mâini după ce
îngrijesc pacienţi.
3. Morfologie: Klebsiella pneumoniae cuprinde bacili Gram-negativi, capsulaţi (capsula are

dimensiuni de 2-3 ori mai mari decât diametrul bacteriei), imobili, nesporulaţi. Se pot dispune
în diplo, în special în organismul uman.
4. Caractere de cultură: se cultivă cu uşurinţă pe medii uzuale fără cerinţe nutritive speciale.
Pe medii gelozate s-au descris mai multe tipuri de colonii cel mai frecvent fiind tipul mucos (M):
colonii mari, opalescente, uneori cenuşii, cu suprafaţa umedă care după o incubare prelungită
prezintă tendinţă la confluare şi „curgere” pe suprafaţa mediului. Pe medii lactozate sunt
lactoză-pozitive. Klebsiella pneumoniae nu se dezvoltă pe medii înalt selective şi este parţial
inhibată pe cele moderat selective. S-a raportat apariţia unor tulpini ce dezvolta colonii
hipermucoide, aceste tulpini având şi o virulenţă crescută.
5. Caractere biochimice: pe mediile multitest germenii au următorul comportament

enzimatic: pe mediul TSI sunt glucoză-pozitivi şi uneori fermentează glucoza cu producere de
gaz, sunt lactoză-pozitivi, nu produc hidrogen sulfurat; pe mediul MIU sunt imobili, indol-
negativi şi urează-pozitivi; pot creşte pe medii având citratul drept unică sursă de carbon. Sunt
germeni catalază pozitivi, oxidază negativi. Sunt puţin rezistenţi la căldură (distruşi în 5-7
minute la 100°C); pe sol, în alimente rezistă un mare număr de zile. Dezinfectantele obişnuite îi
distrug în intervale de timp cuprinse între 30 de minute şi 2 ore.
6. Caractere antigenice: Particularităţile morfologice ale klebsiellelor se reflectă în structura

antigenică. Au fost descrise antigene somatice O (LPZ) specifice de grup şi antigene capsulare
35
polizaharidice K, specifice de tip. Există peste 80 de tipuri antigenice, identificabile de ex. prin
reacţia de umflare a capsulei şi (prin analize serologice sau de microbiologie moleculară).
Klebsiella pneumoniae este un microorganism condiţionat patogen, care poate fi implicat în

patologia umană prin multiplicare şi invazivitate.
Factorii de patogenitate sunt reprezentaţi de capsula (antigenul K) care îi conferă
rezistenţă faţă de fagocitoză şi de endotoxina (antigenul O) eliberată după distrugerea
bacteriei.
Sideroforii membranari sechestrează Fe2+ în focarul infecţios, pentru a asigura un nivel
adecvat creşterii bacteriene.
Biofilmul reprezintă o matrice extrem de bine organizata ce înconjoară bacteriile. Ele
favorizează aderarea bacteriană pe suprafaţa cateterelor.
Adezinele cele mai întâlnite la tulpinile de Klebsiella pneumoniae sunt fimbriile de tipul
1 şi 3. Există o interrelaţie între adezinele exprimate şi cantitatea de biofilm produs.
Considerată iniţial ca fiind agent etiologic al pneumoniilor, s-a dovedit că numai 1-3 %
din pneumonii sunt produse de Klebsiella pneumoniae, dar aceste pneumonii pot fi extrem de
grave (pneumonii necrotice şi hemoragice), în special la pacienţi cu un sistem de apărare
deficitar.
Klebsiella pneumoniae poate fi implicată într-o mare varietate de boli precum
toxiinfecţii alimentare de tip infecţios, infecţii ale tractului respirator superior, infecţii
urinare etc. Din ce în ce mai frecvent acest microorganism apare în infecţii nosocomiale (de
spital), la fel ca şi Klebsiella oxytoca. Klebsiella ozaenae a fost izolată din mucoasa nazală a
pacienţilor cu ozenă (atrofie progresivă a mucoasei cu pierderea mirosului) iar Klebsiella
rhinoscleromatis s-a izolat de la pacienţi cu rinosclerom (granulom distructiv al nasului şi
faringelui).
Tulpini aparţinând serotipurilor 1-5 au fost izolate din abcese la nivel pulmonar, hepatic,
cerebral. Dintre acestea o tulpină de Klebsiella pneumoniae deosebit de virulentă a fost izolată
în special în ţările asiatice, această tulpină produce majoritatea abceselor hepatice primare
bacteriene. Într-un model murin, secvenţa de evenimente ce a condus la constituirea unui abces
bacterian primar după inoculare orală a fost:
· colonizare intestinală (la 12 ore),
· diseminare extraintestinală (între 12 şi 24 ore),
· replicare hepatică (la 36 ore),
· metastazare septică (după 48 ore).
S-a tentat identificarea unor gene care favorizează producerea abcesului hepatic.
În ultima vreme tulpini de Klebsiella producătoare de β-lactamaze sunt tot mai des
responsabile de infecţii nosocomiale mai ales la pacienţi iimunocompromişi. De o importanţă
particulară sunt enzimele cu activitate β-lactamazică cu spectru extins (Extended Spectrum Beta
Lactamaze, ESBL); tulpinile de Klebsiella producătoare de ESBL sunt recunoscute în patologia
umană datorită dificultăţii tratamentului curativ. Tratamentul de primă linie pentru tulpinile de
K. pneumoniae producătoare de ESBL a fost reprezentat de carbapeneme.
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR - diagnosticul pneumoniei produse de Klebsiella

pneumoniae
36
Trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca
pacientul să fi primit antibiotice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor
utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie, etc.). În infecţiile produse de
Klebsiella pneumoniae se pot recolta materii fecale, urină, sânge, puroi, etc. În continuare vom
discuta cazul în care p.p. este reprezentat de spută. Din punct de vedere macroscopic, sputa
poate avea un aspect mucoid, de culoare roşu închis, „în jeleu de coacăze”.
examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează prezenţa celulelor de la nivel alveolar
(ex. macrofage alveolare), prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite) şi prezenţa bacililor
Gram-negativi, de dimensiuni relativ mari, încapsulaţi (înconjuraţi de o capsulă voluminoasă).
Examinarea microscopică trebuie să demonstreze calitatea produsului patologic şi să realizeze o
identificare prezumtivă a microorganismului implicat. În coloraţia cu albastru de metilen,
capsula apare ca un halou în jurul klebsielelor. Utilizând anticorpi anti-capsulari, se poate realiza
o identificare rapidă inclusiv direct, pe produsul patologic, prin reacţia de umflare a capsulei.

Klebsiella pneumoniae se poate dezvolta pe medii de cultură obişnuite în 18-24 ore, la 35-37°C.
Se preferă utilizarea unor medii de cultură slab selective (ex. MacConkey). Klebsiella pneumoniae
nu se dezvoltă pe medii înalt selective şi este parţial inhibată pe cele moderat selective. Pe
mediile solide Klebsiella pneumoniae formează colonii lactoză-pozitive, mari, de tip M
bombate, cremoase, în „picătură de miere”, care dau aspectul de „curgere” pe suprafaţa mediului
de cultură, cu tendinţă de confluare. Se poate realiza şi inocularea la animale de laborator
sensibile, şoarecele alb. Există medii de cultură selective/diferenţiale care pot ajuta în
diagnosticul rapid al infecţiilor cu Klebsiella sau aducând informaţii epidemiologice de valoare
(izolarea de tulpini producătoare de ESBL, datorită rezistenţei la o doză de antibiotic inclusă în
mediu). Valorile de sensibitilitate şi specificitate a acestor metode sunt foarte bune, dar trebuie
să fie folosite cu prudenţă, pentru a nu oferi rezultate fals-negative prin limitarea altor germeni
posibili implicaţi în procesul patogenic.

· Caractere morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi, cu dimensiuni mari, capsulaţi,
capsula fiind voluminoasă, dispuşi în lanţuri scurte, perechi sau izolaţi. În mediul de cultură pot
pierde capsula.
· Caractere de cultură: produc colonii lactoză-pozitive, de tip M, mari (2-3 mm la 24 de
ore, peste 4 mm la 48 ore), bombate, vâscoase, cremoase, în „picătură de miere”, care dau
aspectul de „curgere” pe suprafaţa mediului de cultură, cu tendinţă la confluare. Pe mediul
MacConkey coloniile apar roşii (fermentează lactoza, cu producerea de gaz).
· Caractere biochimice: Klebsiella este un microorganism lactoză-pozitiv, ceea ce se poate
evidenţia încă din etapa de izolare pe mediul MacConkey (virează culoarea mediului în roşu).
Alte caractere biochimice se studiază după repicarea unor colonii pe medii multitest (TSI,
MIU), pe mediul Simmons sau în sisteme multi-test comerciale de tip API.
➢ Klebsiella pneumoniae este glucoză-pozitivă (cu producere de gaz), lactoză-pozitivă, nu
produce H2S, imobilă, urează-pozitivă, indol-negativă, care se dezvoltă folosind citratul
ca unică sursă de carbon; K. oxytoca e indol-pozitivă acesta fiind un caracter ce poate fi
folosit în schema de diagnostic de laborator diferenţial.
37
➢ Produce acetoină din glucoză, caracter evidenţiat prin reacţia Voges-Proskauer
(adăugarea de hidroxid de potasiu duce la virarea în roşu a unei culturi bacteriene în
care se află acetoină, în prezenţa unui indicator de pH precum alfa-naftol).
· Caractere antigenice: se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea
tulpinilor de Klebsiella, prin tehnici de aglutinare, coaglutinare, ELISA, Western Blot sau latex
aglutinare. Există peste 80 de tipuri de antigen K la Klebsiella pneumoniae. Aceste reacţii se
practică în laboratoare de referinţă.
· Caractere de patogenitate: se poate utiliza inocularea la şoarecele alb
· Alte caractere / teste utilizate în identificare care se pot utiliza (în centre de
referinţă):
➢ testarea sensibilităţii la bacteriofagi
➢ gruparea în funcţie de rezistenţa la antibiotice şi chimioterapice;
➢ bacteriocinotipie;
➢ caractere testate prin metode ale biologiei moleculare (stabilirea spectrului plasmidic,
cu identificarea plasmidelor implicate în virulenţă etc.).
5. Antibiograma se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. Determinarea CMI şi CMB

poate fi necesară. Klebsiella pneumoniae reprezintă unul dintre microorganismele cu o rezistenţă
remarcabilă faţă de antibiotice şi chimioterapice. Când sunt detectate, tulpinile producătoare de
β-lactamaze şi carbapenemaze necesită teste moleculare pentru a determina cu exactitate
substratul rezistenţei.
8. GENUL PROTEUS
1. Specii principale: Proteus mirabilis şi Proteus vulgaris
2. Habitat: germenii din genul Proteus sunt răspândiţi în natură ubicvitar, se pot identifica în
materiile organice în putrefacţie, în alimente. Fac parte din flora intestinală umană.
3. Morfologie: Sunt bacili Gram-negativi cu un accentuat polimorfism, pe frotiu putându-se

observa bacili, cocobacili, forme filamentoase de până la 50-80 µm. Prezintă un mare număr de
cili peritrichi care le conferă mobilitatea caracteristică (dar există şi tulpini aciliate). Sunt
necapsulaţi şi nesporulaţi.
4. Caractere de cultură: Cresc pe medii simple, inclusiv pe medii peptonate lichide, cu

degajarea unui miros caracteristic de putrefacţie. Suportă mari variaţii de temperatură şi de pH.
Pe mediile diferenţiale (cu lactoză) nu se pot obţine colonii izolate, descriindu-se fenomenul de
invazie (migrare). Cultura se întinde pe toată suprafaţa plăcii (sau tubului) în strat continuu sub
forma unor valuri succesive. Fenomenul de invazie poate fi inhibat prin incorporarea în mediu
de săruri biliare, tiosulfat de sodiu, sulfit de bismut, sulfonamide, neomicină, cărbune activat
etc. Dacă pe o placă cu mediu solid se cultivă 2 tulpini diferite, în 2 puncte opuse, acestea se vor
dezvolta invadând până la un punct în apropierea liniei de întâlnire, unde se va crea o linie de
demarcaţie între cele 2 tulpini (fenomenul liniei de demarcaţie). Cultivarea unui produs
patologic în lichidul de condens al unui tub cu geloză înclinată incubat în poziţie verticală, va
conduce (în cazul în care în produsul patologic există o tulpină de Proteus spp.) la obţinerea în
24 ore a unei culturi pure de Proteus, datorită mobilităţii acestor microorganisme (fenomenul
de „căţărare”).
38
5. Caractere biochimice: Sunt aerobi, facultiv anaerobi. Pe medii slab şi moderat selective pe
care fenomenul de migrare a fost inhibat, speciile de Proteus dezvoltă colonii de tip S, lactoză-
negative (vezi 36. 4.). Microorganismele din genul Proteus sunt glucoză-pozitive, lactoză-
negative, produc H2S, sunt urează-pozitive, indol-pozitive (exceptând P. mirabilis şi P.
myxofaciens) iar pe mediul MIU se poate constata mobilitatea. Are o rezistenţă relativ crescută
în mediu, în alimente etc şi poate rezista în soluţii antiseptice sau în detergenţi, ceea ce poate
crea probleme deosebite în mediul de spital. Rezistă mai multe luni la temperaturi joase, inclusiv
în alimentele congelate. Rezistenţa la antibiotice şi chimioterapice este considerabilă.
6. Caractere antigenice: Prezintă antigenul O (LPZ, endotoxina) specific de grup. După

constatarea că serul bolnavilor de tifos exantematic aglutinează cu o tulpină de proteus s-a
demonstrat că genul include o serie de tulpini (OX-2, OX-19, OX-K) care au înrudiri antigenice
cu microorganisme aparţinând genului Rickettsia. Antigenul flagelar, proteic, H este comun la
mai multe tipuri.
RĂSPUNS IMUN - postinfecţios apare un răspuns imun umoral care însă nu are utilitate
practică.
Proteus poate deveni patogen prin multiplicare şi invazivitate, în condiţii speciale (părăsirea
habitatului natural, colonizarea unor gazde cu deficienţe ale sistemului imunitar).La fel ca şi
ceilalţi germeni Gram-negativi, eliberează de la nivel parietal, după distrugere, endotoxina
(antigenul O, LPZ). Mobilitatea deosebită îi permite invadarea tractului urinar. Producerea de
urează alcalinizează urina şi favorizează formarea de calculi. Existenţa calculilor favorizează
apariţia altor infecţii urinare sau cronicizarea acestora. Rezistenţa la antibiotice şi
chimioterapice este remarcabilă.
De regulă microorganismele din genul Proteus sunt implicate patogenic în afecţiuni ce apar în
afara tractului digestiv. Există totuşi şi toxiinfecţii alimentare de tip infecţios în care aceşti
germeni au reprezentat agenţii cauzali. În mod frecvent se discută despre infecţiile cu proteus
la nivelul tractului urinar, dar sunt posibile mai rar şi alte infecţii (genitale, pleurezii, alte
localizări în cursul unei bacteriemii) de regulă la pacienţi cu status imun deficitar sau în spital
(infecţii nosocomiale).
Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic, direct, incluzând următoarele etape.

1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie
de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât mai
rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi
antisepsie etc). În infecţiile produse de Proteus spp. se pot recolta urină, puroi, diferite exsudate
purulente, materii fecale, lichid de vărsătură, alimente, sânge etc. În continuare vom discuta
cazul în care p.p. este reprezentat de urină. Din punct de vedere macroscopic, urina ar putea
fi tulbure, purulentă. Transportul urinei trebuie realizat rapid, în maxim 30 minute, iar dacă
această recomandare nu poate fi îndeplinită, p.p. trebuie transportat “la rece” (+ 4ºC).
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea unui preparat

proaspăt între lamă şi lamelă, din sedimentul rezultat după centrifugarea urinei. Examenul
microscopic al urinei este foarte important pentru că este uşor de realizat, este ieftin şi permite
observarea unor elemente care orientează diagnosticul. Examinarea microscopică a urinei ar
putea conduce la economii importante (de timp, reactivi şi materiale, medii de cultură); vezi şi
39
capitolul 29. Proteus spp. prezintă un mare număr de cili peritrichi care conferă mobilitatea
caracteristică (există şi tulpini aciliate). Se poate realiza şi un frotiu colorat Gram din urina
omogenizată. Germenii au un accentuat polimorfism pe frotiu putându-se observa bacili,
cocobacili, forme filamentoase de până la 30 µm. Sunt necapsulaţi şi nesporulaţi. Prezenţa a cel
puţin 1 leucocit / câmp microscopic la examinarea cu obiectivul de imersie sugerează piuria, care
într-un context clinic sugestiv ajută la definirea ITU. În cazul în care din urina omogenizată
prelevăm cu ansa calibrată de 0,01 ml urină iar în frotiul rezultat identificăm cel puţin 1-2 bacterii
/ câmp (în microscopia optică cu imersie) acest rezultat sugerează prezenţa a 105 bacterii (unităţi
formatoare de colonii) / ml şi respectiv infecţia tractului urinar.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic trebuie realizată în aşa fel încât să
se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi capitolele
9 şi 10). Cresc pe medii simple inclusiv pe medii peptonate lichide cu degajarea unui miros
caracteristic de putrefacţie. Suportă mari variaţii de temperatură şi de pH. Este necesară
realizarea uroculturii cantitative şi demonstrarea prezenţei a peste 105 bacterii / ml de urină. Pe
mediile simple uzuale, pe agar-sânge, pe AABTL etc, nu se pot obţine colonii izolate, fiind
cunoscut fenomenul de invazie (vezi şi capitolul 11). Acest aspect sugerează prezenţa Proteus
spp. în produsul patologic. “Fenomenul” poate fi inhibat dacă se realizează însămânţarea p.p. pe
medii selectivo-diferenţiale (ex. Mac Conkey sau ADCL). Pe aceste medii Proteus spp. produce
colonii lactozo negative, de tip S.

caractere:
· Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativi, cu un accentuat polimorfism (bacili,
cocobacili, forme filamentoase de până la 30 µm), necapsulaţi şi nesporulaţi.
· Fenomenul de invazie: reprezintă un caracter de identificare preliminară pentru Proteus
spp., o bacterie foarte mobilă; dacă însămânţăm o tulpină care aparţine acestui gen la periferia
unei plăci Petri cu mediu simplu (agarizat 2%), de la locul însămânţării cultura se “dezvoltă în
valuri concentrice” (se întinde in aproape în aproape) pe toată suprafaţa mediului
· Pe anumite medii selective, invazia este inhibată şi se pot obţine colonii izolate (adăugăm
la mediul de cultură acizi sau săruri biliare, tiosulfat de sodiu etc); aceste colonii sunt lactozo
negative şi de tip S
· Fenomenul “liniei de demarcaţie”, reprezintă un caracter util în studii epidemiologice, în
cazul în care tulpinile implicate aparţin genului Proteus; dacă pe o placă cu mediu solid cultivăm
2 tulpini diferite, în 2 puncte opuse, tulpinile se vor dezvolta invadând până la un punct în
apropierea liniei de întâlnire, unde se va crea o “linie de demarcaţie” între cele 2 tulpini (distanţă
de 1-2 milimetri); dacă tulpinile nu sunt diferite va avea loc “creşterea în valuri” fără “demarcaţie”
cu dezvoltarea unei “pânze de cultură” continue
· Fenomenul de “căţărare”, reprezintă o variantă de izolare în cultură pură a unei tulpini de
Proteus; cultivarea unui produs patologic în lichidul de condens al unui tub cu geloză înclinată
incubat în poziţie verticală va conduce (în cazul în care în p. p. există o tulpină de Proteus spp.)
la obţinerea în 24 ore a unei culturi pure de Proteus, care se va dezvolta “în valuri suprapuse”
până la partea superioară a mediului de cultură.
· Proteus spp. include microorganisme lactozo negative.
· Alte caractere biochimice se studiază după repicarea unor colonii pe medii multi test (TSI,
MIU), pe mediul Simmons sau în sisteme multi test comerciale; Proteus spp. este glucozo pozitiv
(uneori cu producere de gaz), lactozo negativ, produce H2S, mobil, urează pozitiv, se poate
dezvolta folosind citratul ca unică sursă de carbon.
· Proteus spp. produce fenil-alanin-dezaminază.
40
· Proteus mirabilis este indol negativ şi ornitin decarboxilază pozitiv în timp ce Proteus
vulgaris este indol pozitiv şi ornitin decarboxilază negativ.
· Se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi (anti-O şi anti-H) pentru identificarea tulpinilor
de Proteus, prin tehnici de aglutinare (la nivelul laboratoarelor de referinţă).
· Alte caractere / teste utilizate în identificare (în centre de referinţă):
· Testarea sensibilităţii la bacteriofagi
· Gruparea în funcţie de rezistenţa la antibiotice şi chimioterapice.
5. Antibiograma este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice.

Determinarea CMI şi CMB poate fi necesară.
9. GENUL SALMONELLA
CARACTERE GENERALE
1. Specii principale
- S. typhi patogenă numai pentru om;
- S. choleraesuis, patogenă la porc şi ocazional la om (numită ulterior S. enterica), cu 1.416
serotipuri;
- S. enteritidis, cauză de diaree la om şi la animal.
2. Habitat: sunt foarte larg răspândite în natură şi prezente la toate speciile de animale, păsări,
peşti, şerpi, insecte. Pentru S. typhi omul este unicul rezervor. Veriga alimentară este esenţială
în infectarea umană.
3. Morfologie: bacili Gram-negativi, cu dimensiuni de 2-4 mm / 0,4-0,6 mm, mobili cu cili

peritrichi (cu excepţia S. galinarum pullorum), necapsulaţi, nesporulaţi.
4. Caractere de cultură: Se multiplică pe medii de cultură simple şi formează colonii de tip S

sau R (prin „îmbătrânire”). Salmonella ser. Paratyphi B poate produce colonii de tip M. Pe
mediile selective cu lactoză dau naştere unor colonii lactoză-negative. Pe geloza Wilson-Blair
formează colonii caracteristice, opace, cu suprafaţa rugoasă şi margini neregulate, prezentând
un halou negru şi luciu metalic.
5. Caractere biochimice: Fermentează glucoza cu formare de gaz (nu şi S. typhi), nu

fermentează lactoza, formează hidrogen sulfurat (există şi excepţii), nu formează indol, nu
produc urează, cresc pe mediul cu citrat ca unică sursă de carbon (Simmons pozitiv), sunt aerobi,
facultativ anaerobi. Se pot multiplica într-un interval larg de temperatură (7-48ºC) şi la un pH
între 4 şi 8. Sunt puţin rezistente la căldură (spre exemplu sunt distruse în 5-7 minute la 100°);
pe sol (păşuni) rezistă circa 200 de zile, în alimente rezistă 10-180 de zile (rezistă 4 ani în pulberea
de ouă, a cărei utilizare în alimentaţie este contraindicată). Dezinfectantele obişnuite le distrug
în intervale de timp cuprinse între 30 de minute şi 2 ore.
Modul în care o tulpină este definită din punct de vedere antigenic cuprinde 3 părţi
(antigenul O, faza 1 de la antigenul H şi faza 2 de la antigenul H).
41
Antigenul O este caracteristic tuturor microbilor Gram-negativi. Există peste 60 de
structuri antigenice O diferite care definesc 46 de serogrupuri O. A fost descris fenomenul de
variaţie genetică în legătură cu antigenul O.
Antigenele de înveliş includ de exemplu antigenul Vi la S. typhi şi Salmonella ser.
Paratyphi C; structurile antigenice Vi reprezintă substratul de fixare a bacteriofagilor, acoperă
antigenul O şi nu permit reacţia de aglutinare; se asociază virulenţei şi invazivităţii (determină
leucopenie, nu permit legarea componentei C3b şi în acest mod inhibă fagocitoza şi determină
capacitatea de multiplicare intrafagocitară).
Antigenul H este de natură proteică, se găseşte la nivelul cililor peritrichi, este
determinant de tip, cu posibilitatea unei variaţii de fază. Majoritatea serotipurilor de Salmonella
pot exprima alternativ două tipuri de flageli cu specificităţi antigenice diferite. Unele tulpini de
Salmonella pot exprima trei sau mai multe tipuri de flageli cu antigenicitate distinctă.
Variaţia antigenică se poate realiza de ex. prin transducţie existând mai multe
posibilităţi: pot pierde antigenul H şi devin imobile; pot pierde antigenul O, coloniile S se
„transformă” în colonii R; pot pierde parţial sau total antigenul Vi (homopolimer de acid N acetil-
galactosaminuronic).
Există antigene şi la nivelul fimbriilor. Apariţia anticorpilor anti fimbrii de tipul 1 la
pacienţi cu febră tifoidă sau la persoane care au fost vaccinate, poate duce la apariţia unor reacţii
fals-pozitive în cadrul analizei serice cantitative (reacţia de aglutinare în tuburi).
RĂSPUNS IMUN
Apare răspuns imun umoral detectabil în special după infecţiile extraintestinale. Este certă
apariţia răspunsului imun după infecţii produse de S. typhi şi paratyphi (Paratyphi), cu punerea
în evidenţă a anticorpilor circulanţi anti O, anti H şi anti Vi. Anticorpii anti O şi anti Vi au rol
protector. Apariţia anticorpilor din clasa IgA secretorii pot împiedica ataşarea la nivelul
epiteliului intestinal.
Salmonella spp., devine patogenă prin multiplicare şi invazivitate. Primul pas, obligatoriu, este
reprezentat de colonizare, realizată cu ajutorul unor structuri de aderare, adezinele şi fimbriile,
care induc modificări la nivelul membranei celulare. Studii de fiziopatologie fundamentală au
reprezentat prima dovadă a existenţei unui receptor hormonal afectat prin ataşare şi invazie
bacteriană. La genul Salmonella a fost pus în evidenţă un grup de gene (genele de invazivitate),
unele din ele fiind asemănătoare cu gene identificate la genul Yersinia.
Salmonella spp., supravieţuieşte intrafagocitar datorită prezenţei unor structuri de
suprafaţă precum şi prin sinteza unor proteine (peste 40 de proteine diferite) care apar ca
răspuns la fagocitare. Antigenul Vi contribuie (pentru S. typhi şi Salmonella Paratyphi C la
rezistenţa la fagocitoză şi rezistenţa după fagocitoză). Endotoxina (antigenul O, LPZ) eliberat
după distrugerea germenilor, are un rol important în patogenitate. Tulpinile care produc
toxiinfecţii alimentare secretă „enterotoxine” cu proprietăţi antigenice şi biologice asemănătoare
toxinei holerice.
Principial infecţiile produse de salmonele se pot împărţi în salmoneloze minore
(enterocolite) şi salmoneloze majore (febra tifoidă). Enterocolita (gastroenterita, toxiinfecţia
alimentară de tip infecţios, salmoneloza) apare după ingestia a 105-108 salmonele. După ingestie
are loc ataşarea şi adsorbţia la nivelul celulelor epiteliale în porţiunea terminală a intestinului
subţire, apoi penetrarea prin celule şi migrarea în lamina propria, în regiunea ileocecală. La acest
nivel are loc multiplicarea în foliculii limfoizi determinând hipertrofia şi hiperplazia SRE
(sistemului reticulo-endotelial). Acumularea de PMN determină o reacţie inflamatorie cu
eliberare de prostaglandine care duc la stimularea secreţiei intestinale, urmată de diaree
(nesanguinolentă), greaţă, vărsături; mai pot apărea febră, dureri abdominale, mialgii, dureri de
42
cap (cefalee). Persoana infectată poate fi contagioasă timp de circa 3 luni. Simptomele sunt mai
severe la copiii mai mici de 10 ani şi la bolnavii imunocompromişi (ex. infectaţi cu HIV / SIDA).
Febra tifoidă (febra enterală) poate apărea după ingerarea a circa 103 salmonele. După ingestie
are loc ataşarea şi trecerea S. typhi prin şi printre celulele epiteliale de la nivelul ansei ileocecale,
urmată de multiplicarea activă în submucoasă şi de fagocitarea de către macrofage. Aici bacilii
rămân vii şi se multiplică (în macrofagele din formaţiunile limfoide intestinale), apoi trec în
ganglionii mezenterici, apoi în canalul toracic, producând bacteriemia iniţială (care reprezintă
debutul clinic al bolii), urmată de invadarea altor organe şi formaţiuni limfatice.
Multiplicarea crescută mai ales în organele SRE (ficat, splină) este urmată de o a doua
bacteriemie masivă şi de eliminarea prin bilă şi / sau urină. La sfârşitul primei săptămâni de
boală, salmonella se elimină din foliculii intestinali şi prin bilă în materiile fecale, excreţia
prelungindu-se mult timp în convalescenţă. Pot apărea angiocolită, colecistită; bolnavul poate
deveni purtător (portaj de Salmonella) după vindecare.
Simptomatologia generală (afectarea stării generale, febră, stare de şoc) este determinată
în special de endotoxină care activează diferite cascade inflamatorii şi producerea de citokine,
iar simptomatologia digestivă (anorexie, dureri, constipaţie sau diaree) este consecinţa
agresiunii intestinale, hepatice şi asupra vezicii biliare.
Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu localizare digestivă

Diagnosticul bacteriologic (direct) cuprinde etapele cunoscute.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile
cunoscute. Produsul patologic este reprezentat de obicei de materiile fecale dar am putea
recolta şi lichid de vărsătură, un anumit aliment incriminat etc. Materiile fecale se examinează
macroscopic şi se trimit către laborator.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea preparatului nativ,

între lamă şi lamelă; putem remarca prezenţa granulocitelor mononucleare.

poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care urmează a fi identificată. Pentru
izolarea şi identificarea agentului patogen p.p. este însămânţat pe un mediu lichid de îmbogăţire
(bulion selenit) şi pe două medii gelozate selectivo-diferenţiale (MacConkey şi ADCL / XLD).
După o incubare de 18-24 ore la 35-37º C, pe mediile solide pot apărea colonii bacteriene suspecte
(lactozo-negative) din care obţinem cultura pură în scopul identificării şi stabilirii sensibilităţii
la antibiotice. Pentru a creşte şansa depistării agentului cauzal, cultura de 18-24 ore în bulion
selenit va fi trecută pe mediile solide (pe MacConkey şi ADCL / XLD).
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic izolat în cultură pură se va realiza

pe baza mai multor caractere:
· Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativi.
· Produc colonii de tip S, lactozo-negative, cu diametrul de 1-3 mm (necolorate şi
semitransparente pe MacConkey; necolorate dar cu centrul negru pe ADCL; roşii,
semitransparente, cu centrul negru pe XLD). În cazul în care a fost folosit şi mediul Wilson Blair
(foarte selectiv, care nu include lactoză) coloniile sunt negre, cu margini neregulate şi halou
metalic.
· Caractere biochimice şi de mobilitate:
· Fermentează glucoza (cu producere de gaz), sunt lactozo-negativi, produc H2S, (exisă şi
excepţii) şi utilizează citratul ca unică sursă de carbon.
43
· Nu produc indol, sunt urează-pozitivi, mobili, produc lizindecarboxilază şi
ornitindecarboxilază etc.
· Pentru punerea în evidenţă a caracterelor biochimice se pot folosi mediile multi-test
convenţionale (TSI, MIU, MILF) sau galeriile multi-test (API 10 S, API 20 E, API Rapid 20 E sau
alte variante).
· se utilizează seruri imune specifice, în scheme care folosesc iniţial Ac anti-O şi ulterior, în
funcţie de rezultatul obţinut, Ac anti-H, prin reacţii de aglutinare pe lamă conform schemei
Kauffmann-White (există tabele şi scheme care trebuie respectate);
· în cazul în care o tulpină izolată are un comportament biochimic sugestiv dar reacţia de
aglutinare este negativă, trebuie să realizăm o suspensie (destul de densă) din respectiva tulpină,
pe care o menţinem timp de 30-60 minute la o temperatură de 100ºC şi ulterior repetăm reacţia
de aglutinare.
· Alte teste ce pot fi realizate în scopul identificării germenilor, de regulă la nivelul centrului
de referinţă
· scheme suplimentare pentru testarea caracterelor antigenice (serotipie)
· teste suplimentare biochimice (biotipie)
· teste privind sensibilitatea la bacteriofagi specifici (lizotipie)
· teste de biologie moleculară (determinarea profilului plasmidic, ribotipia, studiul unor
secvenţe specifice la nivel cromozomial etc).
5. Antibiograma este recomandată de regulă numai în cazul pacienţilor cu vârste extreme sau
pentru supravegherea apariţiei fenomenului de rezistenţă la antibiotice şi chimioterapice; se
realizează prin metode difuzimetrice.
Diagnosticul de laborator microbiologic în febrele enterale este bacteriologic şi / sau serologic.
Diagnosticul definitiv (cert) este reprezentat de izolarea şi identificarea S. typhi în p.p.
Diagnosticul de laborator microbiologic în febrele enterale este bacteriologic şi / sau

serologic.
Diagnosticul definitiv (cert) este reprezentat de izolarea şi identificarea S. typhi în p.p.
Diagnosticul bacteriologic, direct respectă etapele cunoscute ale acestui tip de diagnostic, cu
anumite particularităţi.
Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând regulile
cunoscute, în special recoltarea cât mai rapid după debutul bolii şi înainte de iniţierea
antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat în prima săptămână de sânge, ulterior
putem recolta materii fecale, urină, lichid biliar, măduvă hematogenă etc. În cazul în care p.p.
este reprezentat de materii fecale, respectăm ceea ce am prezentat mai sus, cu o serie de
sublinieri:
- Sunt în studiu metode de identificare a prezenţei S. typhi, direct în p.p. (ex. materii fecale) prin
latexaglutinare şi PCR
- Coloniile de S. typhi pot să nu prezinte centrul de culoare neagră pe ADCL sau XLD.
- S. typhi în general nu produce gaz din glucoză iar H2S poate fi produs în cantităţi mici şi tardiv;
nu foloseşte citratul ca unică sursă de carbon şi este ornitindecarboxilază negativă.
- Pentru identificarea Ag O poate fi necesară o inactivare prealabilă (termică, folosind o
substanţă acidă sau acetonă). Pentru identificarea Ag H poate fi necesară inactivarea cu
formaldehidă. Prezenţa Ag Vi poate crea probleme în ceea ce priveşte identificarea Ag O.
- Deşi lizotipia este o metodă laborioasă, de multe ori se dovedeşte superioară din punctul de
vedere al rezultatelor obţinute în comparaţie inclusiv cu metode ale biologiei moleculare.
- Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice este recomandată pentru fiecare tulpină
de S. typhi izolată.
44
Diagnosticul serologic
Unii autori consideră că nici unul dintre testele utilizabile în diagnosticul serologic nu este
suficient de specific, sensibil şi rapid. Diagnosticul serologic se realizează respectând principiile
generale ale acestui tip de diagnostic. Cea mai cunoscută metodă utilizabilă actual este analiza
serică cantitativă, realizată tot prin tehnica aglutinării în tuburi. Utilizăm serii separate de
tuburi, câte o serie pentru fiecare Ag cunoscut folosit, serul de cercetat fiind diluat
corespunzător protocolului de lucru. Atunci când presupunem o febră tifoidă sau paratifoidă
utilizăm spre ex. 6 serii de tuburi, cu Ag cunoscute şi inactivate, pentru a evidenţia Ac anti-O
(TO – S. typhi, AO – S. paratyphi A, BO – S. paratyphi B), şi anti-H (d – S. typhi, a – S. paratyphi
A, b – S. paratyphi B). După realizarea diluţiilor, incubăm tuburile pentru Ac anti-O timp de 18-
20 ore la 52º C urmat de 10 minute la temperatura camerei iar tuburile pentru Ac anti-H timp de
2 ore la 52º C urmat de 10 minute la temperatura camerei şi citim reacţia. Un titru de 1/250 în
cazul Ac anti-O şi respectiv 1/2500 în cazul Ac anti-H ar putea fi sugestiv. Creşterea de 4 ori a
titrului, la 2 determinări succesive (interval de 7-10 zile) poate confirma suspiciunea de
diagnostic. La persoanele vaccinate în antecedente diagnosticul serologic nu poate fi utilizat
(rezultatele nu sunt interpretabile) şi este strict necesară izolarea în culturi a S. typhi.
Atât în cazul bolnavilor, dar mai ales în cazul convalescenţilor şi purtătorilor a fost
recomandată reacţia de aglutinare în tuburi pentru identificarea prezenţei şi titrului Ac anti-Vi.
Se consideră că un titru de peste 1/40 poate fi considerat sugestiv.
HEMOCULTURA
Arborele circulator este în mod normal steril.
Bacteriemia / fungemia reprezintă prezenţa tranzitorie şi de regulă intermitentă a
bacteriilor / fungilor în torentul circulator. O bacteriemie / fungemie se poate însoţi de creşterea
temperaturii şi / sau frison precum şi de alte semne sau simptoame. Dintre situaţiile care pot
conduce la apariţia unei bacteriemii putem aminti: realizarea unei extracţii dentare, periajul mai
energic al dinţilor folosind o periuţă neadecvată (prea dură) precum şi multe acte medicale sau
medico-chirurgicale invazive realizate la diferite niveluri anatomice (cateterisme etc).
Bacteriemia / fungemia însoţesc infecţiile generalizate cu bacterii / fungi. Există o
mare varietate de microorganisme capabile să producă infecţii generalizate (bacterii aerobe şi
anaerobe, fungi, virusuri, paraziţi). Trebuie însă menţionat că, destul de frecvent, o hemocultură
pozitivă nu indică de fapt agentul etiologic al infecţiei ci o contaminare survenită pe parcursul
diagnosticului microbiologic. Dintre agenţii contaminanţi întâlniţi mai frecvent putem aminti:
Staphylococcus epidermidis, S. hominis, Micrococcus luteus, Corynebacterium spp.,
Brevibacterium epidermidis, Propionebacterium acnes, Acinetobacter calcoaceticus, streptococii
non-hemolitici etc.
În realizarea unei hemoculturi, trebuie să se țină seama de:
· momentul recoltării sângelui
· volumul de sânge recoltat.
Cu privire la primul aspect este de reţinut că întotdeauna se recomandă recoltarea a
minim 2 probe de sânge, însă cel mai frecvent sunt recoltate 3 probe de sânge, în momente
diferite, pe parcursul a 24 de ore. În anumite cazuri (de ex. în endocardita bacteriană subacută),
bacteriemia fiind continuă, sunt suficiente 2 hemoculturi / 24 ore. Pe de altă parte, în cazul în
care presupunem că agentul etiologic poate face parte din flora normală vom recolta minim 3
probe pentru hemocultură.
În ceea ce priveşte al doilea aspect, având în vedere faptul că de regulă în cursul
bacteriemiilor / fungemiilor numărul de unităţi formatoare de colonii / ml de sânge este destul
de redus, trebuie să recoltăm un volum de sânge adecvat (pentru fiecare hemocultură în parte).
Astfel, vom recolta circa 20 ml de sânge în cazul adulţilor şi 1-5 ml de sânge în cazul nou-
născuţilor, sugarilor şi copiilor mici (deoarece numărul de UFC / ml poate fi de circa 3 ori mai
mare la aceste grupe de vârstă).
45
Atunci când este necesară realizarea unei hemoculturi (de fapt a unui „set” de
hemoculturi) este necesar să ne gândim şi la următoarele aspecte:
· cel mai adesea hemoculturile trebuie realizate „în urgenţă”
· sângele, fiind un produs biologic în mod normal steril, vom izola cel mai adesea un
singur agent infecţios (dar există şi posibilitatea unor asocieri)
· există anumite particularităţi în ceea ce priveşte etiologia infecţiilor generalizate în
funcţie de vârsta pacienţilor, poarta de intrare posibilă, focarul infecţios principal, starea din
punctul de vedere al apărării (specifice şi nespecifice) a gazdei respective etc
· în sânge există o serie de factori antimicrobieni a căror acţiune trebuie pe cât posibil
diminuată (aceasta se realizează pe de o parte prin diluarea 1 / 10 a sângelui cultivat în raport cu
volumul mediului de cultură dar există şi o serie de substanţe chimice care pot fi utilizate în
acelaşi scop, spre ex. polianetol sulfonatul de sodiu are atât efect anticoagulant cât şi de
neutralizare a unor factori antimicrobieni)
· mediile de cultură şi condiţiile de incubare trebuie ales în aşa fel încât să permită
dezvoltarea agenţilor etiologici probabili
· asigurarea calităţii mediilor de cultură va include atât controlul sterilităţii fiecărui
lot cât şi controlul eficienţei acestora (prin inocularea mediilor cu tulpini de referinţă, de
colecţie).
Pentru recoltarea sângelui trebuie respectate condiţiile impuse recoltării oricărui tip de
p.p. Subliniem însă importanţa respectării cu stricteţe a regulilor de prelevare aseptică şi
respectiv a recoltării sângelui înainte de administrarea oricărui tratament antimicrobian.
Oricât de urgent ar fi considerat că trebuie începută terapia se poate „temporiza” până se
realizează recoltarea sângelui pentru hemocultură, ceea ce în astfel de situaţii ar necesita un
interval de timp de numai 10-15 minute. Este recomandat ca recoltarea să fie urmată de
însămânţarea direct pe mediul de cultură, „la patul bolnavului”. Dacă această recomandare nu
poate fi urmată am putea folosi un tub care conţine 1 ml dintr-o soluţie 0,25-0,50% de polianetol
sulfonat de sodiu în care realizăm recoltarea sângelui şi pe care îl transmitem imediat către
laborator pentru însămânţarea pe medii de cultură. Mediile de cultură sunt medii lichide,
îmbogăţite (ex. bulion infuzie de cord-creier pentru aerobi şi respectiv bulion Columbia cu
cisteină pentru anaerobi) condiţionate în flacoane corespunzătoare cantităţii de sânge pe care
trebuie să o recoltăm. Pentru bacteriile cu multiplicare lentă este recomandată utilizarea
mediului bifazic (mediu solidificat în pantă, de ex. geloză-chocolat plus mediul lichid bulion
tripticază din soia). În cazul în care recoltarea a fost realizată simultan în două flacoane pentru
hemocultură, unul va fi incubat în aerobioză iar celălalt în anaerobioză. Pentru unele
microorganisme (ex. Brucella spp.) este necesară incubarea în atmosferă de 5-10% CO2.
Temperatura de incubare este cel mai frecvent 35-37º C.
Examinarea flacoanelor de hemocultură se realizează de 2 ori / zi în primele 3 zile, apoi
zilnic pentru minim 7 zile (în anumite situaţii flacoanele pot fi incubate timp de mai multe
săptămâni). Examinarea o facem macroscopic urmărind o serie de aspecte care ar putea să
semnifice dezvoltarea microbiană (tulburarea mediului mai mult sau mai puţin uniformă,
apariţia unei pelicule la suprafaţa mediului lichid, apariţia unui depozit pe stratul de hematii din
zona declivă a flaconului, apariţia unor bule de gaz, apariţia unor colonii pe mediul solid în cazul
în care am utilizat mediul bifazic etc). Din punct de vedere microscopic, manipulând aseptic
flacoanele de hemocultură putem realiza frotiuri pe care le colorăm Gram.
În cazul apariţiei unor modificări precum cele descrise mai sus dar şi atunci când acestea
nu apar („treceri oarbe”) vom realiza subcultivări pe medii de cultură solide (de ex. geloză
chocolat). Prin utilizarea mediului bifazic subcultivarea se realizează uşor şi fără riscul
contaminării, prin simpla înclinarea a flaconului şi „scăldarea” pantei cu mediul de cultură solid).
După obţinerea culturii pure trecem la identificarea agentului etiologic şi stabilirea
sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice a acestuia. În vederea testării sensibilităţii la
antibiotice putem utiliza ca inocul bulionul de hemocultură, dar rezultatele obţinute vor fi
46
confirmate prin antibiograma difuzimetrică standardizată pornind de la coloniile izolate
(cultura pură).
În momentul de faţă există numeroase sisteme automate utilizate pentru hemocultură
(BacT / Alert, Isolator, BACTEC, Septi-Chek, Vital etc).
10. GENUL SHIGELLA

Genul Shigella include bacili Gram-negativi, imobili, nesporulaţi, necapsulaţi, oxidază-
negativi, lactoză negativi. Shigella spp. nu aparţine florei normale intestinale. Există mai multe
specii. Pe baza structurii antigenice au fost diferenţiate patru subgrupe (A-D) respectiv Shigella
dysenteriae (serotipuri), S. flexneri (6 serotipuri care se pot subdiviza în sub-serotipuri), S. boydii
(18 serotipuri) şi S. sonnei (1 serotip cu 2 faze sau variante, respectiv R şi S).
1. Habitat: se pot găsi în intestinul şi scaunul omului bolnav. În funcţie de anumite condiţii,
shigellele se pot izola din apă, alimente sau de pe obiecte. Pot fi transmise prin intermediul
muştelor.
2. Morfologie: sunt bacili Gram-negativi, imobili, cu dimensiuni de 2-3 µm / 0,5-0,8 µm,

necapsulaţi, nesporulaţi.
3. Caractere de cultură: cresc pe medii simple şi produc colonii de tip S. Pe mediile cu lactoză
(ex. ADCL, AABTL) formează colonii de tip S, lactoză-negative. Pentru izolare din materiile
fecale sunt utilizate medii diferenţiale (cu lactoză şi indicator de pH) şi / sau medii selective
(mediul Shigella-Salmonella cu săruri biliare etc).
4. Caractere biochimice: sunt germeni aerobi facultativ anaerobi, glucoză-pozitivi fără

producere de gaz, lactoză-negativi, nu produc H2S, urează-negativi, indol-negativi, imobili.
Subgrupele A-D se pot diferenţia pe baza fermentării manitei (subgrupul A este manită-negativ).
Shigellele sunt inactivate în 10 minute la 50-60ºC. în praf uscat rezistă circa 10 zile, pe lenjerie
pot supravieţui peste 2 săptămâni. În ape, la o temperatură de 7-10ºC pot supravieţui circa 9 zile,
în alimente circa 1-2 săptămâni, iar în gheaţă până la 2 luni.
5. Caractere antigenice: Subgrupele sunt divizate pe baza structurii antigenului O (LPZ).

Subgrupul A (Sh. dysenteriae) include 10 serotipuri dintre care cel mai patogen este tipul 1,
Shigella shiga. Subgrupul B (Sh. flexneri) include mai multe tipuri şi subtipuri serologice.
Subgrupul C (Sh. boydii) cuprinde 15 serotipuri iar subgrupul D (Sh. sonnei) cuprinde o singură
specie în 2 faze distincte antigenic (S şi R). Există tulpini care prezintă la suprafaţă structuri
antigenice de tip K. Sh. shiga elaborează şi o exotoxină termolabilă, cu structură proteică.
RĂSPUNS IMUN
Infecţia cu Shigella spp. duce la stimularea răspunsului imun umoral, cu apariţia de anticorpi
care însă nu conferă protecţie. Apariţia de anticorpi locali de tip IgA (eventual după
administrarea de vaccinuri vii atenuate) ar putea avea o utilitate în prevenirea infecţiei.
47
Shigella este patogenă prin multiplicare şi invazivitate. În cazul serotipului 1 din subgrupul A
(Sh. shiga) este implicată şi toxigeneza. La fel ca toate microorganismele Gram-negative,
shigellele elaborează lipopolizaharidul parietal, care se eliberează ca endotoxină, după
distrugerea bacteriei. Endotoxina (antigenul O) este implicată în patogenia dizenteriei, având o
acţiune iritativă la nivel intestinal.
Exotoxina shiga afectează atât intestinul (fiind implicată în mecanismul de producere al diareei),
cât şi sistemul nervos central (putând conduce la apariţia unor fenomene de meningism sau
chiar pierderea stării de conştienţă, comă). Faţă de animalele de experienţă are efect letal.
Infecţiile cu Shigella spp. sunt de regulă limitate la nivelul tractului intestinal. Dizenteria poate
apărea după ingestia a numai 100 de bacterii, care se localizează, se multiplică şi invadează
epiteliul intestinal (pot apărea abcese la nivelul peretelui intestinului gros, la nivelul ileonului
terminal, abcese care evoluează spre ulceraţie, necroză, hemoragie). După o perioadă de
incubaţie de circa 2-5 zile, în cazul unei dizenterii tipice apar brusc febră, diaree apoasă, dureri
abdominale intense. Ulterior se elimină scaune foarte numeroase (20-40 / zi), nefecaloide, cu
mucus, puroi şi sânge, însoţite de colici intestinale şi tenesme rectale. Starea generală se
înrăutăţeşte (mai grav în cazul unei infecţii produse de Sh. shiga) şi problema principală este
reprezentată la fel ca şi în cazul altor diarei, de pierderile hidro-electrolitice şi instalarea unui
sindrom de deshidratare acută. În lipsa tratamentului corespunzător (în special în lipsa
reechilibrării hidro-electrolitice) evoluţia poate fi fatală. În afară de dizenterie, shigelele pot
produce şi toxiinfecţii alimentare de tip infecţios.
Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic (direct) şi trebuie făcut de urgenţă

datorită implicaţiilor posibile ale unei dizenterii.
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând
regulile cunoscute, în special recoltarea cât mai rapid după debutul bolii şi înainte de iniţierea
antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat de materii fecale, dar s-ar putea recolta şi
lichid de vărsătură. La începutul bolii este mai uşor să izolăm bacteria patogenă, deoarece iniţial
se elimină circa 103-109 bacterii / gram de materii fecale. Din punct de vedere macroscopic
materiile fecale pot fi în cantitate mică, conţinând mucus, puroi şi sânge (uneori sângele nu este
vizibil macroscopic). Recomandăm recoltarea şi cultivarea în special a fragmentelor care conţin
mucus, puroi şi sânge. Transportul trebuie să fie realizat rapid, dar este preferabilă însămânţarea
la patul bolnavului. Dacă această recomandare nu poate fi urmată, recomandăm folosirea unui
mediu de transport, mediul bacteriostatic Cary-Blair. O altă variantă de recoltare posibilă (de
ex. în cazuri atipice sau pentru controlul stării de „purtător”) este reprezentată de utilizarea
sondei Nelaton introdusă în colonul sigmoid (10-15 cm la copil sau 15-20 cm la adult) aspirând
p.p. cu ajutorul unei seringi. Materiile fecale se vor suspensiona în soluţie cloruro-sodică sau în
mediul Cary-Blair. Există şi posibilitatea de a recolta p.p. atunci când se presupune diagnosticul
dizenteriei bacteriene prin rectosigmoidoscopie.

proaspăt între lamă şi lamelă (nu efectuăm frotiuri din acest tip de produsul patologic, în cazul
în care suspectăm o infecţie cu Shigella spp.). Preparatul se examinează la microscopul optic cu
obiectivul 40´. Evidenţierea a numeroase PMN vine în sprijinul stabilirii mecanismului bolii
diareice, iar un procent de peste 75% PMN însoţit de prezenţa hematiilor este sugestiv pentru
dizenteria bacteriană. Anumiţi autori recomandă utilizarea imunofluorescenţei directe;
examenul este costisitor în special datorită existenţei numeroaselor serotipuri.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se poată
obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi capitolele 9 şi 10).
48
Se vor utiliza mediile de cultură recomandate, prezentate în capitolul 28. Shigella se dezvoltă pe
mediile slab şi moderat selective şi nu se multiplică pe mediile înalt selective. În cazul apariţiei
unor colonii lactozo negative, repicăm 3-5 colonii izolate pe mediile multitest (TSI, MIU, MILF)
sau procedăm conform protocolului de lucru pentru galeriile tip API.

caractere:
· Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativicu cu dimensiuni de 0,5-0,8m / 2-3m
· produc colonii de tip S, lactozo negative, semitransparente, cu diametrul de 1-2 mm pe
MacConkey sau ADCL (S. sonnei poate produce colonii care devin roz deoarece poate fermenta
tardiv, lactoza) şi roşii pe XLD
· se pot investiga analizând rezultatele obţinute pe mediile multitest sau pe galeriile API;
caracterele biochimice sunt utile şi în diferenţierea subgrupelor genului
· microorganismele din genul Shigella sunt glucozo pozitive, fără producere de gaz, lactozo
negative, nu produc H2S, imobile, urează negative, indol negative
· pot fi necesare teste biochimice suplimentare
· se utilizează seruri imune polivalente pentru subgrup sau seruri imune specifice de tip,
prin reacţii de aglutinare pe lamă, conform unor scheme stabilite
· în cazul în care o tulpină izolată are un comportament biochimic sugestiv dar reacţia de
aglutinare este negativă, trebuie să realizăm o suspensie (destul de densă) din respectiva tulpină,
pe care o menţinem timp de 30-60 minute la o temperatură de 100ºC şi ulterior repetăm reacţia
de aglutinare
· Testarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza în studii epidemiologice sau
în scop de cercetare, fiind rezervată laboratoarelor de referinţă; schemele de lizotipie au fost
utilizate în special pentru S. flexneri 2a şi S. sonnei
· Alte caractere / teste utilizate în identificare la nivelul centrelor de referinţă:
· teste biochimice suplimentare (biotipie)
· bacteriocinotipie (ex. pentru S. sonnei)
· rezistotipie (tipare prin patern-ul rezistenţei la antibiotice), utilă în scop epidemiologic
· testul Sereny (producerea cheratoconjunctivitei la cobai); repicăm colonia suspectă pe
geloză înclinată iar după 8 ore, introducem o ansă de cultură sub pleoapa unui cobai; după 12-
24 ore în cazul unei reacţii pozitive apare congestie conjunctivală, secreţie purulentă şi opacifiere
a corneei cu accentuarea acestor fenomene şi evoluţie spre cheratoconjunctivită (testul poate fi
pozitiv şi în cazul unor tulpini de Escherichia coli)
· tehnici ale biologiei moleculare (stabilirea profilului plasmidic, ribotipia, sondele ADN
etc).
5. Antibiograma se realizează prin metoda difuzimetrică standardizată, în special în scopul

supravegherii apariţiei unor tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene dar şi pentru
stabilirea tratamentului antimicrobian corespunzător.
11. GENUL YERSINIA
Sunt enterobacterii de dimensiuni mici, cu aspect de bacili sau cocobacili Gram-negativi, care
prezintă coloraţie bipolară. Nu formează spori, pot prezenta structuri de tip capsular. Sunt
aerobi facultativ anaerobi, catalază-pozitivi, oxidază-negativi. Majoritatea au drept gazdă
naturală animalele şi pot produce boli (uneori foarte grave) umane.
49
1. Specii principale: include 11 specii dintre care 3 sunt patogene pentru om: Yersinia pestis
(cauza ciumei), Y. pseudotuberculosis şi Y. enterocolitica
2. Habitat: poate fi identificat numai la animale (ex. rozătoare - şobolani) sau la omul bolnav.
Se poate transmite prin plăgi muşcate, de la o rozătoare la alta sau ocazional la om prin
intermediul purecilor. Rezultă infecţii grave, posibil mortale.
3. Morfologie: Y. pestis este un bacil Gram-negativ, imobil, care prezintă o coloraţie bipolară.
Pe frotiuri bacilii pot aparea atât izolaţi cât şi dispuşi în lanţuri scurte şi sunt nesporulaţi. Există
şi forme cocobacilare. În organismele vii şi în culturile tinere, prezintă un înveliş pseudocapsular.
4. Caractere de cultură: aerob facultativ anaerob, se dezvoltă mai rapid pe medii ce conţin
sânge sau fluide organice şi la 30°C dar se poate multiplica şi pe medii simple. În culturi pe
geloză-sânge la 37°C coloniile pot fi foarte mici şi apar după circa 24 ore. O inoculare a unor
microorganisme virulente recoltate direct din ţesutul infectat conduce la apariţia unor colonii
de tip S, sau cu aspect mucoid, vâscoase şi colorate alb-gri. După realizarea unor pasaje în
laborator, coloniile devin neregulate şi aspre (de tip R); capsula dispare.
5. Caractere biochimice: Yersinia pestis are o activitate biochimică relativ scăzută şi cu un grad
de variabilitate. Este un germen aerob, facultativ anaerob, fermentează glucoza şi în mod variabil
fermentează lactoza. Y. pestis şi Y. pseudotuberculosis au caractere biochimice similare. Sunt
germeni puţin rezistenţi faţă de agenţii fizici şi chimici, dar în mediul extern pot supravieţui
până la circa 2 săptămâni în puroi sau în spută şi câteva luni în cadavre.
6. Caractere antigenice: Yersiniile, la fel ca toate microorganismele Gram-negative, prezintă

la nivelul peretelui antigenul O (LPZ, endotoxina). Y. pestis produce mai multe antigene şi toxine
care acţionează ca factori de virulenţă. Anvelopa conţine o proteină (fracţiunea I, F-1) care este
produsă în principal la 37°C, conferă proprietăţi antifagocitare şi activează complementul. Tipul
virulent sălbatic de Y. pestis elaborează antigenele proteice V şi W care sunt codificate
cromozomial sau plasmidic. Dintre toxinele produse, una este letală pentru animalele de
laborator. Toxina (exotoxină) are structură proteică. Y. pestis produce şi o bacteriocină
(pesticină). Câteva dintre antigenele Y. pestis reacţionează încrucişat cu antigene ale altor
yersinii.
RĂSPUNS IMUN
Există imunitate postinfecţioasă. Se pot utiliza vaccinuri pentru prevenirea îmbolnăvirii

(protecţia nu este absolută).
Yersinia pestis este un microorganism patogen în special prin multiplicare şi prin

invazivitate, rolul patogenic al diferitelor structuri sintetizate în cursul metabolismului nefiind
complet elucidat. Doza infectantă este foarte redusă, 1-10 bacili sunt suficienţi pentru producerea
bolii. Rolul esenţial pare a reveni structurilor care conferă proprietăţile de rezistenţă la
fagocitoză, spre ex. fracţiunea I, proteică, de la nivelul suprafeţei celulare, şi respectiv structurii
pseudocapsulare (virulenţa scade în lipsa pseudocapsulei).
50
Structurile cu rol în virulenţă sunt codificate plasmidic sau cromozomial. S-a dovedit
implicarea esenţială a unor astfel de structuri genetice, care nu au fost identificate în cazul
tulpinilor avirulente. Aceste tulpini pot fi utile în producerea unor vaccinuri.
Dintre toxinele menţionate mai sus, una este letală pentru animalele de laborator (doză
de numai 1 mg în cazul şoarecelui). Această proteină produce blocade β-adrenergice şi este
cardiotoxică la animale. Rolul său în infecţiile umane nu a fost elucidat.
În cursul „prânzului”, vectorul se hrăneşte dintr-o rozătoare infectată cu Y. pestis,
microorganismul ajunge în intestinul puricelui şi prin intermediul unei coagulaze blochează
peristaltismul la nivel gastric. Bacteriile se multiplică. Masa bacteriană şi structura fibrinoasă
blochează tranzitul intestinal, puricele înfometat muşcă din nou şi regurgitează
microorganismele în animalul muşcat. Datorită blocajului intestinal, cu toate că aspiră sânge,
puricele nu se poate hrăni, devine şi mai înfometat şi pierde selectivitatea naturală pentru
rozătoarele respective; astfel ajunge să muşte gazda umană. Microorganismul inoculat la om este
fagocitat, dar se poate multiplica atât intra cât şi extracelular. În scurt timp ajunge la nivel
limfatic şi apare o inflamaţie hemoragică la nivelul ganglionilor care se hipertrofiază, suferi o
necroză şi devin fluctuenţi. În cursul invaziei, Y. pestis poate ajunge în torentul sanguin şi
infecţia se poate generaliza. Se dezvoltă leziuni hemoragice şi necrotice în toate organele (ex.
meningite, pneumonii şi pleuropericardite serosangvinolente). Aceasta este forma de pestă
bubonică, în care letalitatea în lipsa tratamentului este de peste 50%.
Pesta pneumonică primară (forma pulmonară) poate apare prin inhalarea de nuclei de
picătură (de obicei de la un pacient care tuşeşte) sau prin embolizări septice la nivel pulmonar;
se manifestă prin pneumonie hemoragică, septicemie şi deces în peste 90% din cazuri.
Diagnosticul de laborator în yersiniozele cu poartă de intrare digestivă este bacteriologic, direct.

În cazul manifestărilor extra-intestinale este indicat diagnosticul serologic.
regulile cunoscute, în special recoltarea cât mai rapid după debutul bolii şi înainte de iniţierea
antibioterapiei. Produsul patologic poate fi reprezentat de materii fecale, ganglioni recoltaţi
intraoperator, sânge etc. În continuare vom discuta diagnosticul unei BDA. Se poate folosi
mediul de transport Cary-Blair.

proaspăt între lamă şi lamelă (nu se efectuează frotiuri din materiile fecale). Preparatul se
examinează la microscopul optic cu obiectivul 40´. Vom evidenţia prezenţa celulelor
inflamatorii.

poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi capitolele 9
şi 10). În vederea izolării Y. pseudotuberculosis sau Y. enterocolitica se pot utiliza diferite medii
selective clasice (MacConkey, ADCL) sau mediul CIN (cefsulodină, irgasan, novobiocină),
eventual cu incubare la temperatura camerei (20-30º C). Există diferite metode de îmbogăţire,
de ex. inocularea p.p. în tampon fosfat salin cu incubare la 4º C timp de 1-3 săptămâni urmată de
treceri pe mediile menţionate mai sus. Coloniile suspecte se repică pe mediile multitest clasice
sau pe galerii API.
4. Identificarea se va realiza pe baza mai multor caractere:

· Caractere morfotinctoriale: Sunt cocobacili sau bacili gram-negativicu cu dimensiuni de
0,5-3m / 1-2m, posibil pleomorfi
· Produc colonii de tip S, de 1-1,5 mm (2-3 mm după 48 ore)
51
· Pe mediul CIN coloniile sunt semitransparente, cu margini clare şi centrul roşu
· se pot investiga folosind mediile multi-test clasice sau galeriile API
· fermentează glucoza fără producere de gaz, nu fermentează lactoza, nu produc H2S
· sunt imobile la 37ºC şi mobile la 22º C, nu produc indol, produc urează
· se utilizează seruri specifice anti-Yersinia, prin reacţii de aglutinare pe lamă
în scop de cercetare, fiind rezervată laboratoarelor de referinţă
· teste biochimice suplimentare
· reacţii de aglutinare cu alte seruri imune, pentru tipuri mai puţin frecvent întâlnite
· bacteriocinotipia
· tehnici ale biologiei moleculare (digestia endonucleazică a ADN-ului cromozomial,
electroforeza în câmp pulsatil, ribotipia, PCR etc).
5. Este recomandată realizarea antibiogramei (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi

chimioterapice), prin metoda difuzimetrică standardizată. Se pot utiliza şi sisteme automate, de
exemplu trusa automată ATB G–5, cu citire şi interpretare după 18-24 ore de incubare (21
antibiotice), pentru bacili Gram negativi.
Diagnosticul serologic este util în determinarea etiologiei artritelor reactive, eritemului nodos
sau în cazul altor manifestări extra-intestinale. Anticorpii apar la circa 4-7 zile de la debutul bolii,
ating valoarea maximă după circa 14 zile şi persistă câteva luni. Se pot practica diferite tehnici,
de ex. reacţia de aglutinare în tuburi.
Se consideră că valoarea titrului semnificativ este ≥ 1/160. Este recomandată testarea serurilor
pereche, în dinamică.
Trebuie să fie luată în considerare posibilitatea apariţia unor reacţii încrucişate, datorită
existenţei unor antigene asemănătoare la microorganisme din genurile Brucella sau Salmonella.
12. GENUL PSEUDOMONAS
CARACTERE GENERALE
1. Specii principale: Cea mai importantă specie a genului este Pseudomonas aeruginosa (bacilul
piocianic, „bacilul puroiului albastru”), specie implicată relativ frecvent în infecţii la persoane cu
reactivitate scăzută, precum şi în infecţii nosocomiale (infecţii „de spital”). Pseudomonas
aeruginosa reprezintă una din principalele bacterii oportuniste.
2. Habitat: Microorganism foarte răspândit în natură (agent de putrefacţie a materiei organice

animale şi vegetale), poate fi pus în evidenţă la circa 15% dintre persoanele sănătoase, la nivel
intestinal, axilar, perineal etc, preferând zonele cu un grad de umiditate. Poate contamina
obiectele din grupurile sanitare, camera de baie, chiuvetele (în special sifonul de scurgere) etc.
Elaborează o piocină (bacteriocină), cu efect inhibitor asupra unor tulpini din aceeaşi specie.
3. Morfologie: Este un bacil Gram-negativ subţire, cu dimensiuni între 1-5mm / 0,5-1mm, mobil,
cu 1-3 cili polari (există şi tulpini neciliate), nesporulat. Uneori prezintă capsulă.
52
4. Caractere de cultură: Din punct de vedere nutriţional sunt germeni puţin pretenţioşi. Se pot
cultiva uşor pe medii simple în condiţii aerobe. Unele specii din genul Pseudomonas se pot
multiplica la 4°C, dar cele mai multe au temperatura optimă de multiplicare cuprinsă între 30 şi
37°C (Pseudomonas aeruginosa se poate multiplica şi la 42°C). Posibilitatea cultivării la 42°C
permite diferenţierea de celelalte specii. Pe medii solide formează colonii care se pigmentează
în mod specific, însoţindu-se de pigmentarea mediului (albastru sau galben-verde – 9 pigmenți).
De menţionat că pot apărea colonii (de tip S) cu aspecte diferite, dând impresia prezenţei
concomitente de bacterii diferite. Cultura poate avea un miros aromat, ca al florilor de tei.
Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa recoltate de la pacienţi cu fibroză chistică formează
colonii mucoide. În bulion tulbură mediul, formând şi o peliculă la suprafaţă, sub care se
evidenţiază pigmentul.
5. Caractere biochimice: Produce diferiţi pigmenţi (9), dintre care mai importanţi sunt
piocianina (albastru) şi pioverdina (galben-verzui fluorescent). Este un germen catalază-pozitiv,
degradează oxidativ glucoza, nu fermentează lactoza şi este oxidază-pozitiv. Este sensibil la
căldură, fenol, alcool de 80°, dar rezistent la acţiunea compuşilor cuaternari de amoniu.
În spital se selectează tulpini rezistente la antiseptice, dezinfectante, antibiotice, tulpini care pot
fi implicate în infecţii de spital.
6. Structură antigenică: Pseudomonas aeruginosa posedă antigenul flagelar H (proteic) şi

antigenul somatic O (lipopolizaharidic). Pe baza existenţei mai multor factori antigenici O şi H,
s-au descris mai multe serotipuri în cadrul speciei, utile în special în investigaţii epidemiologice.
RĂSPUNS IMUN - Există un răspuns imun umoral, manifestat prin formarea de anticorpi
(opsonine, aglutinine), însă cu titruri nesemnificative şi fără eficacitate protectivă.
Speciile genului Pseudomonas sunt ubicuitare (întâlnite în apă, pe sol, pe plante etc, sau
fac parte din flora microbiană umană). Pseudomonas aeruginosa a fost identificat în diferite
soluţii apoase, inclusiv soluţii dezinfectante sau chiar soluţii de antibiotice, având o deosebită
capacitate de a supravieţui în medii umede. Pseudomonas aeruginosa este un microorganism
oportunist, condiţionat patogen.
Dintre factorii de virulenţă ai bacilului piocianic am putea aminti prezenţa pililor (care
mediază ataşarea bacteriană la celulele epiteliale), producerea unor proteaze (cu efecte
histotoxice), a unei lipaze, sinteza de hemolizine, exotoxine (exemplu exotoxina A, de circa
20.000 de ori mai toxică decât endotoxina), precum şi existenţa endotoxinei (lipopolizaharidul
din structura peretelui). Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa izolate de la pacienţi cu fibroză
chistică deţin un glicocalix foarte dezvoltat care mediază aderenţa la nivelul mucoaselor
respiratorii şi împiedică opsonizarea. În infecţiile cronice, la aceşti pacienţi, a fost demonstrată
trecerea tulpinilor din forme S în forme de tip M, datorită unor mutaţii care au fost identificate
recent (2008).
Datorită capacităţii de adaptare şi supravieţuire în diferite medii, precum şi datorită
factorilor de virulenţă enumeraţi, Pseudomonas aeruginosa poate produce infecţii foarte variate,
de la infecţii tegumentare superficiale până la septicemii fulminante. La persoanele cu
reactivitate normală, infecţiile sunt de obicei localizate (foliculite, otite, infecţii oculare etc),
urmând contaminării cu diferite soluţii apoase sau după înot în piscină. Prezenţa piocianicului
ar putea fi semnalată de culoarea albastră verzuie a pansamentelor. La nivel dermic, procesul
infecţios poate avea şi o evoluţie gravă, cu apariţia de vezicule care se sparg şi se refac pe o bază
necrotică. Procesul poate progresa în profunzime (ecthyma gangrenosum), asemănător cu
patologia întâlnită la pacienţii neutropenici la care infecţia poate fi produsă şi de alte
microorganisme.
53
La persoanele spitalizate, cu reactivitate diminuată şi supuse unor manevre medico-
chirurgicale invazive (intubaţii, cateterizări etc), precum şi la persoanele cu arsuri, P. aeruginosa
poate produce infecţii localizate, dar potenţialul diseminării şi apariţiei unor complicaţii grave
(bacteriemie, osteomielită, meningită, endocardită, septicemie) este foarte important. În lipsa
tratamentului adecvat (dificil datorită rezistenţei la antibiotice), evoluţia procesului infecţios
poate fi gravă sau deosebit de gravă (80% din septicemiile cu piocianic au evoluţie letală).
Infecţia pulmonară cronică la pacienţii cu fibroză chistică (mucoviscidoză) este produsă de un
fenotip particularal speciei Pseudomonas aeruginosa.
Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, cu următoarele etape.

o serie de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice,
cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de
asepsie şi antisepsie etc). În continuare vom discuta cazul în care p.p. este reprezentat de puroi.
Puroiul trebuie examinat macroscopic, deoarece poate avea un aspect sugestiv (culoare albastră
sau galben-verzui fluorescentă).
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două
frotiuri din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu
albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu
imersie şi se notează prezenţa celulelor de la nivel tegumentar (eventual modificate faţă de
normal), prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) şi prezenţa bacililor gram-
negativi cu cu dimensiuni de 1-5m / 0,5-1m, dispuşi în lanţuri scurte, perechi, izolaţi.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât
să se poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica. Pseudomonas
aeruginosa se poate dezvolta pe medii de cultură obişnuite în 18-24 ore, la 5-42º C, cu dezvoltare
optimă la 30-37°C. Se preferă utilizarea unor medii de cultură selective. Uneori cultivarea se
realizează pe agar-sânge. Pe mediile solide Pseudomonas aeruginosa formează colonii de tip S
care se pigmentează în mod specific, însoţindu-se de pigmentarea mediului (albastru sau
galben-verde fluorescent). De menţionat că pot apărea colonii (de tip S) cu aspecte diferite, dând
impresia prezenţei concomitente a unor bacterii diferite. Cultura poate avea un miros aromat,
ca al florilor de tei sau iasomie. Pe agar-sânge produce hemoliză. În medii lichide, Pseudomonas
aeruginosa tulbură mediul însă în timp duce la apariţia unei “membrane” aderentă, cenuşie, la
suprafaţa acestuia. După 18-24 de ore, sub “membrană” se poate evidenţia prezenţa pigmentului
produs.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai
multor caractere:
· Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativicu cu dimensiuni de 1-5m
/ 0,5-1m, dispuşi în lanţuri scurte, perechi, izolaţi, relativ polimorfi. În culturi mai vechi pot
apărea diferite forme (filamentoase, cocoide). Mobilitatea se poate examina pe preparatul
proaspăt, între lamă şi lamelă.
· Produc colonii de tip S care se pigmentează în mod specific, însoţindu-se de
pigmentarea mediului (albastru sau galben-verde fluorescent). Pot apărea colonii (de tip S) cu
aspecte diferite, dând impresia prezenţei concomitente a unor bacterii diferite. Coloniile pot
prezenta o suprafaţă iridescentă, cu luciu metalic şi plaje de autoliză, degajând o aromă
pătrunzătoare particulară. Pentru stimularea sintezei pigmenţilor se poate folosi repicare pe
medii speciale, King F (stimulează producerea de fluoresceină) şi King P (stimulează producerea
de piocianină).
· Cultura poate avea un miros aromat, ca al florilor de tei sau iasomie.
· Pe mediile cu sânge produc hemoliză.
54
· Multiplicarea la 42º C poate fi utilă pentru identificare.
· Produce diferiţi pigmenţi, dintre care mai importanţi sunt piocianina (albastru) şi
pioverdina sau fluoresceina (galben-verzui fluorescent).
· Este un germen catalazo pozitiv care degradează oxidativ glucoza şi nu
fermentează lactoza (atât coloana cât şi panta mediului TSI au culoare roşie).
· Se poate realiza testul de oxidare-fermentare a glucozei.
· Bacilul piocianic este oxidazo pozitiv.
· Pentru studii mai aprofundate, în momentul actual anumite laboratoare utilizează
sisteme comerciale care verifică în acelaşi timp numeroase caractere biochimice permiţând nu
numai încadrarea în genul Pseudomonas, dar şi identificarea precisă a speciei (de exemplu Rapid
NTF, cu identificarea speciei în 4-48 de ore).
· Caractere de patogenitate:
· Se pot studia în anumite situaţii (inoculăm 4 şoareci cu cantităţi fixe de germeni
cultivaţi pe geloză înclinată 2 % şi urmărim supravieţuirea acestora timp de patru zile).
· Alte teste ce pot fi studiate în scopul identificării germenilor:
· Testarea caracterelor antigenice
· Testarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia) şi respectiv piocinopia se pot utiliza
în studii epidemiologice sau în scop de cercetare, fiind rezervate laboratoarelor de referinţă
· Teste de biologie moleculară (sonde nucleotidice, analiza ADN după utilizarea de
endonucleaze de restricţie, PCR).
13. GENUL VIBRIO

CARACTERE GENERALE
1. Specii principale: Vibrio cholerae
2. Habitat: Habitatul natural al vibrionilor include sursele de apă dulce şi sărată, unde există
liberi sau în asociaţie cu diferite vietăţi acvatice. Vibrio cholerae se găseşte în intestinul şi în
materiile fecale ale omului bolnav de holeră. Prezenţa vibrionului holeric în mediul extern este
explicată prin contaminarea fecală şi supravieţuirea vibrionilor, existând şi posibilitatea unui
ciclu de viaţă extraintestinal.
3. Morfologie: La izolarea primară, V. cholerae este un bacil Gram-negativ, curbat (forma de

virgulă a devenit mai mult o „reprezentare istorică”), lung de 2-4 mm, mobil cu ajutorul unui
flagel polar.
4. Caractere de cultură: Sunt germeni puţin pretenţioşi şi se pot dezvolta pe medii de cultură
simple, inclusiv în apa peptonată, ceea ce este util în izolarea primară (formează un văl la
suprafaţa mediului). V. cholerae se dezvoltă bine la un pH alcalin (9-9,5), mediile cu un astfel de
pH având rolul de medii de îmbogăţire. V. cholerae produce pe mediile de cultură solide colonii
convexe, rotunde, de tip S cu un aspect opac. Se dezvoltă foarte bine la 37°C pe multe tipuri de
medii, inclusiv pe medii ce conţin săruri minerale şi asparagină ca surse de carbon şi azot. Creşte
bine pe TCBS (tiosulfat-citrat-bilă-sucroză-agar), pe care produce colonii galbene.
: V. cholerae fermentează de obicei sucroza şi manoza. Fermentează glucoza. În funcţie de
fermentarea zaharurilor vibrionii se pot subîmpărţi în grupe. Au metabolism respirator şi
fermentativ. Sunt aerobi, facultativ anaerobi. Testul oxidazei (pozitiv în cazul vibrionului
holeric) este un test cheie în identificarea preliminară. Majoritateavibrionilor sunt halotoleranţi
55
şi adesea prezenţa NaCl le stimulează creşterea prin alcalinizarea mediului. Vibrionii holerici
sunt foarte sensibili la lumina solară şi la acţiunea căldurii (la 100° sunt distruşi aproape
instantaneu); sunt sensibili la antiseptice. în alimente trăiesc (cu unele excepţii) până la 7 zile.
în apă supravieţuiesc un număr de zile, în funcţie de eficacitatea tratamentului aplicat apelor
uzate. în intestinul bolnavilor netrataţi se pot menţine câteva săptămâni.
6. Structură antigenică: Vibrionul holeric prezintă la nivel parietal antigenul O

(lipopolizaharid). În funcţie de structura antigenului somatic de grup O, vibrionii holerici au
fost împărţiţi în 6 serogrupe; vibrionul holeric clasic şi biotipul El Tor fac parte din grupul O:1,
ceilalţi vibrioni fiind non-O:1NAG (non-aglutinabili cu seruri anti-O:1); aceste microorganisme
nu pot fi distinse biochimic de vibrionul holeric O:1. Abordări taxonomice au demonstrat că
Vibrio cholerae O:1 şi non-O:1 reprezintă de fapt aceleaşi specii. Antigenul serogrupului O:1 are
determinanţi care fac posibilă diferenţierea serotipurilor. împărţirea vibrionului holeric în
serotipuri şi biotipuri este utilă în studii epidemiologice, dar testele se fac numai în laboratoare
specializate. Există antigene la nivelul pililor. Fiind mobil, vibrionul prezintă antigenul H la nivel
ciliar. Vibrionul holeric şi vibrionii înrudiţi produc o enterotoxină labilă faţă de căldură, cu masa
moleculară de 84.000 Da, alcătuită din două subunităţi A şi B (activă şi de legare).
RĂSPUNS IMUN
Aciditatea gastrică furnizează o oarecare protecţie în cazul ingerării unui număr mic de vibrioni.
După holeră apare imunitate faţă de reinfecţie, dar durata şi gradul acesteia nu sunt cunoscute.
La animalele de experienţă apar anticorpi specifici de tip IgA în lumenul intestinal. Anticorpii
faţă de antigenul O protejează animalele de laborator faţă de infectare. Anticorpi similari apar
în serul uman după infecţie şi se consideră că sunt asociaţi (într-o oarecare măsură) cu protecţia
faţă de colonizarea cu vibrioni patogeni. Prezenţa anticorpilor antitoxină nu se asociază cu
protecţia.
Microbiologia medicală este interesată în cunoaşterea următorilor vibrioni patogeni sau

cu patogenitate condiţionată, potenţial periculoşi pentru sănătatea omului: Vibrio cholerae O:1,
cu biotipurile cholerae şi El Tor (fiecare din aceste biotipuri putând fi clasificat în serotipurile
Inaba, Ogawa, Hikojima); Vibrio cholerae grup non O:1; Vibrio mimicus; Vibrio
parahemolyticus; V. damsela; V. furnissii; Vibrio vulnificus; V. fluvialis.
Mecanismul patogen al germenilor din familia Vibrionaceae constă în aderarea la
epiteliul celular (adezine/pili), urmează colonizarea şi apoi invadarea mucoasei, care permit
infiltrarea germenilor cu producerea unor variate substanţe biologic active, incluzând enzime
extracelulare, enterotoxine, citotoxine, hemolizine, factori asociaţi cu virulenţa bacteriană.
Capacitatea chemotactică faţă de epiteliile mucoase este mai evidentă la formele monotriche,
depinzând şi de cantitatea şi calitatea mucusului.
Majoritatea germenilor ce colonizează ţesutul uman posedă pe suprafaţă componente
proteice numite ²adezine² care se leagă stereochimic de structurile moleculare complementare
tisulare. Aceşti factori de adezivitate par a fi asociaţi cu fimbriile sau pilii. Factorii de virulenţă
implicaţi în colonizare sunt sintetizaţi în paralel cu producerea enterotoxinei în cazul Vibrio
cholerae (toxina holerică) şi sunt sub coordonarea aceleiaşi gene. Se presupune că pilii
(proprietate importantă asociată virulenţei germenilor din mediu) se pierd o dată cu instituirea
infecţiei.
Prin observarea tulpinilor virulente la microscopul electronic s-a observat existenţa unui
strat adiţional S extern faţă de peretele celular, care oferă protecţie faţă de agenţii litici
(bacteriofagi, proteine serice).
56
Enterotoxina holerică este principala cauză a diareei secretorii din holeră. De exemplu,
la voluntarii care au ingerat mai puţin de 10μg de toxină purificată, în 2 zile a apărut diareea, cu
un volum de peste 20 l, cu caracter „exploziv”.
Toxina holerică (la fel ca şi enterotoxina produsă de E. coli) este compusă dintr-o
subunitate A şi 5 subunităţi B, totalizând aproximativ 84.000 daltoni. Subunităţile B au o mare
afinitate pentru receptorii gangliozidici GM de pe suprafaţa celulelor ţintă. După legare,
subunităţile A intră în citoplasmă şi catalizează transferul ADP-ribozei la NAD, fiind astfel
activată o proteină reglatoare asociată membranei, numită Gs. Rezultatul este un nivel crescut
al AMPc în celulele mucoase ale intestinului subţire, urmat de hipersecreţia clorurilor şi
bicarbonatului care va determina un eflux important de apă.
Fiind germeni Gram-negativi, după distrugerea acestora din peretele celular se eliberează
endotoxina.
În condiţii naturale vibrionul holeric este patogen numai pentru oameni. S-a dovedit că
pentru realizarea infecţiei şi bolii este necesară ingerarea a 108–1010 microorganisme.
Holera nu este o boală invazivă. Germenii nu ajung în torentul circulator, ci rămân
cantonaţi la nivelul tractului intestinal. Vibrionii colonizează marginea în perie a celulelor
epiteliale, apoi se multiplică şi eliberează toxina holerică (iar atunci când sunt distruşi eliberează
şi endotoxina).
După o perioadă de incubaţie de 1-4 zile apar brusc greaţă, vărsături, diaree abundentă
(20-30 litri / zi) şi crampe abdominale. Scaunele apoase, riziforme („apă de orez”) conţin mucus,
celule epiteliale şi un mare număr de vibrioni. Există o pierdere rapidă de fluide şi electroliţi care
duce la deshidratare, colaps circulator şi anurie. Rata mortalităţii în lipsa tratamentului este 25-
50%.
Infecţiile cu Vibrio cholerae grup non O:1sunt asociate cu cazuri de gastroenterită şi cu
infecţii extraintestinale. Sepsisul datorat grupului non O:1 a fost mai rar raportat (ex. la adulţi cu
imunitate deficitară). Totuşi, a fost raportat un caz de sepsis cu Vibrio cholerae grup non O:1
plus gastroenterită la un copil de 8 ani, pacientul prezentând diaree cu sânge, febră și
deshidratare severă; vibrionii non O:1 au fost izolaţi din sânge și din materiile fecale.
Diagnosticul unui caz grav de holeră este uşor de realizat, în special în contextul unei epidemii.
Cu toate acestea, cazurile uşoare sau cazurile izolate sunt relativ dificil de diferenţiat de alte boli
diareice acute.
antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de materii fecale, dar s-ar
putea recolta şi lichid de vărsătură. Din punct de vedere macroscopic materiile fecale sunt
apoase, riziforme (“apă de orez”), de culoare verzuie, cu miros fetid, conţin flocoane de mucus.
Transportul trebuie să fie realizat rapid, în maxim 1-3 ore. Se poate folosi ca mediu de transport
mediul bacteriostatic Cary-Blair. Mediul apă peptonată alcalină (pH 9-9,5) poate fi utilizat atât
în calitate de mediu de transport cât şi de mediu de îmbogăţire.
proaspăt între lamă şi lamelă (nu se efectuează frotiuri din produsul patologic). Preparatul se
examinează la microscopul optic cu obiectivul 40´. Esenţial este faptul că nu se evidenţiază
prezenţa leucocitelor. Vibrionii sunt în număr mare şi prezintă mişcări active, de rostogolire sau
mişcări haotice. Suplimentar, p.p. ar putea fi “tratat” cu Ac specifici; dacă mobilitatea este
stopată, se confirmă diagnosticul.
poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi capitolele 9
şi 10). Abordarea diagnosticului de holeră se realizează în mod diferenţiat, respectiv prezumtiv
(la nivelul unui laborator periferic) şi de certitudine (la nivelul laboratorului de referinţă). Este
recomandată utilizarea atât a unui mediu moderat selectiv (ex. Bile Salts Agar / BSA) cât şi a
57
unui mediu înalt selectiv (ex. Thiosulphate-Citrate-Bile salts-Sucrose / TCBS). Luând în
considerare situaţia în care se ridică suspiciunea unei infecţii cu V. cholerae se recomandă
însămânţarea p.p., direct sau după transportul în mediul Cary Blair, în apă peptonată alcalină
(APA). După incubare pentru o durată de 6-8 ore la 35-37º, facem trecerea pe mediul selectiv
(TCBS şi / sau BSA) luând 2 anse de la suprafaţa APA (în acest interval, la suprafaţa APA poate
să apară un „văl”, respectiv cultura de vibrioni).
Examenul microscopic al „vălului” (preparat proaspăt, între lamă şi lamelă: vibrioni foarte
mobili, cu mişcări de rostogolire sau haotice) precum şi utilizarea unor anticorpi specifici
(reacţie antigen-anticorp) pot grăbi diagnosticul.
caractere:
· Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativicu cu dimensiuni de 1-3m / 0,5-
0,8m
· Produc colonii de tip S, galbene, mari, cu diametrul de 2-4 mm (pe TCBS)
· Pe mediul BSA, V. cholerae produce colonii de tip S rotunde, strălucitoare, transparente ca
picăturile de rouă (spre deosebire de coloniile de E. coli care sunt mate).
· V. cholerae este oxidazo pozitiv (vezi capitolul 12)
· Testul „şuviţei” de ADN se poate utiliza pentru a diferenţia tulpini care sunt oxidazo-
pozitive şi formează colonii cu aspect asemănător (V. cholerae şi Aeromonas spp.); în acest scop
suspensionăm o colonie suspectă într-o picătură de soluţie 0,5% dezoxicolat de sodiu, pe o lamă
de microscop. În cazul în care este vorba de o colonie de vibrioni, aceştia sunt lizaţi şi eliberează
ADN-ul care poate fi „tras” cu ansa ca o şuviţă
· alte teste biochimice, prin metode clasice sau utilizând galeriile manuale sau automate (ex.
API 20E, ID 32E), se efectuează la nivelul unui laborator de nivel superior sau la nivelul centrului
naţional de referinţă; testele biochimice pot diferenţia biotipul clasic de biotipul El Tor (se
apreciază că V. cholerae O:139 este un mutant al biotipului El Tor)
· Se utilizează ser anti-holeric O:1 şi se practică reacţia de aglutinare pe lamă. La nivelul
centrului de referinţă se confirmă reacţia pozitivă şi se identifică serotipul (Ogawa, Inaba sau
Hikojima) iar în cazul unei reacţii negative se realizează o reacţie de aglutinare pe lamă folosind
ser anti-holeric O:139
în scop de cercetare, fiind rezervată laboratoarelor de referinţă. Există sisteme de lizotipare care
definesc peste 140 de lizotipuri diferite.
· testul sensibilităţii la agentul vibriostatic cu O/129 (10 µg şi 50 µg)
· determinarea toxinogenezei tulpinilor de V. cholerae prin reacţia VET-RPLA (latex
aglutinare pasivă inversată)
· tehnici de tip ELISA pentru identificarea unor structuri caracteristice V. cholerae
· tehnici ale biologiei moleculare (ribotipie, PCR etc).
5. Antibiograma se realizează prin metoda difuzimetrică standardizată, în special în scopul
supravegherii apariţiei unor tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene.
14. GENUL CAMPYLOBACTER

CARACTERE GENERALE
1. Habitat: Habitatul natural al microorganismelor din genul Campylobacter cuprinde păsările,

atât cele domestice, cât și cele sălbatice, acestea reprezentând principalele surse ale infecției
pentru oameni.
58
2. Morfologie: Bacteriile din genul Campylobacter sunt bacili gram negativi curbați, mobili, iar
majoritatea speciilor au un singur flagel polar. După cultivarea prelungită sau după expunerea
la oxigen, microorganismele dobândesc o formă cocoidă (ceea ce ar putea preta la confuzii de
interpretare).
3. Caractere de cultură: Sunt bacterii microaerofile, spre anaerobe. Se dezvoltă cel mai bine
într-o atmosferă săracă în oxigen (5-10%) și îmbogațită cu CO2 (10%). În mod obișnuit, sunt
utilizate medii de cultură selective, de exemplu mediul Skirrow care conține vancomicină,
polimixină B și trimetoprim cu scopul de a inhiba creșterea altor bacterii. Temperatura optimă
de dezvoltare pentru C. jejuni, C. coli și C. lari este de 42°C (bacterii fiind cunoscute sub numele
de “grupul termofil”, deși nu sunt bacterii termofile în sensul strict al cuvântului). Coloniile sunt
incolore sau gri și pot fi convexe și rotunde sau apoase cu tendință la confluare.
4. Caractere biochimice: Sunt oxidază și catalază pozitive. Nu fermentează carbohidrații. Sunt

mult mai sensibile în comparație cu majoritatea bacteriilor. Sunt distruse de procedeele
obișnuite de pasteurizare ale laptelui. C. jejuni supraviețuiește în apă la 4°C timp de câteva
săptămâni, dar acest timp este mult scurtat la temperaturi de peste 15°C.
5. Structură antigenică: Structura antigenică a bacteriilor din genul Campylobacter este

similară cu cea a tuturor microorganismelor Gram negative. Menționăm lipopolizaharidul (de
fapt un lipooligozaharid) cu activitate de endotoxină și porinele membranei externe. De
asemenea, există și antigenul flagelar.
RĂSPUNS IMUN
Anticorpii serici de tip IgG și IgM înregistrează un maxim la 2-4 săptămâni după infecție, apoi
scad rapid. Pacienții expuși frecvent la bacterii din genul Campylobacter au concentrații crescute
de IgA care sunt însoțite de imunitate. Pacienții care au infecție cu Campylobacter pot avea un
test fals pozitiv pentru anticorpi anti-Legionella.
Caracterele de patogenitate specifice genului Campylobacter reprezintă subiectul unor cercetări

aflate încă în desfășurare. Pe scurt, cele mai importante sunt :
1. Variabilitatea genetică caracterizează C. jejuni și este cauzată de mecanisme
intragenomice (variații de fază, duplicări și deleții de gene, mutații punctiforme) precum și de
schimbul genetic între tulpini (transfer orizontal de plasmide și de ADN cromozomial). Acest
transfer are loc atât in vitro cât și în timpul colonizării păsărilor.
2. Lipooligozaharidul are rol în aderența la celula epitelială și în invazivitate. Unele
componente ale sale, datorită asemănarii structurale cu părti ale mielinei, declanșează un
răspuns imun încrucișat cu acestea. A se vedea 45. 2. 2. pentru detalii.
3. Flagelul: motilitatea este importantă pentru colonizarea gazdei de către bacterie. C.
jejuni prezintă chemotaxie pentru aminoacizii și alte componente ale mucusului tractului
intestinal.
4. Toxina CDT (Cytolethal Distending Toxin) este produsă și de alte bacterii (E. coli,
Haemophilus ducreyi, Helicobacter hepaticus). Aceasta cauzează oprirea ciclului celular în
celulele-gazdă. Mecanismele precise prin care CDT ajunge la nivelul nucleului sunt încă în
studiu.
5. Molecule de adezivitate: sunt utilizate diferite proteine de adezivitate cum ar fi CadF,
JlpA, Peb1.
59
15. GENUL HELICOBACTER
CARACTERE GENERALE
1. Habitat: Helicobacter pylori colonizează stomacul în 60-70% din dispepsiile fără ulcer şi mult
mai frecvent în ulcerul peptic. Este identificat la polul luminal al celulelor epiteliului gastric, sub
stratul de mucus sau în zonele profunde ale acestuia, fără a invada mucoasa gastrică. Ureea
reprezintă un important element nutritiv, iar amoniacul produs de urează îi asigură pH-ul optim
necesar multiplicării. Prima cultură de H. pylori a fost obţinută în anul 1982. Germenii izolaţi de
la pacienţii cu gastrite şi ulcer duodenal au primit iniţial numele de Campylobacter like, apoi
Campylobacter pyloridis, Campylobacter pylori, iar din 1989 fac parte din noul gen, genul
Helicobacter cu specia tip H. pylori.
2. Morfologie: Helicobacter pylori are aspect de vibrion Gram-negativ, cu o lungime de 2,5 µm

şi o grosime de 0,5 µm, cu unul sau mai mulţi flageli polari, mobil, cu mişcări caracteristice,
uneori cu formă de spiril, necapsulat, nesporulat. Poate prezenta şi cili laterali. S-au descris și
forme cocoide despre care se crede că reprezintă o formă de rezistență.
3. Caractere de cultură: Se dezvoltă în 2-7 zile pe medii de cultură neselective (agar-chocolate,

medii cu infuzie de creier şi inimă sau agar-Brucella suplimentat cu 5-7% sânge de cal) sau pe
medii selective în care se adaugă de exemplu amfotericină B şi polymixină sau cefsulodină, în
condiţii de umiditate relativ ridicată şi un procent de 5-10% CO2.
4. Caractere biochimice: H. pylori nu reduce nitraţii, nu desface hipuratul de sodiu; unele

tulpini produc H2S pe mediul TSI, elaborează urează şi catalază. Pe abilitatea H. pylori de a
produce urează se bazează mai multe teste diagnostice. H. pylori este foarte susceptibil la
deshidratare; rezistă relativ puţin în mediul extern. Este dotat cu capacitatea de a supravieţui şi
de a se multiplica la nivelul mucoasei gastrice.
5. Structură antigenică: Componentele morfologice ale H. pylori conturează şi structura

antigenică, respectiv un antigen somatic O (termorezistent), antigenul H flagelar (termolabil),
un antigen de colonizare (aderare) precum proteinele membranei externe. Porinele sunt printre
cele mai bine caracterizate familii de proteine ale membranei externe, incluzând mai multe
canale care permit difuzarea pasivă a nutrienților. O altă proteină, BabA este prezentată în
detaliu în Anexa nr. 1 la fel ca și diferitele caractere de patogenitate.
RĂSPUNS IMUN
Pacienţii infectaţi cu H. pylori prezintă un răspuns imun ce constă în producerea de IgM
specifici. Sunt produşi de asemenea anticorpi de tip IgG şi IgA, aceştia persistând sistemic şi la
nivelul mucoasei gastrice, cu un titru mai ridicat în cazul infecţiilor cronice.
O dată colonizat stomacul unui individ, întrebarea care se impune este: cum este
realizată persistența acestei infecții? De ce sistemul imun al individului respectiv nu reușește să
combată infecția? Răspunsul este că de-a lungul timpului, H. pylori a reușit să evite sistemul
imun prin mai multe mecanisme care vor fi detaliate în continuare.
În primul rând, după cum am mai subliniat, H. pylori stă sub stratul de mucus, fără a
invada epiteliul gastric, dincolo de “locul de acțiune” al celulelor sistemului imun. Cu toate
acestea, răspunsul imun al gazdei este activat de atașarea bacteriei de celulele epiteliale. H. pylori
se poate atașa de MHC II (complexul major de histocompatibilitate) de pe suprafața celulelor
epiteliale, declanșând apoptoza acestora. O metodă importantă de activare a sistemului imun
este descrisă în documentul suplimentar, mai precis stimularea secreției de IL8 de către acidul
diaminopimelic.
60
Pentru a evita răspunsul imun înnăscut, este necesară “neutralizarea” receptorilor Toll-
like (prescurtați în continuare TLR). Aceștia recunosc PAMPs (pathogen associated molecular
patterns), adică recunosc anumite molecule specifice pentru o mare varietate de agenți patogeni
care sunt diferite din punct de vedere structural de moleculele organismului gazdă. Astfel,
receptorii TLR-5 recunosc flagelina caracteristică mai multor specii bacteriene, însă nu și pe cea
conținută de H. pylori. TLR-9 recunosc ADN nemetilat al majorității bacteriilor, dar H. pylori
are un ADN puternic metilat. LPS (lipopolizaharid) a suferit modificări, astfel încât este
recunoscut doar de TLR-4 de pe macrofage, nu însă și de receptorii aflați pe celulele epiteliale
gastrice. Unul din puținele mecanisme ale imunității înnăscute care încă este activat de catre H.
pylori este calea acid diaminopimelic→NOD1→stimularea NFkB→secreție IL8→neutrofile
(NOD like receptors sunt un alt tip de pattern recognition receptors, receptori care recunosc
PAMPs).
Pentru imunitatea dobândită sunt necesare prezentarea antigenelor și proliferarea LT,
evenimente inhibate de către vacA, după am prezentat în Anexa nr. 1.
În timpul răspunsului imun dobândit, limfocitele Th0 (naive) se pot diferenția fie în Th1 (care
secretă IL2 și IFNγ), fie în Th2 (care secretă IL4, 5 și 10). Th2 stimulează LB care produc anticorpi
împotriva patogenilor extracelulari, în timp ce Th1 stimulează răspunsul imun celular,
caracteristic pentru infecțiile cu microbi intracelulari. În mod paradoxal H. pylori generează un
răspuns predominant Th1. Studiile pe șoareci au arătat ca acest raspuns predominant Th1 este
asociat cu apariția gastritei, în timp ce un răspuns Th2 este protector față de inflamația gastrică
(gastrita se pare că este cauzată de secreția de IFNγ, o citokină caracteristică răspunsului imun
tip Th1). Studiile epidemiologice la om au arătat o polarizare mai puțin pronunțată a răspunsului
imun.

H. pylori prezintă structuri cu rol în patogenitate, respectiv antigenul de suprafaţă (de
colonizare, aderare), antigenul somatic O (endotoxina), toxina citotoxică care iniţiază inflamaţia
locală acţionând asupra celulelor din epiteliul gastric şi duodenal şi toxina care inhibă secreţia
acidului clorhidric la nivelul celulelor parietale gastrice. Se pare că un rol destul de important în
patogenitate îl au ureaza, ca şi prezenţa cililor.
Helicobacter pylori poate fi agent etiologic al gastritei, al ulcerului gastric și duodenal, al

cancerului gastric (este considerat carcinogen clasa I, adică în mod sigur cauzează cancer) și al
limfomului MALT (Mucosal associated lymphoid tissue). S-a demonstrat relația de dublă
cauzalitate între H. pylori și limfom, în sensul că atât infecția cu H. pylori crește riscul de limfom,
cât și eradicarea infecției cu H. pylori conduce la regresia limfomului MALT în majoritatea
cazurilor. Pentru ințelegerea evoluției ulterioare a infecției cu H. pylori, este necesară explicarea
rolului bacteriei în homeostazia secreției acide. Astfel, H. pylori acționează asupra celulelor de
tip D cauzând scăderea nivelului de somatostatină, ceea ce duce la creșterea cantității de
gastrină.
În acest moment, devine importantă localizarea infecției cu H. pylori, și implicit localizarea

răspunsului inflamator. În cazul gastritei, răspunsul inflamator de la nivelul celulelor parietale
inhibă funcția acestora cu suprimarea producției de acid, iar secreția gastrică este caracterizată
de nivele crescute ale pH-ului. Hipoacidemia crește suplimentar gastrina care reprezintă un
stimul proliferativ pentru epiteliile gastrice. Inflamația și proliferarea continuă duc la pierderea
glandelor gastrice și instalarea gastritei atrofice. Atrofia gastrică reprezintă unul dintre cei mai
importanți factori de risc pentru cancerul gastric, mai multe ipoteze fiind formulate pentru a
explica trecerea de la atrofie la cancer. Cea mai cunoscută dintre acestea cuprinde secvența
atrofie→metaplazie intestinală→displazie→adenocarcinom.
61
Gastrita predominant antrală se caracterizează prin hipergastrinemie care de această dată
acționează prin stimularea celulelor parietale care vor crește secreția de acid, răspunsul final
fiind reprezentat de ulcerul duodenal. Ulcerul duodenal este asociat cu scăderea pH-ului
secreției gastrice, în timp ce ulcerul gastric este asociat cu scăderea mijloacelor de apărare ale
mucoasei stomacului.
Având în vedere particularitățile acestor infecții, abordarea acestui subcapitol va fi puțin
diferită și vom începe prin discutarea unor teste care par a nu avea legătură cu materia studiată
în anul 2, însă trebuie avute în vedere ca atare. Este importantă o clasificare a metodelor de
diagnostic pentru infecția cu H. pylori așa cum sunt ele utilizate de medicul clinician, în
colaborare cu medicul microbiolog și medicul care efectuează testele paraclinice. În diagnosticul
infecțiilor produse de H. pylori, pornindu-se de la elementele clinice, se vor realiza următoarele
teste:
1. Teste non-endoscopice
A. Testarea serologică se referă la determinarea nivelurilor de anticorpi prin tehnici de tip ELISA.
Se utilizează antigene cunoscute ca fiind specifice H. pylori (fie celule întregi, fie celule sonicate
sau extracte antigenice purificate) pentru a determina dacă pacientul are sau nu anticorpi-anti
Helicobacter. Nivelele crescute de IgG se mențin pe perioade mari de timp care variază de la o
persoană la alta, din acest motiv acest tip de testare nu va fi utilizat pentru evaluarea post-
tratament, deși este un test care poate fi util în screeningul inițial al infecției cu Helicobacter
pylori.
B. Testul respirator la uree: reprezintă standardul în testarea non-invazivă a infecției cu H.
pylori. Pacientul va bea un lichid care conține uree marcată cu C13 (izotop nonradioactiv) sau cu
C14 (utilizat mai rar din cauza radioactivității). Ureaza produsă de H. pylori va descompune
ureea în amoniac și CO2 marcat care va fi măsurat din aerul expirat de pacient. Cantitatea de
CO2 din aerul expirat este un indicator al cantității de uree aflata în stomac. Testul respirator la
uree poate fi folosit atât pentru diagnosticarea inițială, cât și pentru monitorizarea răspunsului
la tratament.
C. Testul antigenelor din materiile fecale: se utilizează tot un test de tip ELISA, însă spre
deosebire de cel de la punctul 1 suntem în situația inversă: în kit avem anticorpii, ceea ce trebuie
să determinăm este prezența sau absența antigenelor din fecale. Testul antigenelor din fecale
este unul care certifică infecția activă (daca nu mai sunt microorganisme în stomac, acestea nu
vor mai fi eliminate pe cale digestivă), deci reprezintă un test eficace atât pentru screeningul
inițial, cât și pentru evaluarea post-terapie.
2. Teste endoscopice
Cu ajutorul endoscopiei se prelevează biopsii de țesut gastric care vor fi analizate prin una din
modalitățile următoare:
A. Metode bazate pe urează: țesutul biopsiat se plasează într-o soluție de uree și un indicator
de pH. Prezența ureazei va descompune ureea și va crește pH-ul ceea ce va determina virarea
culorii indicatorului de pH.
B. Teste care țin de diagnosticul de laborator microbiologic: fragmentele bioptice obținute
din corpul și antrul stomacului sunt strivite pe o lamă (amprentare), fixate cu alcool metilic timp
de 1 minut, uscate și apoi colorate timp de 20 de minute cu soluție Giemsa1/10 preparată
extemporaneu. Se poate utiliza și impregnarea argentică Warthin-Starry (aceasta a fost metoda
orginală de evidențiere a Helicobacter de către Warren și Marshall în 1983) Apare morfologia
caracteristică de vibrioni sau spirili. Cultivarea, deși reprezintă o modalitate foarte specifică și
prezintă în plus avantajul de a putea permite testarea sensibilității la antibiotice nu se realizează
în mod curent din cauza unor dificultăți tehnice și a sensibilității reduse (un număr relativ mare
de infecții cu H. pylori nu au fost validate utilizând această modalitate de diagnostic). H. pylori
este un microorganism pretențios, cu creștere lentă, care are nevoie de condiții speciale pentru
a se dezvolta. Totuși, considerăm că ar fi necesare mai multe eforturi în acest sens.
62
16. GENUL HAEMOPHILUS
1) Haemophilus Influenzae
1. Habitat: Se poate găsi la nivelul mucoasei tractului respirator uman. Poate coloniza şi
mucoasa conjunctivală, precum şi tractul genital la 30-70% din persoanele sănătoase.
2. Morfologie: În produsul patologic germenii sunt prezenţi sub formă de cocobacili Gram-
negativi, mici (1-1,5 / 0,3mm), uneori dispuşi în lanţuri scurte. În cazul anumitor tulpini pot
apărea forme filamentoase, aberante. Frotiurile colorate pentru depistarea hemofililor trebuie
decolorate 20 secunde, pentru că hemofilii nedecoloraţi corect s-ar putea confunda cu
Streptococcus pneumoniae, iar recolorarea nu se face cu safranină (care nu colorează bine
hemofilii), ci numai cu fucsină bazică 0,1% sau cu fucsină Ziehl diluată 1/10, timp de 5 minute. În
culturi apar în funcţie de vârsta culturii şi de mediul de cultură:
- în medii bogate, la 6-8 ore, predomină formele cocobacilare, care au şi capsulă.
- în culturile vechi se caracterizează prin pleomorfism şi pierderea capsulei (probleme de
diagnostic diferenţial microbiologic). Polimorfismul apare odată cu „îmbătrânirea” culturii şi
este caracteristic tulpinilor în curs de trecere la forma „R”.
3. Caractere de cultură: Haemophilus influenzae necesită pentru iniţierea creşterii 5-10% CO2,
atmosferă umedă, la 35-37ºC, pH=7,6 incubat pentru o perioadă de minim 24-48 de ore. Pentru
cultivare sunt necesari factori de creştere precum (factorii X şi V).
Factorul X, termostabil (rezistă 45 minute la 120°C), este protoporfirina IX sau o
protohemă cu fier, prezentă în sânge sau în derivatele sale cu hemină şi asigurată în mediile de
cultură prin adaos de 5% sânge chocolatat, de suplimente XV, care conţin aproximativ 500
mg/ml factor X şi 150 mg/ml factor V, sau prin suplimentare cu hemină.
Factorul V, termolabil (rezistă numai 15 minute la 90°C), este nicotin-amid-adenin
dinucleotidul (NAD) sau NADPH (fosfat), prezent în hematii, dar eliberat, este distrus de
pirofosfatază şi NAD-ază, prezente în sângele de om, ovine, caprine, ori bovine (enzime
inactivate prin chocolatizare). Surse de factor V sunt suplimentele XV, extractul de drojdie, de
cartof sau tomate, diferite bacterii: stafilococ, Pseudomonas aeruginosa mucos, Escherichia coli,
levuri şi preparatele de NAD sau NADPH.
Ambii factori se obţin din eritrocite, însă este necesară eliberarea conţinutului acestora
în mediu (de exemplu prin căldură, sau prin digestie peptică). Factorul V este sintetizat şi de
stafilococul auriu, astfel că pe geloză-sânge coloniile de Haemophilus influenzae sunt mai
numeroase în jurul unor colonii de stafilococ (fenomenul de satelitism); util în identificare.
Pe geloză-sânge cu infuzie de inimă-creier apar colonii mici, rotunde, convexe, de tip S, care în
primele 24 ore prezintă irizaţii puternice, caracteristice. Nu apare hemoliză. Pe geloză-chocolate,
coloniile ating 1-3 mm abia după 36-48 ore, având aspectul unor picături de rouă.
4. Caractere biochimice: Sunt germeni aerobi facultativ anaerobi. Necesită pentru dezvoltare
factorii X şi V. Fermentează inconstant carbohidraţii. Majoritatea tulpinilor (70%) sunt indol-
pozitive (transformă triptofanul în indol). Pe baza unor teste biochimice specia a putut fi
împărţită în 8 biotipuri. Majoritatea tulpinilor izolate de la pacienţi se încadrează în biotipurile
I-IV; majoritatea tulpinilor cu capsulă de tip b fac parte din biotipul I. Rezistenţa în mediu este
scăzută. Prin uscare sunt distruşi rapid. În spută pot rezista până la 48 de ore. Sunt distruşi de
dezinfectanţii obişnuiţi sau de menţinerea timp de 30 minute la 56ºC.
5. Caractere antigenice: Tulpinile virulente prezintă o capsulă polizaharidică ce are o

compoziţie diferită, în funcţie de tipul serologic. Tipurile (a-f) se pot diferenţia prin reacţii de
umflare a capsulei şi de imunofluorescenţă folosind seruri specifice. Cel mai răspândit şi mai
patogen este tipul b, la care antigenul este poliribozil-ribitol-fosfat (PRP) şi prezintă înrudiri
63
antigenice cu Streptoccocus pneumoniae, Streptoccocus pyogenes, Stafiloccocus epidermidis,
Enteroccocus feccalis, Bacillus pumilus (majoritatea microorganismelor din flora normală a
tractului respirator nu prezintă capsulă). Totuşi, răspunsul imun faţă de structura capsulară de
tip b este slab, ineficient, în primii ani de viaţă (0-2 ani), exact în perioada în care infecţiile cu
H. influenzae au potenţialul cel mai grav.
Antigenele somatice sunt reprezentate de cel puţin două proteine: substanţa M, un
antigen de suprafaţă labil şi substanţa P, care constituie o parte însemnată a corpului bacterian.
Endotoxina (Ag 0, LOZ) se poate extrage de exemplu din culturi realizate în mediu lichid,
dar natura ei antigenică nu este foarte clară.
Tulpinile din tipul antigenic b produc bacteriocine (hemocine). Hemocinele prezintă
activitate faţă de tulpini capsulate de alte tipuri, faţă de tulpinile necapsulate, faţă de alte specii
de Haemophilus şi faţă de unele enterobacterii.
RĂSPUNS IMUN
La nou-născuţi şi la sugarii sub 3 luni există o stare de imunitate, anticorpii provenind de la
mamă. După această vârstă, concentraţia de anticorpi scade. În SUA, Haemophilus influenzae
este cea mai frecventă cauză de meningită la copii între 5 luni şi 5 ani. Diferite studii
demonstrează că la vârsta de 3-5 ani un număr important de copii au anticorpi anti-PRP care
contribuie la realizarea lizei dependentă de complement şi stimulează fagocitoza. Există o
corelaţie (insuficient de bine precizată practic) între anticorpii bactericizi şi rezistenţa la infecţii
grave cu Haemophilus influenzae.
CARACTERE DE PATOGENITATE ȘI PRINCIPALELE AFECȚIUNI PRODUSE

Haemophilus influenzae este un microorganism condiţionat patogen. Prezintă adezine
de suprafaţă (filamentoase). Endoxina are un rol redus în patogenitate. Rolul antigenelor
somatice urmează să fie clarificat. Rolul esenţial îl are capsula, iar din cele şase tipuri, tipul b
apare în circa 90% din cazurile severe de infecţie cu Haemophilus influenzae. H. influenzae mai
produce IgA protează şi 2 proteine pentru achiziţia de fier. Tulpinile necapsulate se pare că îşi
exercită virulenţa datorită structurii peptidoglicanului (cu acţiune pro-inflamatorie), LOZ, Cu şi
Zn-super oxid dismutaza.
Haemophilus influenzae este patogen prin multiplicare şi invazie. Microorganismul
pătrunde pe cale respiratorie. Boala debutează ca o rinofaringită acută, probabil în asociere cu o
infecţie virală la nivelul tractului respirator. Aceasta poate fi urmată de epiglotită,
laringotraheită, otită, sinuzită, mai rar de pneumonie, dar şi de meningită acută purulentă la
copiii mici preşcolari. Sinusurile sau urechea medie pot fi afectate prin extensie locală (se poate
nota faptul că Haemophilus influenzae tip b şi pneumococul se numără printre agenţii etiologici
comuni ai otitei medii bacteriene şi ai sinuzitelor acute). Dacă microorganismul pătrunde în
torentul sanguin, pe această cale poate infecta meningele. Ocazional infecţia cu H. influenzae
poate duce la o laringotraheită obstructivă fulminantă care necesită traheotomie sau intubare
promptă a copilului respectiv.
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR – meningita

Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu Haemophilus influenzae este
bacteriologic, direct. În vederea discutării examenului de laborator vom avea în vedere
meningita. În meningita produsă de H. influenzae diagnosticul este urgent (risc de evoluţie cu
sechele şi / sau deces), de importanţă maximă fiind recoltarea şi transportul rapid al LCR către
laborator.
64
antisepsie etc). În infecţiile produse de Haemophilus influenzae se pot recolta secreţii de la
nivelul tractului respirator superior sau inferior, secreţii din sfera ORL, lichide recoltate prin
puncţie, sânge, LCR etc. În continuare vom discuta cazul în care p.p. este reprezentat de LCR.
Aşa cum am mai menţionat, recoltarea LCR prin puncţie (după verificarea presiunii din artera
centrală a retinei prin examinarea fundului de ochi) trebuie făcută pe cât posibil la patul
bolnavului, având la dispoziţie tot ce este necesar pentru pregătirea frotiurilor, cultivarea pe
diferite medii de cultură, repartizarea unei cantităţi de LCR pentru examenul citologic şi
biochimic. În cazul în care p.p. urmează a fi transportat către laborator, transportul trebuie
realizat fără întârziere (la o temperatură apropiată de 37°C, refrigerarea este contraindicată). H.
influenzae ar putea fi izolat şi prin hemocultură, cultivarea secreţiilor nazale sau faringiene etc.
Din punct de vedere macroscopic, LCR poate avea aspect purulent.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri

din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de
metilen (AM) şi respectiv Gram. Dacă LCR este franc purulent frotiurile se pot executa direct
din p.p., în caz contrar realizăm iniţial centrifugarea LCR. Frotiurile se examinează la
microscopul optic cu imersie şi se notează prezenţa celulelor inflamatorii (ex. leucocite) şi
prezenţa cocobacililor Gram-negativi, fini, capsulaţi, dispuşi separat sau în grămezi „aranjate în
aceeaşi direcţie”, uneori dispuşi în lanţuri scurte, situaţi intra sau extraleucocitar. Datorită
faptului că aceste microorganisme se colorează relativ slab în coloraţia Gram, ar putea fi necesară
colorarea frotiului de rezervă printr-o altă metodă sau, recolorarea prelungită cu fucsină.

poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica. Haemophilus
influenzae este un microorganism foarte pretenţios care nu se poate dezvolta pe medii de cultură
obişnuite. Unele tulpini de Haemophilus influenzae necesită pentru iniţierea creşterii 5-10%
CO2. Este necesară pentru incubare o atmosferă umedă, la 35-37°C, şi o durată de minim 24-48
de ore. Pentru cultivare sunt necesari factori de creştere precum hemina (factor X) şi factorul V
care poate fi înlocuit prin NAD, NADP sau alte coenzime. Ambii factori se obţin din eritrocite,
însă este necesară eliberarea conţinutului acestora în mediu (de exemplu prin căldură, sau prin
digestie peptică). Factorul V este sintetizat şi de stafilococul auriu, astfel că pe geloză-sânge
coloniile de Haemophilus influenzae sunt mai numeroase şi de dimensiuni mai mari în
apropierea unei linii pe care a fost însămânţată o tulpină hemolitică de Staphylococcus aureus
(fenomenul de satelitism). Pe de altă parte, atunci când produsele însămânţate sunt potenţial
contaminate, este necesară folosirea mediilor selective (ex. cu bacitracină, vancomicină,
clindamicină şi amfotericină B). Coloniile sunt de tip S sau M şi ating un diametru de 0,5-0,8
mm după 24 de ore, respectiv 1-2 mm la 48 de ore, având aspectul unor picături de rouă pe
geloză-chocolate. Pe geloză-sânge cu infuzie de inimă-creier apar colonii mici, rotunde, convexe,
de tip S, care în primele 24 ore prezintă irizaţii puternice, caracteristice. Nu apare hemoliză.

caractere:
Caractere morfotinctoriale: sunt cocobacili Gram-negativi, mici (1-1,5 / 0,3 mm), dispuşi
separat sau în grămezi, uneori dispuşi în lanţuri scurte. În medii complexe, la 6-8 ore, predomină
formele cocobacilare, care au şi capsulă. În culturile vechi se caracterizează prin pleomorfism şi
pierderea capsulei (dificultăţi de diagnostic diferenţial microbiologic).
Caractere de cultură: produc coloniile de tip S sau M care ating un diametru de 0,5-0,8 mm
după 24 de ore, respectiv 1-2 mm la 48 de ore, având pe geloză-chocolate aspectul unor picături
de rouă. Necesită prezenţa în mediul de cultură a factorilor de creştere (X şi V). Factorul V este
65
sintetizat şi de stafilococul auriu, astfel că pe geloză-sânge coloniile de Haemophilus influenzae
sunt mai numeroase şi de dimensiuni mai mari în apropierea unei linii pe care a fost însămânţată
o tulpină hemolitică de Staphylococcus aureus (fenomenul de satelitism). Pe geloză-sânge cu
infuzie de inimă-creier apar colonii mici, rotunde, convexe, de tip S, care în primele 24 ore
prezintă irizaţii puternice, caracteristice. Nu apare hemoliză.
Caractere biochimice:
Testul porfirinei este util pentru a demonstra necesităţile de factor X.
Majoritatea tulpinilor (70%) sunt indol pozitive (transformă triptofanul în indol).
Fermentează inconstant diferiţi carbohidraţii. Pe baza unor teste biochimice (ex. indol, urează,
ornitin decarboxilază) specia a putut fi împărţită în opt biotipuri.
Utilizând galeriaAPI NH(manuală) putem identifica specii de Neisseria, Haemophilus şi
Branhamella catarrhalis, în numai 4 ore.
Caractere antigenice:
Se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de Haemophilus
influenzae, prin tehnici imunologice, în funcţie de Ag K. Tipurile (a-f) se pot diferenţia prin
reacţii de umflare a capsulei, imunofluorescenţă, aglutinare, latex-aglutinare şi coaglutinare.
Tiparea LOZ poate fi realizată prin Western blot, imunoprecipitare sau imunoradiotestare în gel.
Au fost caracterizate 5 serotipuri de H. influenzae.
Prin aceleaşi tehnici (Western blot, imunoprecipitare sau imunoradiotestare în gel), tipul b
capsular poate fi subtipat (11 subtipuri).
Tulpinile necapsulate se pot identifica şi tipiza prin Multilocus Enzyme Electrophoresis (MLEE)
sauprin tipizarea antigenelor OMP (electroforeză în gel de poliacrilamidă; această metodă poate
fi utilizată şi pentru subtiparea tulpinilor cu capsulă de tip b).
Alte teste: există sonde nucleotidice şi amorse (pentru PCR) produse comercial pentru
identificarea H. influenzae (atât din cultură cât şi din produse patologice).
5. Antibiograma este necesară şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. Este

recomandată utilizarea unui mediu special, respectiv Haemophilus test medium (HTM). Se pot
utiliza şi truse automate pentru testare (ex. ATB HAEMO cu citire şi interpretare după 18-24 ore
sau rapid ATB E 4 cu citire şi interpretare după 4-5 ore incubare). Determinarea CMI şi CMB
poate fi necesară şi se realizează prin metode clasice sau cu ajutorul testului E.
Deoarece se estimează că mortalitatea datorită meningitei cu Haemophilus influenzae,
în lipsa tratamentului, poate fi de până la 90%, la copii, punerea diagnosticului şi instituirea
tratamentului corect reprezintă un deziderat major. Diagnosticul prompt şi tratamentul
antimicrobian sunt esenţiale şi pentru scăderea implicării ulterioare neurologice şi intelectuale.
Multe din tulpini sunt încă sensibile la ampicilină (circa 25% produc β lactamaze sub control
plasmidic). Pentru infecţiile grave, până la obţinerea rezultatelor antibiogramei se poate
administra ceftriaxonă.
2) Haemophilus Ducreyi
1. Habitat: Este strict patogen pentru specia umană; se poate izola uneori din leziunile
bolnavului. Se dezvoltă intra- şi extracelular (mai frecvent).
2. Caractere morfologice: Bacil scurt (sau cocobacil), dispus în perechi sau lanţuri paralele,
Gram-negativ. Se colorează bipolar. Frotiurile colorate pentru depistarea hemofililor trebuie
decolorate 20 secunde, pentru că hemofilii nedecoloraţi corect s-ar putea confunda cu bacterii
Gram-pozitive, iar recolorarea nu se face cu safranină (care nu colorează bine hemofilii), ci cu
fucsină Ziehl diluată 1/10, timp de 20-30 minute. Frotiul colorat poate depista H. ducreyi în 40-
70% dintre cazurile însoţite de secreţii şancroide [cocobacili, intra- şi extraleucocitari, coloraţi
bipolar, dispuşi în lanţuri scurte sau medii, aspect asemănat de unii autori cu „lanţurile de
bicicletă”.
66
3. Caractere de cultură: Necesită pentru cultivare factorul X. Creşte optim dacă produsul
patologic este recoltat de la baza şancrului şi cultivat pe geloză-chocolate plus vancomicină 3
mg/ml la 33-35ºC şi atmosferă de 10% CO2. Coloniile sunt de dimensiuni mici şi apar după 3-7
zile de la cultivare. Sensibil la acţiunea căldurii, uscăciunii şi dezinfectanţilor obişnuiţi. Sensibil
la ampicilină, ceftriaxonă, cloramfenicol, rifampicină, biseptol, eritromicină, azitromicină,
claritromicină. Poate deveni rezistent.
4. Caractere antigenice: Toate tulpinile sunt identice şi posedă un antigen cu capacitate

sensibilizantă, precum şi antigenul O. Prezintă receptori pentru hemoglobină.
PATOGENITATE
Caracterele de patogenitate includ: pilii, LOZ, toxina citotoxică, OMP care leagă hemoglobina,
hemolizina, Cu-Zn superoxid dismutaza şi o proteină filamentoasă asemănătoare
hemaglutininei. La om, după câteva zile (în medie 5-7 zile) de la contactul sexual infectant, în
regiunea genitală apare şancrul moale (iniţial se formează o papulă sensibilă, cu eritem în jur,
urmată de apariţia unei pustule şi apoi a unei eroziuni care ulcerează), dureros, cu eritem şi
edem. Pot exista şancre multiple. Sângerează uşor dacă este manipulat. Ganglionii regionali sunt
măriţi, dureroşi şi pot supura. Nu sunt depăşite limfaticele învecinate. Diagnosticul diferenţial
trebuie făcut cu sifilisul, infecţia cu virusul Herpes simplex, limfogranulomatoza veneriană.

antisepsie etc). În infecţiile produse de Haemophilus ducreyi se pot recolta secreţii de la nivel
genital (raclarea secreţiei de sub marginea şancrului; puroi din abces).

metilen (AM) şi respectiv Gram. Putem vizualiza intra sau extra celular bacili de dimensiuni
mici, pleomorfi, Gram-negativi, dispuşi în perechi sau lanţuri paralele (în şiruri), frecvent în
asociere cu alte microorganisme. Se pot colora bipolar.

poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica (vezi şi anexa nr. 2).
Cultivarea H. ducreyi este dificilă. Necesită pentru cultivare factorul X. Se poate dezvolta dacă
produsul patologic este recoltat de la baza şancrului şi cultivat pe geloză-chocolate plus
vancomicină 3 mg/ml la 33°C în atmosferă de 7-10% CO2, timp de 3-7 zile.
4. Identificarea microorganismului se va realiza pe baza mai multor caractere:

Caractere morfotinctoriale: sunt bacili de dimensiuni mici, pleomorfi, Gram-negativi, dispuşi în
perechi sau lanţuri paralele. Se pot colora bipolar.
Caractere de cultură: produc coloniile de tip S de dimensiuni mici, după 3-7 zile de la cultivare.
Pe geloză-sânge pot produce hemoliză.
Necesită prezenţa în mediul de cultură a factorului de creştere (X);
Haemophilus ducreyi este catalază-negativ.
- Caractere antigenice:
- Tiparea antigenelor OMP permit clasificarea în 7 subtipuri;
- Pot fi utilizate în cadrul reacţiei de imunofluorescenţă indirectă.
67
5. Antibiograma este necesară şi poate realiza (cu dificultate) prin metode difuzimetrice.
Diagnosticul de laborator imunologic

Şancrul moale este singura afecţiune produsă de microorganisme din genul Haemophilus în care
diagnosticul serologic ar putea fi util. Identificare prezenţei anticorpilor este utilă şi în scop
epidemiologic. Se pot utiliza tehnici de tip ELISA pentru identificarea anticorpilor IgG sau IgM
care apar faţă de H. ducreyi.
Imunitate
Există răspuns imun umoral şi celular dar nu există imunitate faţă de reinfecţie.
Tratament
În şancrul moale se poate utiliza biseptol sau eritromicină pentru o perioadă de 2 săptămâni.
17. GENUL BORDETELLA – Bordetella Pertussis

1. Habitat: Bordetelele se pot localiza la nivelul cililor epiteliului respirator; nu au capacitatea
de a invada. Reprezintă microorganisme care infectează organismul uman, uneori şi animale cu
sânge cald.
2. Morfologie: Bordetella pertussis este un cocobacil Gram-negativ, cu dimensiunea de 0,5 μm

/ 0,5-2 μm, imobil. Atunci când este recent izolat prezintă capsulă. În primele ore de cultivare
prezintă pili ataşaţi de peretele bacterian. După 24 ore, pilii se pot identifica în mediul de cultură.
Prin treceri succesive microorganismul devine polimorf, lipsit de capsulă şi pili. De regulă
celulele bacteriene apar izolate sau în pereche, foarte rar în lanţuri. Dacă se practică o colorare
cu albastru de toluidină, se pun în evidenţă granule metacromatice situate bipolar.
3. Caractere de cultură: B. pertussis este unul din germenii care se cultivă şi se izolează dificil.
Fiind inhibat de acizi graşi, peroxizi organici etc, nu se dezvoltă pe mediile uzual folosite în
diagnosticul bacteriologic. Necesită pentru cultivare nicotinamidă sau acid nicotinic şi o
temperatură optimă de 35-37ºC. Cel mai cunoscut mediu de cultură este mediul Bordet-Gengou
care conţine agar, macerat de cartof, sânge, glicerol şi devine selectiv prin adăugare de penicilină
sau cefalexină. Albuminele plasmatice din acest mediu leagă acizii graşi şi permit dezvoltarea
microorganismelor. După 3-6 zile de incubare la 37ºC se pot dezvolta colonii de tip S mici,
convexe, uşor transparente, cu strălucire metalică, foarte aderente, înconjurate de un halou de
hemoliză (faza I). În lumina transmisă oblic par ca picăturile de mercur. La izolare este necesar
mediul Bordet-Gengou, însă prin treceri repetate coloniile se pot dezvolta şi pe geloză-sânge sau
pe geloză simplă. Microorganismul se va multiplica mai rapid, coloniile vor fi mai opace şi vor
apărea modificări morfologice (pleomorfism), alterări structurale, virulenţa fiind scăzută.
Incubarea se realizează 3-7 zile la 35-37ºC în atmosferă umedă. Ar fi de menţionat că în această
etapă de izolare diagnosticul poate fi urgentat, realizându-se identificarea microorganismului
prin imunofluorescenţă.
Aspecte genetice
Referitor la modificările antigenice care apar în cursul cultivării, s-a descris la Bordetella
pertussis variaţia de fază.
Faza I se întâlneşte la tulpinile izolate din produse patologice cultivate pe medii îmbogăţite. Sunt
tulpini în formă de S, virulente, capsulate cu mare capacitate imunogenă. Vaccinurile se prepară
folosind culturi în faza I. Fazele II şi III sunt intermediare.
68
Faza IV se întâlneşte la tulpini care se pot multiplica pe medii obişnuite. Au aspectul caracteristic
formelor R. Sunt degradate antigenic, nu produc toxină şi nu prezintă nici alţi factori de
patogenitate.
4. Caractere biochimice: Sunt germeni strict aerobi, cu temperatură optimă de dezvoltare 35-
37ºC, nu necesită prezenţa factorilor X sau V, metabolizează oxidativ o serie de aminoacizi (ex.
acidul glutamic) etc. Tulpinile virulente produc hemoliză. În afara organismului Bordetella
pertussis are o rezistenţă scăzută. Rezistă maximum 2 ore la temperatura camerei. Lumina solară
o distruge în 60 de minute, iar la 55ºC este distrusă în 30 de minute.
Structura antigenică este foarte complexă, bacteria prezentând spre exemplu:
- 1 hemaglutinină fimbrială (de natură proteică, cu structură filamentoasă, FHA);
- aglutinogene de suprafaţă (K), de natură proteică. Există aglutinogene specifice de gen şi de
specie. Datorită implicaţiilor epidemiologice, ar fi de menţionat că microorganismul are
capacitatea de a-şi modifica serotipul in vitro;
- la nivelul peretelui celular există lipopolizaharidul (endotoxina), antigen comun germenilor
Gram-negativi.
În afară de aceste antigene mai există şi o serie de substanţe active cu rol important în patogenia
bolii şi care ar putea fi grupate astfel:
- toxina pertussis (TP), factor major de virulenţă, dar şi cel mai important antigen şi imunogen.
Este o exotoxină formată din 2 subunităţi (A şi B);
- adenilatciclaza;
- toxina letală (dermonecrotică);
- citotoxina traheală.
RĂSPUNS IMUN
După infecţie apar titruri înalte de anticorpi anti-TP şi anti-FHA. Titrul anticorpilor anti-TP
persistă timp îndelungat (posibil pe tot parcursul vieţii), fiind corelaţi cu imunitatea faţă de o
nouă îmbolnăvire.
B. pertussis este patogenă în special prin localizare, multiplicare şi toxinogeneză. În

realizarea adeziunii la epiteliul ciliat respirator, un rol important îl au:
- fimbriile;
- aglutinogenele;
- hemaglutinina filamentoasă (FHA);
- pertactinele (PRNs);
- toxina pertussis.
Bacteria se multiplică rapid, interferă cu activitatea muco-ciliară normală, produce
toxine care determină apariţia manifestărilor clinice (toxinele au fost menţionate anterior).
Endotoxina (LOZ) are, probabil, un rol în patogenitate.
Bordetella pertussis este patogenă numai pentru om. Transmiterea se realizează în

special pe cale aeriană (picături Pflügge) într-un acces de tuse. Contagiozitatea este maximă în
primul stadiu de boală şi la începutul stadiului al doilea (de tuse paroxistică).
Microorganismul aderă, se multiplică rapid, interferă cu activitatea mucociliară normală, apar
primele manifestări clinice care se agravează treptat.
Substanţele toxice elaborate (şi în special TP) au următoarele acţiuni:
- după legarea subunităţii B (a TP) pe suprafaţa celulelor gazdei, are loc penetrarea subunităţii
A. Subunitatea A se leagă de proteina Gi de la nivelul membranei celulare, o inhibă şi rezultă o
69
stimulare a adenilatciclazei şi respectiv o creştere a sintezei de AMPc. Dintre efectele negative
care se datorează sintezei de TP putem enumera hipoglicemia, sensibilizarea la histamină,
reducerea activităţii macrofagelor, diminuarea răspunsului imun umoral (sinteza de anticorpi);
- adenilatciclaza pertussis diminuă activitatea fagocitară a macrofagelor şi leucocitelor;
- toxina letală produce necroze locale;
- citotoxina traheală produce ciliostază şi distrugerea celulelor respiratorii ciliate (favorizând,
probabil, acumularea de mucus, tusea şi apariţia infecţiilor secundare).
Boala la om se numeşte tuse convulsivă („tuse măgărească”). După o incubaţie de 7-10
zile, încep manifestările clinice care evoluează în două faze.
În prima fază (catarală), care durează aproximativ 10 zile, microorganismul colonizează
căile respiratorii superioare, determinând manifestări necaracteristice, asemănătoare unei
infecţii respiratorii obişnuite: tuse, strănut, temperatură. În această etapă, pacientul este foarte
contagios, elimină prin tuse un număr foarte mare de microorganisme. Diagnosticul de laborator
bacteriologic este posibil prin prelevări cu tampon steril de la nivelul faringelui sau prin metoda
„plăcilor tuşite”. Gravitatea şi durata bolii pot fi reduse dacă se face tratament antimicrobian
corect. În caz contrar simptomele se agravează treptat.
Faza a doua (paroxistică) este stadiul toxemic, cu accese de tuse paroxistică, accese
adeseori tipice, cu sonoritatea caracteristică. În acces, după o inspiraţie prelungită, forţată,
urmează 5-10 secuse expiratorii spasmodice, datorită contracţiei musculaturii bronşice şi glotice
(de unde şi denumirea de „tuse măgărească” dată bolii în ţara noastră sau de „cocqueleuche” în
limba franceză). Adesea accesul se termină cu vomă şi cu aspirarea vomismentelor. Pot apărea
cianoză, convulsii, anxietate.
La o parte dintre pacienţi nu apar accese paroxistice tipice. La cei la care apar, pot fi până
la 30 accese pe zi, mai frecvente în timpul nopţii. Pe parcursul stadiului toxemic apare şi
limfocitoza periferică caracteristică, precum şi hipoglicemia.
Datorită obstrucţiei bronhiolelor mici cu dopuri de secreţii mucoase, precum şi datorită
tusei şi inspirului amplu, pot apărea o serie de complicaţii pulmonare. Problema eliminării
secreţiilor este mai importantă la copii deoarece stagnarea secreţiilor contribuie la instalarea
hipoxiei şi dificultăţilor de nutriţie. Uneori apar complicaţii şi la nivelul sistemului nervos
central, care pot fi foarte grave (encefalita pertussis).
Faza a doua durează 2-4 săptămâni şi este urmată de convalescenţă, care durează 2-3
săptămâni.

antisepsie etc). În infecţiile produse de Bordetella pertussis se pot recolta secreţii de la nivelul
tractului respirator superior (nazal, faringian). Vom realiza recoltarea cu ajutorul tamponului
din alginat de calciu care se lasă pe loc 30-60 de secunde pentru a favoriza adsorbţia B. pertussis
(bumbacul inhibă dezvoltarea microorganismelor) sau prin aspirarea secreţiilor traheobronşice.
Este descrisă (istoric) şi metoda „plăcilor tuşite” (se expune o placă Petri cu mediul Bordet-
Gengou la care s-a adăugat antibiotic, deschisă, la aproximativ în faţa gurii bolnavului în timpul
accesului de tuse).
Este recomandată prelucrarea imediat a p.p., dacă este posibil la patul bolnavului
(microorganismul este foarte puţin rezistent în mediul extern). Nu există o metodă perfectă
pentru recoltarea p.p. atunci când se suspicionează o infecţie cu B. pertussis (toate metodele au
diferite limite atât din punctul de vedere al sensibilităţii sau specificităţii cât şi din punct de
vedere practic).
70
din produsul patologic, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram.
Examinăm frotiurile la microscopul optic cu imersie şi notăm prezenţa celulelor inflamatorii (ex.
leucocite) şi prezenţa cocobacililor Gram-negativi, dispuşi separat sau în perechi, rareori în
lanţuri scurte. Datorită faptului că aceste microorganisme se colorează relativ slab în coloraţia
ar putea fi necesară colorarea frotiului de rezervă printr-o altă metodă (imunofluorescenţă
directă) sau recolorarea prelungită cu fucsină sau safranină.

Bordetella pertussis este un microorganism foarte pretenţios care nu se poate dezvolta pe medii
de cultură obişnuite; este inhibat de acizi graşi, peroxizi organici etc. Izolarea B. pertussis în
culturi este dificilă, dar eforturile sunt necesare pentru a putea fi evaluată variaţia genetică (de
fază) şi respectiv pentru a putea supraveghea fenomenul apariţiei rezistenţei la antibiotice şi
chimioterapice.
Bordetella pertussis necesită pentru cultivare nicotinamidă sau acid nicotinic şi o
temperatură optimă de 35-37˚C, cu incubare timp de 3-7 zile, în aerobioză şi atmosferă umedă.
Cel mai cunoscut mediu de cultură este mediul Bordet-Gengou care conţine agar, macerat de
cartof, sânge, glicerol şi devine selectiv prin adăugare de penicilină / meticilină sau cefalexină.
Albuminele plasmatice din acest mediu leagă acizii graşi şi permit dezvoltarea
microorganismelor. Dezavantajul principal al mediului clasic Bordet-Gengou este reprezentat
de timpul scurt în care poate fi utilizat (1-7 zile).
Actualmente se recomandă utilizarea unui mediu folosit iniţial ca mediu de transport,
care include geloză nutritivă, cărbune activat şi este suplimentat cu 10% sânge de cal. Acest
mediu poate fi utilizat pe parcursul a 1-2 luni, iar coloniile de B. pertussis apar mai rapid.
În vederea izolării primare este necesar mediul Bordet-Gengou sau mediul cu cărbune activat,
însă prin treceri repetate coloniile se pot dezvolta şi pe geloză-sânge sau chiar şi pe geloză
simplă. Microorganismul se va multiplica mai rapid, coloniile vor fi mai opace şi vor apărea
modificări morfologice (pleomorfism), alterări structurale, virulenţa fiind scăzută.

caractere:
Caractere morfotinctoriale:
Sunt cocobacili Gram-negativi, mici, cu dimensiunea de 0,2-0,5 μm / 0,5-2 μm, imobili, dispuşi
separat sau în perechi, rareori în lanţuri scurte, cu tendinţa de a deveni pleomorfi în urma
subcultivărilor (pot apărea şi forme filamentoase).
Utilizând coloraţii speciale, în coloniile rezultate din primoculturi se pot evidenţia structurile
capsulare. Dacă frotiul se colorează cu albastru de toluidină, se pun în evidenţă granule
metacromatice situate bipolar.
Imunofluorescenţa directă este utilă şi pentru identificarea microorganismului după cultivare.
Caractere de cultură:
Produc colonii de tip S sau M. După 3-7 zile de incubare la 37˚C pe mediul Bordet-Gengou se pot
dezvolta colonii de tip S mici, convexe, uşor transparente, cu strălucire metalică, foarte aderente,
înconjurate de un halou de hemoliză (faza I).
În lumina transmisă oblic coloniile seamănă cu picăturile de mercur. Pe mediul cu cărbune
activat coloniile apar mai repede, sunt tot de tip S, mici, convexe, negre, cu suprafaţa perlată.
Bordetella pertussis este hemolitică, oxidază-pozitivă, urează-negativă.
Se pot utiliza truse comerciale manuale care identifică specii de bacili Gram-negativi (BGN) (ex.
API 20 E, API 20 NE), fiind de regulă necesare şi teste adiţionale de identificare.
71
Se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de Bordetella pertussis,
prin reacţia de aglutinare pe lamă.
Alte teste de identificare utilizate în laboratoare de referinţă:
Se poate utiliza amplificarea genetică folosind diferite amorse (primeri); tehnica PCR are o bună
specificitate şi sensibilitate dezavantajul principal fiind reprezentat de costul ridicat.
5. Antibiograma poate fi necesară în scopul supravegherii apariţiei fenomenului de rezistenţă

la antibiotice şi se realizează prin metode difuzimetrice.
Diagnosticul serologic este de mică importanţă pentru pacientul cu tuse convulsivă, deoarece o
creştere semnificativă a anticorpilor aglutinanţi sau precipitanţi se realizează abia din a doua sau
a treia săptămână de boală. Din punct de vedere tehnic au fost utilizate RFC, reacţiile de
aglutinare, hemaglutinare şi hemaglutinoinhibare sau tehnicile de tip ELISA. Diagnosticul
serologic poate fi realizat în cadrul unor studii epidemiologice, în scop de cercetare; ar putea fi,
eventual, util în diagnosticul diferenţial (retrospectiv).
TRATAMENT
Administrarea eritromicinei în faza catarală duce la blocarea multiplicării microorganismului,
reduce gravitatea simptomelor şi are valoare profilactică diminuând perioada în care pacientul
este contagios. Se mai pot administra rifampicină, tetraciclină, cloramfenicol, gentamicină dar
nu ampicilină. Tratamentul cu antibiotice, instituit după debutul fazei paroxistice, rareori mai
poate influenţa cursul boli. În general are drept mic beneficiu limitarea contagiozităţii
pacientului respectiv. Deosebit de important sunt tratamentul simptomatic, oxigenoterapia şi
respiraţia asistată, hidratarea, eliminarea secreţiilor, măsurile generale nespecifice, în special la
nou-născuţi şi copii mici la care tusea convulsivă rămâne o importantă problemă medicală.
Eficiente sunt şi administrarea de sedative şi aspirarea secreţiilor.
18. GENUL BRUCELLA

1. Habitat: Habitatul principal al brucelelor este reprezentat de organismul infectat (în sistemul
reticuloendotelial, la nivel genital), dar germenii pot supravieţui şi în mediul înconjurător.
Animalele menţionate mai sus reprezintă gazdele cele mai frecvente, dar infecţia se poate întâlni
şi la alte animale. Există o serie de mecanisme care le asigură persistenţa, dintre care se poate
aminti posibilitatea transformării în condiţii nefavorabile în forme L („persister”).
2. Morfologie: În culturi proaspete, brucelele sunt cocobacili Gram-negativi, imobili (se poate
observa o capsulă fină utilizând tehnici speciale de colorare), nesporulaţi, izolaţi sau mai rar
prezenţi în grămezi neregulate. În produsul patologic sunt găsiţi în special intracelular. În culturi
mai vechi prezintă un important grad de polimorfism.
3. Caractere de cultură: Toate speciile au cerinţe nutritive complexe necesitând pentru

dezvoltare, la prima izolare, medii îmbogăţite cu substanţe nutritive (aminoacizi, proteine
serice, glucoză, săruri, vitamine, factori de creştere etc). Dacă produsul patologic este potenţial
contaminat, se recomandă utilizarea mediilor selective (cu bacitracină, cicloheximidă, acid
nalidixic, nistatină, polimixină B şi vancomicină).
Microorganismele sunt aerobe, facultativ anaerobe. Dintre cele patru specii considerate
importante şi pentru om, numai Brucella abortus necesită la prima izolare o atmosferă cu 5-10%
CO2. Creşterea este lentă, mai ales la prima cultivare, iar coloniile (de tip S) devin vizibile după
2 sau mai multe zile. Plăcile cultivate se vor menţine la incubator un timp suficient de lung
(uneori câteva săptămâni). Pentru hemoculturi este utilizat în mod curent mediul bifazic
72
Castaneda (hemocultura trebuie supravegheată minimum 3-4 săptămâni). Mediul lichid este
tulburat uniform (dar pot apărea depozite sau o peliculă la suprafaţă). Tulpinile de Brucella spp.
au fost implicate de multe ori în „accidente de laborator”, motiv pentru care manipularea
produselor şi culturilor trebuie să se realizeze cu precauţie.
4. Caractere biochimice: Activitatea metabolică este scăzută. Utilizează carbohidraţi, dar nu

produc hidrogen sau gaz în cantităţi suficiente pentru o eventuală utilitate în clasificare. Toate
brucelele produc catalază şi descompun în mod variabil ureea. Se pot folosi o serie de aminoacizi
(ex. L-alanina, L-asparagina) şi o serie de carbohidraţi (ex. L-arabinoza, D-galactoza) pentru
evaluarea metabolismului oxidativ al tulpinilor de Brucella spp.
Brucelele sunt destul de rezistente în mediu, mai ales dacă sunt înconjurate de un strat
protector (în ţesuturile fetale infectate eliminate pot rezista săptămâni de zile; B. melitensis
poate rezista 6 zile în urină, 5-6 săptămâni în praf şi 9-10 săptămâni în apă sau sol). Sunt moderat
sensibile la temperatură şi aciditate. Pasteurizarea laptelui le distruge. Sunt sensibile la
majoritatea substanţelor dezinfectante, respectând protocolul de lucru (concentraţie, timp de
expunere etc. stabilit).
5. Caractere antigenice: Brucella spp. are o structură antigenică relativ complexă.

Antiserurile de la animale imunizate cu o tulpină de tip S aglutinează cu cele patru specii
principale. Au fost propuşi doi determinanţi antigenici diferiţi, A şi M (polizaharide de
suprafaţă). Aceştia sunt prezenţi în proporţii diferite la speciile studiate. Antigenul abortus (A)
este determinantul major de suprafaţă la Brucella abortus şi Brucella suis şi determinant minor
(a) la Brucella melitensis. Antigenul M predomină la Brucella melitensis şi este determinant
minor (m) la celelalte două specii.
A fost descoperit un antigen de suprafaţă L asemănător cu antigenul Vi de la Salmonella.
Tulpinile capsulate prezintă un antigen de tip K. La nivel parietal există lipopolizaharidul (Ag O,
endotoxina), care diferă de Ag O al altor germeni Gram-negativ prin compoziţia în acizi graşi şi
faptul că este strâns legat de proteine, formând împreună un complex, ceea ce îi determină o
activitate biologică distinctă.
RĂSPUNS IMUN
Bruceloza acută, la fel ca şi administrarea de vaccinuri cu tulpini vii atenuate, determină atât un
răspuns imun umoral cât şi un răspuns imun celular. În principiu, o dată cu apariţia semnelor şi
simptomelor se pot detecta anticorpi, dar prezenţa lor nu previne bacteriemia şi nici reinfecţia
(care este relativ frecventă). Imunitatea celulară are un rol critic în rezistenţa faţă de o nouă
îmbolnăvire. Răspunsul imun celular este în mod cert necesar pentru eradicarea brucelelor
situate intracelular.

Caracterele de patogenitate se manifestă prin capacitatea germenilor de a se multiplica
şi de a invada organismul. Brucelele sunt microorganisme parazite pentru o serie de animale sau
pentru om, capabile să determine infecţii acute, cronice dar şi infecţii inaparente. Dintre
animalele de laborator, cobaiul pare să fie animalul cel mai constant sensibil. Cronicizarea
depinde de capacitatea de multiplicare în celule fagocitare. Cele mai patogene specii sunt
Brucella melitensis, urmată de Brucella suis şi de Brucella abortus.
Nu s-au detectat exotoxine; nu s-au pus în evidenţă constituenţi antifagocitari capsulari
sau ai peretelui celular. Brucelele prezintă, însă, un grad de rezistenţă faţă de distrugerea de
către PMM explicabilă prin faptul că nu are loc stimularea metabolismului oxidativ şi este
inhibată degranularea neutrofilelor, precum şi descărcarea enzimelor din granulaţii.
Supravieţuirea intracelulară pare să fie favorizată de existenţa: Cu-Zn superoxid-dismutazei,
unor proteine de şoc termic (de „tip” Gro EL, HtrA etc).
73
Pare să existe şi un factor de patogenitate neprecizat, produs numai in vivo, care ajută
supravieţuirea intracelulară (de ex. tulpini de Brucella abortus virulente provenite din culturi de
monocite sau din placentă bovină infectată supravieţuiesc mai bine decât aceleaşi tulpini
cultivate pe medii artificiale). Endotoxina (antigenul O, LPZ) este implicată în patogenitate.
Incubaţia este în medie de 2-3 săptămâni, însă uneori pot trece câteva luni între
momentul infectării şi apariţia fenomenelor clinice.
Debutul este de obicei insidios, manifestat prin astenie, indispoziţie, cefalee, artralgii,
febră moderată, transpiraţii abundente.
În perioada de stare simptomele sunt polimorfe, bruceloza fiind una din bolile extrem de
greu de recunoscut clinic. Febra „ondulantă” (care creşte în cursul după amiezii şi scade în
timpul nopţii) însoţită de frisoane are mai mult o valoare istorică. În realitate, curba febrilă are
un aspect variabil (poate fi ondulantă, neregulată, renitentă şi intermitentă). Transpiraţiile
abundente nocturne, cu un miros caracteristic, astenia, durerile sub diverse forme reprezintă
alte elemente care pot fi comune în cursul bolii.
S-au descris circa 200 de semne clinice care pot apare în bruceloză.
Durata bolii poate fi de 3-4 săptămâni, dar cel mai frecvent depăşeşte 3 luni, ajungând în
formele cronice la ani de zile. În formele cronice diagnosticul se stabileşte foarte dificil.
Formele cele mai grave apar ca urmare a infecţiei cu Brucella melitensis, urmată de
infecţia cu Brucella suis, Brucella abortus şi respectiv Brucella canis.
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR - bruceloză

cunoscute, în special cât mai rapid după debutul bolii şi înainte de iniţierea antibioterapiei.
Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de sânge, dar s-ar putea recolta şi prin
puncţie ganglionară, puncţie medulară (rata de izolare creşte), puncţie hepatică sau splenică,
sau ar putea fi reprezentat de LCR, urină, bilă, lapte, materiale necroptice etc., în funcţie de
simptomatologie şi stadiul bolii. În continuare vom discuta situaţia în care se realizează o
hemocultură prin metode clasice sau în sisteme de cultivare rapide, de tipul BactAlert, Bactec
sau Septi-Chek. Tehnica PCR, utilizând un fragment de 223 perechi de baze, ar putea fi utilizată
atât în bruceloza acută, cât şi în bruceloza cronică. Este de luat în considerare la pacienţii care
au primit, deja, antibiotice sau chimioterapice.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic nu aduce de regulă informaţii utile

diagnosticului, în special dacă este vorba de sânge. Se poate folosi tehnica imunofluorescentă
care uneori duce la rezultate pozitive.

Toate speciile au cerinţe nutritive complexe necesitând pentru dezvoltare medii îmbogăţite cu
substanţe nutritive (aminoacizi, proteine serice, glucoză, săruri, vitamine, ser, sânge etc). Se
recomandă efectuarea hemoculturilor în mediul bifazic (solid-lichid), ex. tip Castaneda. Cultura
se incubează în atmosferă de 5-10% CO2, la 37ºC pentru o perioadă de minim 2-3 zile; culturile
negative trebuie urmărite până la 4 săptămâni. În cazul mediului bifazic, vom însămânţa panta
de mediu solid la fiecare 2-3 zile, fără a deschide flaconul.

Toate speciile au cerinţe nutritive complexe necesitând pentru dezvoltare medii îmbogăţite cu
substanţe nutritive (aminoacizi, proteine serice, glucoză, săruri, vitamine, ser, sânge etc). Se
recomandă efectuarea hemoculturilor în mediul bifazic (solid-lichid), ex. tip Castaneda. Cultura
se incubează în atmosferă de 5-10% CO2, la 37ºC pentru o perioadă de minim 2-3 zile; culturile
74
negative trebuie urmărite până la 4 săptămâni. În cazul mediului bifazic, vom însămânţa panta
de mediu solid la fiecare 2-3 zile, fără a deschide flaconul.

caractere:
Caractere morfotinctoriale: sunt cocobacili Gram-negativicu dimensiuni de 0,5-0,6 mm/ 0,6-
1,5 mm, dispuşi izolat sau în perechi, lanţuri scurte, grupat. Se pot colora bipolar. Poate fi
necesară o prelungire a timpului de recolorare cu fucsină, altfel sunt palid coloraţi.
Pe mediile îmbogăţite corespunzătoare nutritiv, pot produce după 2-3 zile colonii de tip S, cu un
diametru de circa 1 mm; dimensiunea coloniilor se măreşte astfel încât la 1 săptămână de
incubare diametrul poate fi de 6-7 mm; pot fi identificate (în special după incubare prelungită)
colonii de tip R sau M;
Examinate folosind o sursă de lumină la 45º, coloniile apar transparente, galben-deschis,
asemănător „picăturilor de miere” în timp ce în lumina reflectată prezintă o transparenţă
cenuşiu-albăstruie.
Brucella spp. după repicare pe un mediu neselectiv prezintă un metabolism oxidativ;
Microorganismele sunt catalază-pozitive, în timp ce testarea reacţiilor oxidazei, ureazei şi
producerii de H2S pot da rezultate variabile; se pot utiliza sisteme clasice de testare, dar este
posibilă şi utilizarea galeriilor API (ex. API 20E);
Testăm necesitatea în CO2, pentru izolare;
Se mai pot verifica metabolizarea glucozei, lactozei precum şi sensibilitatea la diferiţi coloranţi
incluşi de ex. în medii de cultură (ex. tionină sau fucsină bazică).
Utilizăm seruri imune anti-Brucella adsorbite, prin reacţii de aglutinare pe lamă (există reacţii
încrucişate); în cazul unei reacţii pozitive, la nivelul laboratoarelor de referinţă se pot realiza
reacţii de aglutinare pe lamă cu seruri imune monospecifice (anti-A, M sau anti-R în cazul
coloniilor de tip R).
Testarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza în studii epidemiologice sau în
scop de cercetare, fiind rezervată laboratoarelor de referinţă; spre exemplu fagul Tbilisi lizează
tulpinile de B. abortus, poate liza la concentraţii crescute tulpinile de B. suis, dar nu lizează
tulpinile de B. melitensis, B. canis sau tulpinile în formă R.
Alte teste utilizate în identificare la nivelul centrelor de referinţă:
- tehnici ale biologiei moleculare (există sonde nucleotidice specifice pentru diferite
biotipuri izolate mai frecvent, de ex. 1 şi 3 aparţinând B. melitensis; s-a pus la punct şi tehnica
PCR, pornind de la cultura bacteriană).
5. Antibiograma se realizează prin metoda difuzimetrică standardizată, şi este utilă atât în

scopul supravegherii apariţiei unor tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene, cât şi
pentru stabilirea tratamentului corespunzător în cazul unei maladii infecţioase în general dificil
de tratat.
Este de multe ori necesar, ţinând cont de dificultăţile obţinerii diagnosticului
bacteriologic pozitiv. Utilizăm antigene cunoscute şi încercăm să determinăm prezenţa
anticorpilor specifici în sângele pacientului, valoarea titrului anticorpilor şi respectiv evoluţia
acestui titru în dinamică. Trebuie să menţionăm că anticorpii de tip IgM cresc în infecţia acută
(în câteva săptămâni) dar persistă şi în infecţia cronică sau chiar şi după tratamentul antibiotic
realizat corespunzător (timp de 1-2 ani). Anticorpii de tip IgG apar după circa 3 săptămâni de la
debutul brucelozei, ating o valoare maximă la 6-8 săptămâni şi persistă în cazul unei infecţii
cronice.
75
În special din punct de vedere istoric discutăm şi putem practica în cadrul lucrărilor
practice, aglutinarea pe lamă (Huddleson, reacţie calitativă, de screening). Cea mai cunoscută şi
utilizată tehnică de diagnostic serologic este reacţia de aglutinare în tuburi (Wright) prin care
putem determina atât titrul anticorpilor de tip IgM cât şi cel al anticorpilor de tip IgG.
Având în vedere faptul că în bruceloză apar şi anticorpi blocanţi (Ac de tip IgA care
blochează activitatea aglutinantă a Ac IgM sau IgG), care pot persista ani de zile, există dificultăţi
şi în ceea ce priveşte interpretarea rezultatelor obţinute în diagnosticul serologic.
Pentru a simplifica, considerăm că un titru ≥ 1/160 este sugestiv, în timp ce o creştere de
4 ori în dinamică a titrului, poate confirma diagnosticul de bruceloză.
Există o serie de variante tehnice care permit reducerea erorilor de interpretare:
→ diluarea suplimentară a serurilor de cercetat;
→ testul de blocare (adăugăm tuburilor în care reacţia Wright este negativă câte 1 picătură
de ser imun anti-Brucella; dacă reacţia rămâne negativă şi nici în acest caz nu apare
aglutinarea, concluzionăm că în serul de cercetat există anticorpi blocanţi);
→ testul Coombs;
→ utilizarea unei tehnici de tip ELISA pentru detectarea Ac de tip IgM şi IgG care apar faţă
de proteinele membranei externe etc.
Un test Wright negativ nu exclude diagnosticul de bruceloză. Există studii în care s-a
demonstrat că există pacienţi la care reacţia de aglutinare a fost negativă, dar Brucella spp. a fost
izolată prin hemocultură.
Diagnosticul imunobiologic
Datorită faptului că în infecţia cu Brucella spp. este stimulat în special răspunsul imun mediat
celular, diferiţi autori menţionează utilizarea intradermoreacţiei cu brucelină în investigarea
unui caz suspect de bruceloză. IDR cu brucelină poate identifica existenţa unei stări de
hipersensibilitate de tip IV, faţă de antigenul brucelos.
TRATAMENT
Brucelele pot fi sensibile la tetraciclină sau ampicilină. Se recomandă utilizarea tetraciclinei în
combinaţie cu gentamicina sau varianta recomandată de OMS (rifampicină + doxiciclină, timp
de minim şase săptămâni). Ameliorarea simptomatologiei se poate produce în câteva zile de la
începerea tratamentului. Totuşi, datorită localizării intracelulare a germenului, tratamentul
trebuie să fie prelungit (mai multe săptămâni).
19. GENUL FRANCISELLA

1. Habitat: Francisella tularensis infectează animalele sălbatice şi domestice (iepuri, şobolani,
şoareci, popândăi, hârciogi, bizami, veveriţe etc) precum şi păsările. Agentul patogen este
prezent şi la unele căpuşe, muşte de animale şi ţânţari. În focarele de infecţie căpuşele joacă un
rol important (în ele microorganismul poate persista 2-3 ani). În plus, ele pot transmite
microorganismul transovarian.
2. Morfologie: Francisella tularensis este un cocobacil Gram-negativ, foarte mic (0,2-0,3 μm

/0,6-1 μm) coloraţia fiind adesea bipolară şi relativ slabă. Prezintă o capsulă fină. Microscopul
electronic a pus în evidenţă şi elemente cocobacilare mai mici, de 0,1μm, sub posibilităţile de
rezoluţie ale microscopului optic, care pot trece prin filtrele uzuale pentru sterilizare
bacteriologică. Microorganismul este imobil, necapsulat (la microscopul optic), nesporulat.
76
3. Caractere de cultură: Coloniile cresc lent (2-10 zile) la prima inoculare. Se preferă folosirea
unor medii speciale, cu gălbenuş de ou coagulat (McCoy) sau cu cisteină-glucoză-sânge la
temperatura de , în condiţii de aerobioză. Coloniile sunt mici, transparente şi uşor de emulsionat
(tip S).
4. Caractere biochimice: Francisella tularensis prezintă o activitate biochimică redusă. Poate

fermenta unii carbohidraţi sau alcooli fără producere de gaz. Este catalază-pozitivă şi oxidază-
negativă. Testele biochimice nu prezintă importanţă în diagnosticul curent. În mediul extern F.
tularensis poate fi distrusă rapid de căldură. Este rezistentă la frig (de exemplu, carnea de iepure
îngheţată poate rămâne infecţioasă în anumite condiţii). Muştele pot purta agentul patogen
circa 14 zile, iar căpuşele 2-3 ani. Este distrusă de antisepticele şi dezinfectantele uzuale.
5. Caractere antigenice: Tulpinile de Francisella tularensis sunt omogene antigenic, dar genul
poate fi împărţit în două serotipuri. Tipul A este întâlnit în special în America de Nord şi include
două subspecii (tularensis şi nearctica). Tipul B include două subspecii (holarctica şi
mediasiatica). Materialul extracelular (capsula) conţine lipopolizaharide şi carbohidraţi. Au fost
extrase şi o serie de antigene localizate la nivelul peretelui. Există unul sau mai multe antigene
proteice înrudite cu antigenele aglutinante ale genului Brucella. Francisella tularensis prezintă
de asemenea antigenul somatic O (endotoxina, LPZ).
RĂSPUNS IMUN
Imunitatea după infecţie este durabilă (ţine toată viaţa), deşi au fost înregistrate câteva cazuri
de reinfecţie la persoane care lucrau în laborator. Anticorpii aglutinanţi apar de regulă după 7-
10 zile de la debutul bolii, cresc până la un nivel maxim care se menţine pe toată durata bolii şi
scad în convalescenţă, rămânând la aceste valori ani de zile. Nu au efect protector. Tendinţa bolii
de a progresa precum şi desele recăderi sau cronicizarea, care pot apărea în ciuda titrurilor
ridicate de anticorpi serici sau a răspunsului imun persistent, se datorează în mod cert capacităţii
de supravieţuire intracelulară a microorganismului. Imunitatea celulară reprezintă modalitatea
principală de apărare faţă de infecţie.

Factorii responsabili pentru patogenitatea F. tularensis nu sunt foarte bine definiţi.
Totuşi, componentele de suprafaţă ale celulei (materialul extracelular, capsula) sunt implicate
în patogenitate.
Endotoxina pare să aibă un rol în patogeneză similar cu cel al endotoxinei Salmonellei
typhi. F. tularensis subspecia tularensis include cele mai virulente tulpini. DL 50 este de 10
microorganisme. Rata fatalităţii (în lipsa tratamentului) este de circa 10-20%. Circa 1-2% dintre
persoanele tratate cu antibiotice şi chimioterapice pot avea o evoluţie nefastă, spre deces.
Francisella tularensis are o infecţiozitate foarte mare. Infecţia poate apărea după
penetrarea tegumentelor sau mucoaselor sau după inhalarea a numai 10-50 de microorganisme.
Cel mai adesea contaminarea se realizează printr-o soluţie de continuitate tegumentară.
Microorganismele se multiplică şi la locul de pătrundere, în 2-6 zile apare o inflamaţie, apoi o
papulă care se transformă într-o ulceraţie. Infecţia se propagă mai departe pe cale limfatică
prinzând ganglionii limfatici regionali, care se măresc şi încep să supureze. Microorganismele se
pot multiplica intracelular, supravieţuind mult timp în monocite sau în alte celule ale
organismului.
Diseminarea limfatică este urmată de o bacteriemie tranzitorie, cu formarea de focare în
diferite organe parenchimatoase, în special plămâni, ficat şi splină. Leziunile caracteristice sunt
reprezentate de noduli granulomatoşi care se pot necroza sau cazeifica. Mai pot apărea frison,
febră, cefalee, greaţă, vărsături, afectarea stării generale. În lipsa tratamentului corespunzător se
poate ajunge la delir şi comă.
77
Alte forme clinice sunt forma oculoganglionară, tularemia orofaringiană, pneumonia
tularemică, forma tifoidică etc.
De menţionat că diagnosticul pozitiv este sugerat de datele clinice, întărit de cele epidemiologice
şi confirmat de datele de laborator.
De subliniat faptul că un laborator în care se presupune că se lucrează cu F. tularensis trebuie să
asigure condiţii stricte de biosecuritate şi biosiguranţă.
Diagnosticul de laborator bacteriologic, deşi relativ dificil poate fi realizat (în laboratoare de
referinţă), dar în principiu, datorită riscurilor de infectare a personalului de laborator mai ales
prin formarea de nuclei de picătură contaminanţi, majoritatea cazurilor se diagnostichează
imunologic (în special serologic). Se foloseşte tehnica micro-aglutinării.
În vederea diagnosticului serologic este de reţinut că, anticorpii aglutinanţi apar la 7-10 zile de
la debutul bolii, ating un nivel maxim la 4-8 săptămâni; titruri dozabile pot persista mai mulţi
ani. Se preferă recoltarea a două probe la interval de 2 săptămâni. O creştere a titrului de 4 ori
la a doua recoltare pune diagnosticul unei infecţii recente.
TRATAMENT
Antibioticul de elecţie a fost streptomicina (interesul pentru streptomicină a scăzut nu datorită
apariţiei unor tulpini rezistente ci datorită efectelor adverse ale medicamentului). Gentamicina
şi ciprofloxacina par a fi la fel de eficace. Pot apărea recăderi. Pot fi folosite şi tetraciclina şi
cloramfenicolul, dar recăderile sunt mai frecvente, mai ales dacă tratamentul este întrerupt
prematur (este recomandată o cură de 2-4 săptămâni). Multiplicarea intracelulară a F. tularensis
creează dificultăţi în vindecarea tularemiei şi explică procentul de circa 5-10% recăderi.
20. GENUL PASTEURELLA

1. Habitat: P. multocida poate fi izolată de la nivelul tractului respirator şi gastrointestinal al
animalelor sălbatice şi domestice (pisică, câine, porc, cornute mari etc).
2. Morfologie: Germenul are formă cocoidă sau cocobacilară, este Gram-negativ, colorându-se
adesea bipolar. Unele tulpini sunt capsulate. Capsula se poate colora cu tuş de China. Pot
prezenta un polimorfism accentuat, astfel că, de ex. pe un frotiu efectuat din LCR-ul care provine
de la un organism infectat, aspectul poate sugera prezenţa concomitentă de microorganisme din
genurile Haemophilus şi Neisseria.
3. Caractere de cultură: Sunt aerobi, facultativ anaerobi, cresc uşor pe medii de cultură
obişnuite, la o temperatură optimă de 37ºC. Creşterea este stimulată dacă mediul conţine sânge
sau ser. Pe geloză-chocolate coloniile sunt de tip S, mici (0,5-), neuniforme, semitransparente,
uneori, cu aspect mucoid. Pe geloză-sânge coloniile sunt mici, cenuşii, nehemolitice.
Multiplicarea pare să fie stimulată în prezenţa unei concentraţii de 5-7% CO2. Cultura poate
avea un miros asemănător cu cel produs de culturile de E. coli (probabil datorită producerii de
indol). Nu se dezvoltă pe mediile utilizate atunci când presupunem o infecţie cu enterobacterii
(ex. MacConkey).
4. Caractere biochimice: Ca şi celelalte pasteurelle, P. multocida este oxidază-pozitivă şi

catalază-pozitivă, ornitin-decarboxilază-pozitivă, indol-pozitivă şi urează-negativă.
Fermentarea zaharurilor este corelată în general cu tipul antigenic şi cu originea tulpinii. În baza
78
caracterelor biochimice, specia se subîmparte în subspecii (Pasteurella multocida subspecia
multocida, subspecia septica şi subspecia gallicida).
5. Caractere antigenice: Pasteurella prezintă un antigen somatic O (LPZ). Tulpinile capsulate

care produc îmbolnăviri la animale au fost împărţite în 4 serogrupuri capsulare (A-E). La tipul
A, capsula mucoidă este formată în special din acid hialuronic. Acest tip capsular este cel mai
frecvent izolat din infecţile umane. Serogrupurile pot fi împărţite în serotipuri, pe baza structurii
LPZ.

P. multocida este patogenă în special prin multiplicare şi invazivitate. Capsula reprezintă
cel mai important factor protector, inhibând fagocitarea germenilor şi permiţând invadarea
organismului gazdă. Endotoxina este implicată în patogenia bolii. Unele tulpini de P. multocida
produc o toxină dermonecrotică (implicată mai ales în infecţiile localizate respirator) şi enzime
(ex. lipaze) care par a fi implicate patogenic.
Microorganismul are capacitatea de a se multiplica în celule atît intra, cât şi extracelular.
Infecţiile umane cu P. multocida se încadrează în trei grupe principale:
1. infecţii locale, celulite, abcese, uneori osteomielite etc. apărute după muşcături de
animale (cel mai adesea pisică sau câine);
2. infecţii ale tractului respirator (pneumonie, abces pulmonar etc);
3. infecţii sistemice (bacteriemie, meningită, septicemie).
Infecţiile la om au în majoritatea cazurilor un caracter sporadic, calea de contaminare
fiind reprezentată de un traumatism prin muşcătură (câine, pisică) sau înţepătură (zgârietură).
Din punct de vedere clinic, cel mai adesea după muşcătura unui animal, debutul este acut, cu
înroşire, umflare şi durere, la câteva ore de la traumatism. Adenopatia regională este variabilă,
iar febra nu este foarte mare.
În diagnostic trebuie pornit de la aspectul epidemiologic (expunerea la muşcătura unui
animal) şi apariţia în mai puţin de 24 de ore a unei celulite dureroase. Laboratorul trebuie alertat
în cazul suspicionării unei infecţii cu P. multocida, deoarece microscopic germenul poate fi
iniţial confundat cu H. influenzae, Neisseria spp. etc.
Diagnosticul de laborator este bacteriologic şi cuprinde etapele clasice ale diagnosticului
direct, recoltarea produsului patologic (puroi, serozitate recoltate din profunzimea zonei
muşcate etc), examenul frotiului din produs patologic, cultivarea (pe medii simple sau pe geloză-
sânge / geloză-chocolate) şi identificarea pe baza caracterelor morfologice, de cultură,
biochimice şi antigenice. Apariţia unor colonii cu bacili sau cocobacili Gram-negativi, oxidază-
pozitivi, indol-pozitivi, care nu se dezvoltă pe mediul MacConkey, la o persoană care a fost
zgârâiată sau muşcată de o pisică, este foarte sugestivă pentru infecţia cu P. multocida.
Microorganismul este sensibil la medicamentele β-lactamice (peniciline, cefalosporine),
tetracicline şi cloramfenicol. Testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice poate fi utilă
pentru surprinderea apariţiei unor tulpini rezistente (de ex. în 1991 a fost izolată o tulpină
„atipică”, rezistentă la penicilină, cefalotină, acid clavulanic, sulbactam, ticarcilină şi
tetraciclină), în cercetare şi în scop epidemiologic.
TRATAMENT
Pe lângă tratamentul corect, local al plăgii, este necesară terapia cu antibiotice (ex. penicilină G,
alte antibiotice β-lactamice).
79
21. GENUL CORYNEBACTERIUM
SPECII PRINCIPALE: în grupul „Corynebacterium diphtheriae” sunt incluse speciile C.

diphtheriae, C. pseudotuberculosis şi C. ulcerans (ultimele două fiind urează-pozitive). Specia
cea mai importantă este Corynebacterium diphtheriae (bacilul difteric). C. diphtheriae include
patru biotipuri: gravis, mitis, intermedius şi belfanti.
1. Habitat: C. diphtheriae poate fi identificat în tractul respirator superior uman (la 3-5% din
persoanele sănătoase), precum şi la nivel tegumentar (de regulă în leziuni dermice).
2. Caractere morfologice: După cultivare pe mediu Loeffler, apar ca bacili Gram-pozitivi,

măciucaţi (Korynee înseamnă măciucă, ciomag), cu tinctorialitate inegală datorită prezenţei
granulelor de polifosfat (corpusculi Babeş-Ernst) şi cu o dispoziţie care ar putea fi comparată cu
literele V, L etc. sau cu nişte „litere chinezeşti”. Se poate afirma că bacilul difteric, cu o
compoziţie a peretelui celular care cuprinde mai puţină mureină (circa 50-60%), este Gram-
pozitiv la limită. Pe alte medii de cultură morfologia este mai puţin caracteristică. Bacilii
difteroizi (de exemplu C. hoffmanni, C. xerosis etc) prezintă o colorare uniformă şi sunt dispuşi
în palisade.
3. Caractere de cultură: Bacilul difteric este izolat în cultură pură pentru prima oară în anul
1884, când Loeffler utilizează un mediu cu ser coagulat de bou (mediul Loeffler). Deşi este inclus
într-o singură specie, bacilul difteric prezintă variabilitate în ceea ce priveşte caracterele de
cultură şi de metabolism, deosebindu-se mai multe tipuri. Coloniile au aspect de creştere de tip
R (rough). Pe mediul Loeffler (mediu electiv) coloniile se dezvoltă în 8-12-18 ore, iar aspectul pe
frotiu este cel caracteristic. Trei tipuri de colonii (cu grade variate de patogenitate) se evidenţiază
pe mediile cu telurit (de exemplu Gundel-Tietz): tipul gravis produce colonii nehemolitice, mari,
cu suprafaţă granulară, gri-negre, în „margaretă”, cu margini crenelate; tipul mitis produce
colonii hemolitice, convexe, cu margini circulare, de tip S; tipul intermedius produce colonii
nehemolitice, mici, cu margini circulare, cu suprafaţa granulară. În cursul diagnosticului unei
infecţii cu bacil difteric este necesară utilizarea mediului de îmbogăţire OCST (ou-cisteină-ser-
telurit), un mediu lichid.
4. Caractere biochimice: Deşi se poate multiplica pe medii simple, bacilul difteric are o
dezvoltare mai favorabilă pe medii îmbogăţite cu proteine animale (de exemplu ou, ser de bou).
Capacitatea de fermentare a mono şi dizaharidelor permite identificarea speciei în cadrul
genului, iar fermentarea polizaharidelor permite stabilirea tipului (gravis) în cadrul speciei.
Bacilul difteric produce cistinază (care descompune cistina, eliberând H2S), reduce sărurile de
telur şi elaborează bacteriocine. Poate rezista în fragmente din „falsele membrane”. Este distrus
de căldura umedă (10 minute la 60º), alcool sau antiseptice uzuale, precum şi de antibiotice
(eritromicină, penicilină etc).
5. Caractere antigenice: Există diferenţe serologice între diferitele tulpini de Corynebacterium

diphtheriae, dar nu s-a putut elabora o clasificare serologică satisfăcătoare. În diagnostic nu se
folosesc identificările serologice. Cea mai importantă structură antigenică este reprezentată de
toxina difterică, un polipeptid termolabil, care conţine cel puţin patru determinanţi antigenici
diferiţi.
80
RĂSPUNS IMUN
Determină un răspuns imun umoral. Anticorpii antimicrobieni pot fi identificaţi, dar nu oferă
protecţie (sunt specifici de tip). Anticorpii antitoxină (care este identică la toţi bacilii difterici
toxigeni) oferă protecţie (neutralizează toxina). Titrul protector trebuie să fie mai mare de 0,03
UA / ml.

Bacilul difteric poate fi patogen prin multiplicare (la poarta de intrare) şi toxinogeneză
(tulpinile lizogenizate). Toxina (exotoxină) este aceeaşi pentru toate tulpinile toxigene. Infecta-
rea cu bacteriofagul temperat poate duce la starea de lizogenizare. Deoarece există fagi tox+ şi
fagi tox-, există tulpini lizogene care produc şi tulpini lizogene care nu produc toxină difterică.
În cazul producerii toxinei, s-a dovedit faptul că prezenţa fierului este esenţială, pro-
ducţia optimă realizându-se la concentraţii care variază între 0,14-0,50 mg Fe / ml.
Toxina difterică este alcătuită din două fragmente legate prin punţi disulfidice. Fragmen-
tul B (greutate moleculară 38.000 Da), reprezintă fragmentul de legare pe receptorii specifici ai
celulelor susceptibile şi facilitează pătrunderea fragmentului A. Fragmentul A este activ şi inhibă
elongarea lanţurilor polipeptidice în curs de formare, catalizând inactivarea translocazei ARNt
(numit factor de elongare 2) prezentă numai în celulele eucariote. Factorul de elongare 2 este
necesar pentru translocarea polipeptidil-ARNt de pe situsul acceptor pe situsul donor al ribozo-
mului celulei eucariote; prin inactivarea lui nu mai are loc interacţia ARNm-ARNt şi se stopează
adăugarea a noi aminoacizi lanţului polipeptidic în curs de formare.
În mod practic, toxina difterică (fragmentul A) catalizează o reacţie prin care se elibe-
rează nicotinamidă şi adenozin difosfat riboză, care cuplându-se cu factorul de elongare 2 for-
mează un complex inactiv (o toxină asemănătoare ca mod de acţiune poate fi produsă de unele
tulpini de P. aeruginosa). O moleculă de toxină opreşte sinteza proteică în celulă pentru mai
multe ore. Doza letală este de 0,1 mg / kg.
Poarta de intrare a bacilului difteric poate fi reprezentată de tractul respirator (faringe,
nas), de leziuni tegumentare sau, mai rar, de mucoasa genitală. După multiplicare rezultă o in-
flamaţie locală. În acelaşi timp, în cazul tulpinilor lizogene (infectate cu bacteriofagi tox+) începe
sinteza toxinei. Toxina difterică poate afecta orice tip de celulă din organism, dar are un „tro-
pism” special pentru celulele de la nivel cardiac (miocardită), nervos (demielinizare), renal (ne-
croză tubulară), suprarenalian, muscular şi hepatic. Cel mai probabil oprirea bruscă a sintezei
proteice este responsabilă de efectele necrotice, neurotoxice etc.
În câteva zile de la debutul infecţiei (şi producerii de toxină), Corynebacterium diphthe-
riae sintetizează o „structură” compusă din fibrină la care se adaugă leucocite, eritrocite, celule
epiteliale respiratorii distruse, bacterii, structură care a fost numită „falsa membrană” de culoare
gri-maronie (diphtera înseamnă membrană).
Încercarea de a îndepărta „falsa membrană” (foarte aderentă) duce la sângerări la nivelul
submucoasei prin ruperi de capilare. Această structură se poate forma local (amigdalian, farin-
gian, nazal, genital) sau se poate extinde, acoperind faringele, obstrucţionând arborele traheo-
bronşic (posibil cu asfixie mecanică, situaţie numită „crup difteric”) etc. La adăpostul „falsei
membrane”, bacilul îşi continuă multiplicarea şi sinteza de toxină care difuzează pe cale sangu-
ină şi conduce la apariţia unor tulburări la distanţă (tulburări de ritm cardiac, miocardită, difi-
cultăţi vizuale, de vorbire, de înghiţire etc).
Cu cât diagnosticul este mai tardiv, cu atât rata mortalităţii prin difterie creşte.
81
Au fost înregistrate forme de difterie invazivă, cu tulpini netoxigene, la persoane care se
droghează sau la alcoolici (artrită septică, osteomielită, endocardită difterică).
Datorită faptului că în ultimii aproape 22 ani nu au mai fost înregistrate cazuri de boală
în ţara noastră, există riscul nerecunoaşterii acestei patologii de către medicii care nu au văzut
niciodată un caz de difterie. Riscul apariţiei cazurilor există iar sistemul de sănătate trebuie să
fie în permanenţă pregătit pentru a reacţiona prompt, din toate punctele de vedere (recu-
noaştere clinică, stabilire diagnostic, instituire tratament, intervenţie „în focar” etc).
Diagnosticul direct (bacteriologic), cu realizarea etapelor corespunzătoare, este util pentru con-
firmare şi în scop epidemiologic.
cunoscute. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de secreţii de la nivelul faringe-
lui şi de secreţii nazale. În cazul prezenţei „falsei membrane” se recomandă detaşarea cu pre-
cauţie a acesteia şi recoltarea secreţiei aflate sub această structură. În vederea prelevării p.p. vom
utiliza minim patru tampoane diferite, trei pentru recoltarea secreţiilor faringiene şi al patrulea
pentru recoltarea secreţiilor nazale. Primul tampon va fi utilizat pentru realizarea frotiurilor, al
doilea se va utiliza pentru cultivare pe diferite medii de cultură solide, selective şi neselective
(ex. geloză sânge, Loeffler şi medii cu telurit de potasiu, precum mediul Tinsdale), în timp ce al
treilea şi al patrulea tampon vor fi introduse într-un mediu de îmbogăţire (OST, ou-ser-telurit).
Pentru fiecare cultivare în parte există un anumit algoritm. Spre exemplu, mediul Loeffler va fi
incubat pentru 4-8 ore la 35-37º C după care se va realiza un prim frotiu, colorat Gram. Dacă
rezultatul este negativ tubul se reincubează timp de 18 ore iar dacă este pozitiv se face o repicare
pe mediul Tinsdale şi se începe identificarea pe baza caracterelor biochimice.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic poate fi decisivă (în context clinic şi /
sau epidemiologic sugestiv) pentru începerea tratamentului specific. Realizăm minim două fro-
tiuri, unul colorat Gram iar celălalt colorat cu albastru de metilen. Prezenţa unor semne clinice
sugestive la care se adaugă vizualizarea pe frotiul colorat Gram a leucocitelor şi a unor bacili
gram-pozitivi (la limită), uşor incurbaţi, măciucaţi, aşezaţi în V, L sau „sub formă de litere chi-
nezeşti” în timp ce la coloraţia cu albastru de metilen (modificată) am putea remarca prezenţa
granulelor metacromatice putea conduce la administrarea de antitoxină difterică; diagnosticul
de certitudine urmează a fi stabilit ulterior.
poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica. Aspectul cel mai
caracteristic se înregistrează pe mediile cu telurit de potasiu (ex. Gundel-Tietz, Hoyle etc), după
24-48 de ore. Biotipul gravis formează colonii opace de tip R, plate, cu margini crenelate, cu
tendinţa de a se desface în fragmente atunci când sunt prelevate cu ansa, relativ dificil de emul-
sionat, de culoare cenuşie sau neagră, diametrul coloniei fiind de 1,5-2 mm. Biotipul intermedius
formează colonii opace de tip S, plate cu centrul mamelonat, de culoare cenuşie sau neagră cu
margine transparentă, diametrul coloniei fiind de 1,5-2 mm (dar se recunoaşte prezenţa unor
colonii de dimensiuni diferite). Biotipul mitis formează colonii de tip S care pot trece în forma
R prin „îmbătrânire”, cu suprafaţă lucioasă, culoare cenuşie sau neagră, translucide, diametrul
coloniei fiind de 0,5-1 mm. Biotipul belfanti formează colonii opace de tip S, de culoare cenuşie
sau neagră, diametrul coloniei fiind de 1,5-2 mm (dar se recunoaşte prezenţa unor colonii de
dimensiuni diferite).
82
caractere:
Caractere morfotinctoriale: Se examinează cel mai bine atunci când frotiul este realizat din
colonii apărute pe mediul Loeffler (aspecte „tipice” apar şi în cazul frotiurilor din p.p.). Sunt
bacili gram-pozitivi(la limită), polimorfi, cu dimensiuni de 1-8m / 0,5-0,8m, uşor incurbaţi, mă-
ciucaţi, aşezaţi în V, L sau „sub formă de litere chinezeşti”. Există recomandarea realizarea
unor frotiuri „colorate” imunofluorescent, ceea ce ar permite realizarea unui diagnostic mai ra-
pid.
· În funcţie de biotip, produc colonii de tip Ssau R, aşa cum am menţionat mai sus. Pe me-
diile de tipul gelozei-sânge aspectul morfologic este aproape similar, culoarea fiind albă sau gri
perlat. Biotipurile intermedius, mitis şi belfanti produc o zonă mică de b-hemoliză.
· Pe mediul Tinsdale coloniile sunt negre (datorită producerii de H2S) cu halo gri-maro.
Anumiţi autori menţionează că frotiurile realizate pornind de la coloniile dezvoltate pe acest
mediu permit evidenţierea granulelor metacromatice.
· Pe mediul Loeffler (mediu electiv) coloniile apar în 18 ore fiind albe, lucioase, bombate,
semicremoase, asemănătoare picăturilor de spermanţet.
· În scopul diferenţierii C. diphtheriae de alte specii ale genului se practică testul pirazi-
namidazei (negativ) şi cistinazei (pozitiv). Testul catalazei este pozitiv.
· Diferenţierea biotipurilor şi confirmarea diagnosticului de specie se realizează prin testul
catalazei (pozitiv), ureazei (negativ), reducerea nitraţilor şi fermentarea unor zaharuri.
· Se pot utiliza sisteme comerciale, precum galeriile API CORYNE care se bazează pe com-
binarea testelor biochimice cu testele enzimatice (20 teste)
· Se utilizează ser antitoxină difterică pentru identificarea producerii toxinei prin testul
ELEK (vezi şi capitolul 16). Testul poate fi interpretat la 24-48 ore; este un test simplu şi precis.
· Caractere de patogenitate:
· Testarea toxigenezei in vivo, pe cobai, la nivelul centrului de referinţă; cultura este
inoculată subcutanat la un lot de cobai neprotejaţi şi un lot de cobai protejaţi (cu antitoxină
difterică). În cazul în care cultura testată include microorganisme toxigenă, cobaii neprotejaţi
mor în 24-48 ore cu evidenţierea semnelor de intoxicaţie difterică.
· Testarea producerii de toxină pe celule Vero sau prin alte metode (Western-blot, ELISA,
PCR pentru subunităţi ale genei tox+ etc)
· Testarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia) se poate utiliza în studii epidemiologice
sau în scop de cercetare, fiind rezervată laboratoarelor de referinţă.
· Teste biochimice suplimentare
· tehnici ale biologiei moleculare (ribotipie, profilul de restricţie al unei regiuni caracteris-
tice, după amplificare genică etc).
5. Antibiograma se poate realiza prin metoda difuzimetrică standardizată, în special în scopul

supravegherii apariţiei unor tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene. De regulă,
tulpinile de C. diphtheriae sunt sensibile la antibioticele folosite uzual în tratament (penicilină,
eritromicină).
83
22. GENUL LISTERIA
1. Habitat: sunt bacterii larg răspândite în natură (la nivelul solului, plantelor), infectează ani-
male domestice (mai ales ovine) şi sălbatice, păsări, reptile, peşti. Pot fi izolate din alimente (ex.
brânzeturi). L. monocytogenes a fost identificată în lapte şi produse lactate, carne crudă sau
prelucrată, produse vegetale, fructe de mare etc.
2. Caractere morfologice: În culturi tinere au aspect pleomorf (forme cocoidale, cocobacilare

şi bacilare) fine, cu dimensiuni între 0,5 - 5 μm / 0,5 - 0,8 μm, Gram-pozitive. În culturi tinere
pleomorfismul este şi mai accentuat. L. monocytogenes este mobilă (în special la temperaturi
cuprinse între 18 - 22˚C), prezentând subterminal, flageli.
3. Caractere de cultură: Se poate multiplica la temperaturi ce variază între 2 - 45˚C (tempera-

tura optimă de multiplicare este cuprinsă între 20 şi 30˚C). În culturile iniţiale, temperatura scă-
zută favorizează multiplicarea Listeria spp. Creşte pe medii complexe, speciale, în atmosferă de
5 - 10% CO2. Produce colonii de tip S, mici în picătură de rouă. Şansele de identificare cresc în
cazul în care culturile primare se fac pe medii cu sânge. Pe aceste medii, coloniile sunt beta-
hemolitice.
4. Caractere biochimice: Nu lichefiază gelatina, nu produce indol, nu reduce nitraţii. Produce

catalază. Are o activitate fermentativă redusă şi puţin specifică. Poate produce acid dar nu gaz
fermentând o serie de carbohidraţi. Este un germen foarte rezistent în condiţiile mediului ex-
tern. În produse alimentare, vegetale, furaje, sol, ape de suprafaţă, pe obiecte, poate supravieţui
săptămâni sau luni de zile, putându-se chiar multiplica. Multiplicarea este favorizată de tempe-
ratura de 18 - 20˚C şi o umiditate de 25 - 35%. Rezistă la diferiţi agenţi chimici.
5. Caractere antigenice: L. monocytogenes prezintă antigene somatice (14 tipuri) şi respectiv

antigene flagelare H (15 tipuri). Dintre structurile antigenice somatice amintim acidul ribitol-
teichoic şi acidul lipoteichoic. Secretă o serie de proteine antigenice. Clasificarea în funcţie de
structura antigenică se face numai în laboratoare de referinţă şi poate avea utilitate epidemiolo-
gică.

Listeria monocytogenes este patogenă prin multiplicare şi invazivitate (prezintă o structură ase-
mănătoare proteinei M streptococice, produce diferite substanţe cu rol în invazivitate, inclusiv
lecitinaza, fosfolipaza C şi listeriolizina O, cu efect hemolitic). Infectează probabil iniţial celulele
intestinale, supravieţuieşte intracelular; se multiplică şi intramacrofagic.
Listerioza este o zoonoză. Infecţia umană apare accidental şi foarte frecvent evoluează inaparent.
Dintre manifestările clinice grave amintim listerioza perinatală, probabil o infecţie intrauterină
(avort spontan, naştere prematură, sepsis cu deces înainte sau relativ repede după momentul
naşterii etc). La adulţi pot apărea meningoencefalită, bacteriemie urmată de metastaze septice
(mai ales la imunodeprimaţi) şi mai rar, diferite infecţii focalizate.
84
Dintre toate tipurile antigenice, 90% dintre tulpinile izolate la om aparţin tipurilor Ia, Ib şi IVb.
Tipul IVb a fost mai frecvent asociat cu consumul de brânză făcută din lapte nepasteurizat. Aso-
cierea unor epidemii de listerioză cu consumul de alimente contaminate sugerează calea gastro-
intestinală drept cea mai importantă cale de pătrundere.
Dintre manifestările clinice grave se poate aminti listerioză perinatală, probabil o infecţie intra-
uterină, care se manifestă ca sepsis cu deces înainte sau relativ repede după momentul naşterii.
La adulţi pot apare meningoencefalită, bacteriemie (mai ales la imunodeprimaţi) şi mai puţin
frecvent, diferite infecţii focalizate.
Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu Listeria monocytogenes este bacteriolo-
gic, direct.
cunoscute (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice, cât
mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asep-
sie şi antisepsie etc). Diagnosticul de laborator se bazează pe izolarea şi identificarea microor-
ganismului, în special din sânge şi / sau din LCR. În infecţiile produse de Listeria monocytogenes
se mai pot recolta lichid amniotic, placentă, ţesut fetal, dar şi prelevate patologice contaminate
cu alţi germeni precum materii fecale, secreţii genitale, alimente, probe din mediul extern etc.
metilen (AM) şi respectiv Gram. Listeria monocytogenes se prezintă ca bacili sau cocobacili
Gram-pozitivi, cu dimensiuni de 0,5 - 5 μm / 0,5 - 0,8 μm, dispuşi izolat, în perechi sau în lanţuri
scurte, intra sau extracelular.
poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica. De menţionat că se
poate multiplica la temperaturi ce variază între 2-45˚C (temperatura optimă fiind de 20-30˚C);
în culturile iniţiale, temperatura scăzută favorizează multiplicarea L. monocytogenes („îmbo-
găţire la rece”); tolerează o atmosferă de 5 - 10% CO2 precum şi concentraţii de peste 5% NaCl.
În cazul p.p. necontaminate (sânge, LCR etc) vom utiliza spre ex. agar glucozat sau triptozat,
suplimentat cu 5% sânge de berbec. Atunci când dorim să realizăm izolarea pornind de la p.p.
contaminate (alimente, materii fecale etc) este necesar să folosim medii de cultură selective spre
exemplu însămânţăm iniţial o parte p.p. în 9 părţi de bulion peptonă-triptonă cu extract de carne
şi drojdie, suplimentat cu acid nalidixic şi acriflavină iar după 2-7 (sau chiar 30) zile de incubare
la temperatura frigiderului, incubăm încă 18-24 de ore la 35-37ºC. Ulterior realizăm o repicare pe
medii selective (ex. agar, acriflavină, polimixină B, clorură de litiu, ceftazidimă etc). Există şi alte
strategii folosite pentru izolarea L. monocytogenes.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor ca-
ractere:
• Caractere morfotinctoriale:
→ sunt bacili fini sau cocobacili Gram-pozitivi, cu dimensiuni de 0,5 - 5 μm / 0,5 - 0,8 μm,
dispuşi separat sau grupaţi în palisade, în perechi sau „în formă de litere” (asemănător
corynebacteriilor);
85
→ în culturile tinere predomină formele cocobacilare în timp ce în culturile vechi se carac-
terizează prin pleomorfism şi pot apărea forme filamentoase;
→ în preparatul proaspăt se poate demonstra mobilitatea, în special dacă s-a menţinut cul-
tura la 18-25ºC (sau la temperatura camerei);
• Caractere de cultură:
→ cultura degajă un miros de lapte acidulat;

→ L. monocytogenes formează colonii de tip S; după 1-2 zile de incubare la 35-37ºC pe agar
glucozat, coloniile ating un diametru de 1-1,5 mm (mai mici pe agarul triptozat); pot să
aibă aspect de picături de rouă;
→ pe agar-sânge, coloniile sunt înconjurate de o zonă discretă de β-hemoliză;
→ dacă însămânţăm prin înţepare o coloană de mediu semisolid, datorită mobilităţii va

apărea creşterea „în umbrelă”, caracteristică pentru L. monocytogenes;
→ multiplicarea la temperaturi extreme (2-45ºC) poate fi utilă pentru identificare;
→ L. monocytogenes produce o zonă discretă de β-hemoliză;
→ utilizarea unor tulpini standard de Staphylococcus aureus (pentru L. monocytogenes şi
L. seeligeri) sau de Rhodococcus equi (pentru L. ivanovii) în cadrul testului CAMP este
utilă pentru identificare;
→ L. monocytogenes este catalază-pozitivă, oxidază-negativă; fermentează o serie de car-

bohidraţi (fără producere de gaz);
→ se pot utiliza truse comerciale manuale (ex. API Listeria sau API 20 Strep) şi respectiv
truse automate (ex. rapid ID 32 Strep) care permit identificarea L. monocytogenes în 4-
24 de ore, în funcţie de trusa utilizată;
• Caractere antigenice:
→ se utilizează seruri cu anticorpi cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de Listeria mo-
nocytogenes, prin tehnici imunologice, în funcţie de Ag somatice sau flagelare;
→ serotiparea este utilă în scop epidemiologic; există 13 serotipuri (serovaruri) majoritatea
tulpinilor izolate la om aparţinând tipurilor Ia, Ib şi IVb;
• Sensibilitatea la bacteriofagi: lizotiparea poate fi foarte utilă în scop epidemiologic; există
tulpini care nu pot fi testate prin această metodă;
• Caractere de patogenitate:
→ în general, tulpinile de Listeria monocytogenes izolate de la pacienţi sunt virulente; în
laboratoare de referinţă pot fi efectuate însă şi teste de patogenitate;
→ se poate realiza cultivarea în bulion timp de 24 de ore, urmată de inocularea unei pică-
turi de cultură în sacul conjunctival la iepure sau cobai; tulpina virulentă va determina
apariţia unei conjunctivite purulente în 1-3 zile;
→ alte modalităţi de studiere a virulenţei tulpinilor izolate sunt reprezentate de inoculări
la şoareci imunocompromişi (inoculare intraperitoneală) sau de inocularea membranei
chorioalantoidiană a oului embrionat de găină;
86
• Alte teste rezervate centrelor de referinţă: în scop epidemiologic sau în cadrul unor studii
taxonomice se pot utiliza Multilocus Enzyme Electrophoresis (MLEE), analiza macrorestricţiei
ADN (RFLP), RAPD-PCR sau Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE).
5. Antibiograma poate fi necesară şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. În cazul
infecţiilor grave se vor determina CMI şi CMB. Tratamentul etiologic se poate face cu penicilină,
ampicilină sau cu penicilină asociată cu un aminoglicozid. Prezintă, de regulă, rezistenţă la chi-
nolone, cicline şi cefalosporine.
23. BACILLUS ANTHRACIS
Genul Bacillus aparţine familiei Bacillaceae şi cuprinde un număr foarte mare de specii,
dintre care în patologie sunt mai frecvent implicate B. anthracis, B. cereus şi B. subtilis. Mai
putem aminti B. licheniformis, B. megaterium, B. pumilus, B. thuringiensis etc., unele cu utilitate
practică. Cele mai multe dintre specii includ bacili lungi, imobili, sporulaţi, cu sau fără capsulă,
aerobi, facultativ anaerobi.
CARACTERE GENERALE
1. Habitat: Bacillus anthracis se găseşte în ţesuturile şi umorile animalelor bolnave; poate fi

eliminat în mediu prin dejecţiile acestora. Pe sol condiţiile sunt nefavorabile, iar germenul
sporulează. Sporii sunt extrem de rezistenţi, rezervorul principal pentru B. anthracis fiind
reprezentat de sol (bacil teluric).
2. Morfologie: Sunt bacili Gram-pozitivi cu dimensiuni relativ mari având 3-10µm / 2µm, cu
capetele tăiate drept, imobili, incapsulaţi (în ţesuturile animalelor bolnave). Sunt dispuşi în
lanţuri, dar şi 2 câte 2 sau izolaţi. Atunci când sporulează, sporul are diametrul mai mic decât
grosimea bacilului şi este dispus central.
4. Caractere de cultură: Germen aerob facultativ anaerob, se dezvoltă pe medii simple, la 35-
37ºC. Pe mediul cu agar formează colonii relativ mari, alb-cenuşii, de tip R, rugoase, „în cap de
meduză” sau „coamă de leu”. În bulion, lasă mediul limpede şi formează flocoane care se depun
pe pereţii eprubetei.
5. Caractere biochimice: Reduce nitraţii, este indol-negativ, urează-negativ, produce acetil-

metil-carbinol, lichefiază gelatina, hidrolizează cazeina. Rezistenţa formelor vegetative este
similară cu a celorlalte bacterii, fiind distruse de exemplu în 30 de minute la 60ºC. Sporii sunt
însă deosebit de rezistenţi. Sunt distruşi la temperatura de fierbere în circa 10 minute şi prin
autoclavare. În frotiuri fixate şi colorate nu îşi pierd vitalitatea. La temperaturi de -5ºC pot rezista
până la 10 ani. S-a reuşit germinarea sporilor păstraţi la întuneric şi la temperatura camerei după
mai mult de 30 ani.
6. Caractere antigenice: Bacilul antraxului are două grupe majore de antigene: celulare
(somatice) şi componentele complexului exotoxinic.
Antigenele somatice sunt reprezentate de polizaharidele peretelui celular, de antigenul
polipeptidic capsular şi de antigenele din spori (studiate în special după evaluarea riscurilor unui
atac bioterorist folosind spori de B. anthracis). Capsula are determinism plasmidic. Are
proprietăţi antifagocitare, protejează microorganismul de anticorpii litici şi pare să aibă un rol
important în patogenitate.
87
Exotoxina are de asemenea un determinism plasmidic şi constă dintr-un amestec de trei
proteine imunogene: 1. factorul edematos (EF); 2. antigenul protectiv (PA), capabil să inducă
producerea de anticorpi; 3. factorul letal (LF).
RĂSPUNS IMUN
Infecţia cu bacilul antraxului este urmată de apariţia de anticorpi faţă de toxină şi faţă de
polipeptidul capsular, anticorpi care pot fi detectaţi prin metode de laborator.
Principalii factori de virulenţă ai germenului sunt polipeptidul capsular (antigenul K) şi

toxina. Componenta PA a toxinei se leagă de membrana celulelor ţintă, facilitând legarea în
continuare a celorlalte două elemente (EF şi LF). Efectele biologice ale EF include edem local şi
inhibiţia funcţiilor PMN, fiind mediate de AMPc. Pătrunderea LF în celule, mediată de PA,
determină moartea acestora, mecanismul fiind însă necunoscut.
Manifestările clinice ale infecţiilor determinate de bacilul antraxului sunt reprezentate
de:
a). Antraxul cutanat, forma cea mai frecventă la om, este cunoscută sub numele de
„pustulă malignă”. Leziunea apare la nivelul unui traumatism cutanat (faţă, gât, membre
superioare), prin care pătrund sporii germenului. După o perioadă de incubaţie de 2-5 zile, la
locul inoculării apare o o papulă care se transformă în veziculă. Aceasta se sparge în cele din
urmă, lăsând locul unei cruste de culoare neagră, înconjurată de o zonă de edem considerabilă.
Netratată, infecţia poate disemina pe cale limfatică sau sangvină, determinând septicemie;
b). Antraxul pulmonar, apărut prin inhalarea de praf conţinând spori de bacil antrax, se
manifestă iniţial prin simptome uşoare şi nespecifice, similare cu cele ale unei infecţii de căi
aeriene superioare. În 2-3 zile (dar perioada de incubaţie poate atinge chiar şi 6-8 săptămâni)
apar semne de insuficienţă respiratorie acută (febră, dispnee, hipoxie, hipotensiune), decesul
purând surveni în 24 de ore de la declanşarea bolii;
c). Antraxul gastrointestinal apare prin ingerarea cărnii insuficient preparate provenite
de la animalul bolnav. Manifestările clinice sunt variabile şi includ febră, greaţă, vărsături, dureri
abdominale, diaree sangvinolentă şi uneori ascită formată brusc. Rata mortalităţii este foarte
crescută în această formă de boală.
Diagnosticul de laborator bacteriologic, direct trebuie realizat cât mai rapid; sunt urmate etapele
cunoscute dar există anumite particularităţi. Diagnosticul cazului de antrax porneşte de la datele
clinice şi epidemiologice. Examenul bacteriologic va putea confirma diagnosticul.

antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de secreţii de la nivelul
leziunilor cutanate dar se pot recolta şi aspirat din edemul local şi / sau din ganglionii regionali,
spută, materii fecale, alimente incriminate, lichid cefalorahidian, probe necroptice, sânge
(pentru hemoculturi) etc, în funcţie de forma clinică. În cazul în care este de presupus că p.p.
este contaminat se pot folosi o serie de metode, spre ex. utilizarea mediilor selective, tratarea
termică sau tratarea cu alcool a p.p. În cazul mediilor selective, agentul selectiv mai frecvent
88
utilizat este polimixina B. În cazul celei de a treia variante, utilizăm etanol steril de 95º. Vom
suspensiona p.p. în proporţie egală în etanol pentru o durată de 30-60 minute, la temperatura
camerei, după care vom preleva circa 0,25 ml din suspensie pe care o cultivăm pe mediul de
cultură ales. În cazul în care estimăm că transportul către laborator va dura mai mult de 60
minute, asigurăm o temperatură de transport de 2-8ºC. Trebuie să menţionăm faptul că atunci
când presupunem diagnosticul de antrax, trebuie luate măsuri de biosecuritate speciale.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea unor frotiuri care se

colorează cu albastru de metilen şi Gram; cel puţin un frotiu se va păstra de rezervă. Se mai pot
utiliza albastru de metilen policrom (McFadyean) sau coloraţia imunofluorescentă, pentru
evidenţierea capsulei bacteriene. În p.p. se pot remarca structuri tisulare, leucocite şi bacili
Gram-pozitivi, cu capetele „tăiate drept”, de dimensiuni mari (1-1,5mm / 3-10mm), capsulaţi,
dispuşi izolat, în perechi sau lanţuri scurte, incluşi într-o capsulă comună. În coloraţia cu
albastru de metilen policrom bacilii apar albaştri iar capsula apare ca un halo de culoare roz.
Relativ recent au fost realizaţi anticorpi care, marcaţi fluorescent, pot permite identificarea
formelor vegetative (Ac anti-Ag din perete sau anti-Ag K) sau sporilor de B. anthracis (Ac
policlonali anti-Ag sporale; pentru eliminarea reacţiilor încrucişate, se poate face o „pre-tratare”
cu Ac-anti spori de B. cereus).

Putem utiliza geloză nutritivă sau geloză-sânge, în condiţii de aerobioză, la o temperatură de
37ºC (deşi se poate multiplica între 15 şi 42ºC). În cazul în care este de presupus că p.p. este
contaminat se pot folosi metodele menţionate mai sus. Pentru izolarea B. anthracis se poate
folosi un mediu cu polimixină B, lizozim, EDTA şi acetat de thalium, mediul PLET.

caractere:
• Caractere morfotinctoriale
→ sunt bacili Gram-pozitivi cu dimensiuni de 1-1,5mm / 3-10mm, care se pot dispune în

lanţuri lungi;
→ dacă începe procesul de sporogeneză, sporul este oval, situat central, mai mic decât
grosimea bacilului respectiv;
• Caractere de cultură
→ pe medii simple produc colonii de tip R, mari, cu diametrul de 2-; marginile sunt
neregulate, cu prelungiri laterale filamentoase care au permis asemănarea acestora cu
„capul de meduză” sau „coama de leu”;
→ pe mediile cu sânge, poate apărea o zonă discretă de β-hemoliză deşi în mod caracteristic
B. anthracis este non-hemolitic;
→ pe medii speciale se poate stimula dezvoltarea capsulei polipeptidice;
→ pe mediul PLET produc colonii mici, de tip S;
89
• Caractere biochimice
→ Bacillus anthracis este catalază-pozitiv, produce lecitinază şi este sensibil la penicilină

(faţă de majoritatea speciilor din genul Bacillus, rezistente la penicilină); există şi alte
teste biochimice care sunt efectuate la nivelul centrului de referinţă;
→ un alt caracter care trebuie investigat se referă la motilitate, absentă în cazul B. anthracis
şi prezentă la majoritatea speciilor din genul Bacillus; în acest scop putem însămânţa o
coloană de geloză moale, cu incubare la 37ºC pentru 1-4 zile şi urmărim dezvoltarea
culturii faţă de traseul pe care am însămânţat asemănător cu interpretarea aspectelor pe
mediul MIU, în cazul enterobacteriilor;
• Caractere antigenice: Identificarea toxinelor (componentele PA, EF şi LF) prin tehnici

de tip ELISA;
• Caractere de patogenitate
→ testarea producerii capsulei in vitro, caracteristică tulpinilor virulente de B. anthracis se

poate realiza prin cultivare (repicare) pe un mediu care conţine bicarbonat de sodiu
(0,7%), la 37ºC şi în prezenţa unui procent crescut de CO2; după 24 de ore, tulpinile
capsulate vor produce colonii mucoide iar prezenţa capsulei se va demonstra
microscopic (ex. coloraţia McFadyean sau Giemsa);
→ testarea patogenităţii la şoarecele alb (
→ testarea sensibilităţii la bacteriofagul g
• Alte caractere / teste utilizate în identificare la nivelul centrelor de referinţă
→ testarea sensibilităţii la penicilină, pe de o parte ar putea fi utilă în identificarea unei

tulpini de B. anthracis obişnuite (sensibilă la penicilină), dar ar putea permite şi
demonstrarea apariţiei unor tulpini mutante (aşa cum s-a întâmplat în cadrul izbucnirii
epidemice din regiunea Sverdlovsk);
→ testări biochimice suplimentare;
→ examen microscopic (frotiuri colorate cu negru Sudan pentru identificarea prezenţei
globulelor lipidice de β-hidroxibutirat);
→ alte teste pentru demonstrarea sensibilităţii la penicilină (ex. testul colierului de perle);
→ tehnici de biologie moleculară (depistarea prezenţei plasmidelor pX01 şi pX02).
5. Antibiograma nu este necesară. Bacillus anthracis este sensibil la penicilină, tetraciclină,

cloramfenicol, gentamicină ciprofloxacină etc (care se pot utiliza în cazul pacienţilor cu HS de
tip I la penicilină).
În ceea ce priveşte diagnosticul imunobiologic, în România a fost pusă la punct tehnica IDR
cu antraxină (Bălteanu-Toma). Această tehnică este încă utilizată în unele dintre statele care au
făcut parte din URSS.
Este de o deosebită importanţă punerea diagnosticului de antrax la animale (în special

ierbivore), principalul rezervor pentru Bacillus anthracis. În acest scop, se pot utilizat tehnici ale
diagnosticului bacteriologic (evidenţierea microscopică a bacililor în leziuni, obţinerea de
90
culturi, identificarea antigenelor prin reacţii de precipitare sau tehnici de tip ELISA; reacţia
Ascoli) sau ale diagnosticului imunologic (intradermoreacţia cu antraxină).
TRATAMENT
Se efectuează cu Penicilina G, administrată în doze de 2 milioane de unităţi la 6 ore, timp de 7-
10 zile (la adulţi). În caz de alergie la penicilină se pot folosi de ex. eritromicină sau tetraciclină,
la fiecare 6 ore. Cloramfenicolul poate fi de asemenea util în terapia acestei afecţiuni.
24. GENUL CLOSTRIDIUM
Genul Clostridium include peste 170 de specii (faţă de 83 specii listate în 1986) care se pot
găsi în intestinul animalelor şi se pot elimina în mediul exterior prin materiile fecale. O parte
dintre aceste specii sporulează. Cele mai multe dintre specii sunt anaerobe.
Fenomenul de anaerobioză a fost descoperit în anul 1861, de către Louis Pasteur, care a
identificat şi fermentaţia butirică produsă de Vibrion butyrique (numele actual fiind Clostridium
butyricum). Până în anul 1880, aceste specii erau incluse în genul Bacillus.
Reprezintă un grup foarte heterogen, în cazul căruia secvenţierea ARNr 16S nu a condus
la o clasificare suficient de clară. Se discută despre existenţa a 19 sub-grupuri. Spre exemplu,
primul sub-grup include: Clostridium tetani, C. botulinum, C. baratii, C. butyricum etc. Trei
dintre aceste sub-grupuri includ peste 70% din flora normală intestinală.
Sunt bacili Gram-pozitivi (uneori „la limită”), de dimensiuni mari, aşezaţi în perechi sau
lanţuri, mobili cu cili peritrichi (ex. cu excepţia C. perfringens sau a C. butyricum). Multe dintre
specii sintetizează exotoxine.
În cele ce urmează vom discuta despre speciile care produc tetanosul, botulismul şi
gangrena gazoasă.
Tetanosul este produs de Clostridium tetani patogen prin multiplicare la poarta de

intrare şi toxinogeneză (produce o exotoxină neurotropă). Neuronii motori spinali sunt de obicei
inhibaţi de către glicină şi acidul g aminobutiric. Toxina blochează eliberarea acestor mediatori
ceea ce determină excitarea neuronilor motori spinali, cu apariţia de spasme severe şi dureroase
ale musculaturii striate (paralizie spastică). Conştienţa este păstrată. Toxina poate ajunge la
nivelul SNC şi retrograd prin propagare pe cale axonală de la poarta de intrare sau pe cale
sangvină. Clinic, la 4-5 zile de la contaminare apar spasme ale musculaturii din zona
contaminată, apoi ale muşchilor masticatori, manifestate prin trismus (gura nu se mai poate
deschide) şi facies de tip risus sardonicus (spasme ale musculaturii faciale). Orice stimul extern
precipită un atac de tetanos. Moartea se poate produce prin asfixie; mortalitatea este de circa
50%.
Botulismul apare de obicei prin ingestia de alimente care conţin toxina produsă de
Clostridium botulinum, fiind o toxiinfecţie alimentară de tip toxic (toxină preformată în
aliment). Toxina botulinică este cea mai puternică otravă cunoscută; doza letală pentru om este
de circa 1-2 mg. După ingerare, toxina se resoarbe la nivel intestinal, ajunge în circulaţie, iar pe
această cale la nivelul plăcilor neuromotorii unde împiedică eliberarea de acetilcolină
91
(determină paralizie flască). Paralizia începe la extremitatea cefalică (ex. paralizia muşchilor
globilor oculari care apare la 18-24 ore de la ingestie şi se manifestă prin diplopie) şi evoluează
descendent. Decesul poate surveni prin asfixie (datorită paraliziei muşchilor respiratori).
Botulismul infantil (posibil şi la adulţi) este urmare a formării toxinei botulinice prin germinarea
la nivel intestinal a sporilor ingeraţi. Mortalitatea în botulismul neo-natal este foarte mare.
Botulismul plăgilor poate apărea la persoane care folosesc droguri injectate intravenos sau
prezintă leziuni contaminate cu pământ.
Gangrena gazoasă este produsă de două sau mai multe dintre următoarele specii: C.
perfringens, C. novyi (C. oedematiens), C. septicum, C. histolyticum, C. sporogenes etc. Sporii
clostridieni ajung la nivel tisular prin contaminarea unor leziuni (traume). În condiţii de
anaerobioză sporii germinează, formele vegetative se multiplică, fermentează zaharuri şi apare
gaz. Distensia tisulară, obstrucţia mecanică a structurilor vasculare în conjuncţie cu sinteza de
toxine favorizează diseminarea infecţiei. Enzimele (toxinele) produse contribuie şi la alterarea
gravă a stării generale. Gangrena gazoasă este caracterizată prin edeme dure, crepitante (datorită
prezenţei de gaz) şi necroză. Necroza tisulară se extinde, multiplicarea bacteriană se amplifică,
apare anemie hemolitică, toxemie şi evoluţie (în 20-80% din cazuri) către deces.
C. TETANI
Tetanosul a fost cunoscut încă de pe vremea lui Hipocrate, sau chiar şi înainte de menţiunile
făcute de acesta. Etiologia tetanosului a reprezentat un mister până în anul 1884 (anul
vizualizării la microscop a bacilului tetanic); în anul 1889 au fost obţinute primele culturi de C.
tetani.
CARACTERE GENERALE
1. Habitat: În stare vegetativă sunt prezenţi în intestinul omului şi al animalelor. Eliminaţi în

mediul extern (pe sol), sporulează. Sporii sunt foarte rezistenţi.
2. Morfologie: Sunt bacili mari, Gram-pozitivi, cu capetele rotunjite, mobili, cu cili peritrichi.
În prezenţa oxigenului sporulează, formând un spor terminal, mai mare decât diametrul celulei
bacteriene, care conferă germenului aspectul de băţ de chibrit.
3. Caractere de cultură: Cresc pe medii simple, în condiţii de anaerobioză, formând colonii

rotunde, de tip S, înconjurate de o zonă pufoasă.
4. Caractere biochimice: Elaborează o hemolizină, o exotoxină neurotropă, proteaze,

gelatinaze etc. Formele vegetative sunt distruse de expunerea timp de 15-20 de minute la
temperaturi de 55-60°C şi de substanţe dezinfectante. Sporii rezistă la temperatura de 100°C, dar
sunt distruşi prin autoclavare la 120°C şi 1 atm, timp de 30 de minute şi la pupinel timp de 1 oră
la 180°C.
5. Caractere antigenice: Prezintă antigene flagelare de tip H, de perete (antigenul somatic O)

şi o exotoxină cu structură proteică. Toţi bacilii tetanici elaborează un singur tip de toxină, sub
control plasmidic.
92
RĂSPUNS IMUN
Apare un răspuns imun umoral, cu producere de anticorpi antitoxină, dar care nu sunt utili din
punct de vedere al protecţiei şi nici în scop diagnostic.
Cl. tetani este patogen prin multiplicare la poarta de intrare (nu are capacitate de invazivitate)
şi toxinogeneză (produce o toxină neurotropă).
Filtratul de cultură are două componente tetanolizina, care produce liza hematiilor unor specii
animale şi tetanospasmina, care inhibă eliberarea acetilcolinei, interferând astfel cu activitatea
sinapsei neuromusculare şi inhibă neuronii spinali postsinaptici, blocând eliberarea unor
mediatori inhibitori, determinând astfel spasme musculare generalizate, hiperreflexie şi
convulsii.
Neuronii motori spinali sunt de obicei inhibaţi de către glicină şi acidul g aminobutiric. Toxina
blochează eliberarea acestor mediatori, ceea ce determină excitarea neuronilor motori spinali,
cu apariţia de spasme severe şi dureroase ale musculaturii striate (paralizie spastică). Conştienţa
este păstrată. Toxina poate ajunge la nivelul SNC şi retrograd prin propagare pe cale axonală de
la poarta de intrare sau pe cale sangvină.
Clinic, la 4-5 zile de la contaminare apar spasme ale musculaturii din zona contaminată, apoi ale
muşchilor masticatori, manifestate prin trismus (gura nu se mai poate deschide) şi facies de tip
risus sardonicus (spasme ale musculaturii faciale). Orice stimul extern precipită un atac de
tetanos. Moartea se poate produce prin asfixie; mortalitatea este de circa 50%.
PROFILAXIE
Se adresează plăgilor cu risc tetanigen, plăgilor contaminate cu alte bacterii aerobe piogene care
consumă oxigen şi cele contaminate cu pământ; acestea asigură condiţii de anaerobioză, în care
sporii trec în formă vegetativă, se multiplică şi elaborează exotoxina ce ajunge la nivelul centrilor
motori bulbari.
Se face profilaxia tetanică a următoarelor tipuri de plăgi:
- plăgi înţepate profunde, în care nu există o suprafaţă de contact cu oxigenul;

- plăgi traumatice mari, profunde, cu margini neregulate, cu resturi de ţesuturi devitalizate care
consumă oxigenul din plagă şi care creează condiţii de anaerobioză;
- plăgi postoperatorii (septice) sau posttraumatice.
În orice situaţie este obligatorie toaleta chirurgicală a plăgii, ce constă în:

- deschiderea largă a plăgii;
- desfacerea marginilor plăgii şi tăierea „franjurilor”;
- îndepărtarea resturilor tisulare;
- spălarea cu apă şi săpun;
- administrarea de substanţe oxidoreducătoare (H2O2) (nu spirt medicinal).
93
În plus, dacă persoana a fost corect imunizată, se face rapel cu ATPA (anatoxină tetanică
purificată şi adsorbită). Anticorpii antitoxină tetanică vor apărea în aproximativ 2 zile.
Dacă persoana nu a fost vaccinată, atitudinea este următoarea:

- se face vaccinare cu ATPA;
- se administrează şi ser antitetanic (în altă zonă decât cea în care s-a efectuat vaccinarea);
- se administreaza penicilină timp de 10 zile (sau eritromicină în cazul în care există
hipersensibilitate faţă de penicilină).
Profilaxia specifică se realizează prin vaccinare DTP:

- vaccinarea începe la 2 luni (3 administrări succesive), cu 2 rapeluri;
- la 6-7 ani se face un nou rapel cu DT;
- ulterior se fac eventuale rapeluri cu ATPA sau dT (este indicată administrarea de anatoxină
tetanică, la fiecare 10 ani).
DIAGNOSTIC DE LABORATOR
Diagnosticul de laborator al infecţiilor produse de germenii anaerobi este laborios, costisitor şi

de regulă poate fi definitivat numai în laboratoare specializate; sunt necesare dotări speciale şi
un personal medical cu experienţă. În continuare vom prezenta câteva aspecte privind
diagnosticul de laborator în infecţiile produse de microorganismele din genul Clostridium.
1. Etapa de recoltare şi transport a p.p. este esenţială; trebuie menţinute condiţiile de

anaerobioză.
2. Din punct de vedere macroscopic am putea menţiona mirosul putrid al p.p., prezenţa unor
fragmente de ţesut necrotic, a unor secreţii de culoare închisă, existenţa de sânge şi puroi în
plagă etc.
Examenul microscopic are rol orientativ (pentru majoritatea laboratoarelor este şi
ultima activitate care poate fi realizată atunci când agentul etiologic este un microorganism
anaerob). C. tetani are dimensiuni de 0,5-2 mm / 2-18 mm şi poate prezenta un spor rotund
localizat terminal, C. botulinum are dimensiuni de 0,5-1,5 mm / 3-20 mm şi poate prezenta un
spor oval localizat central sau subterminal iar C. perfringens are dimensiuni de 0,5-1,5 mm / 1,5-
19 mm şi poate prezenta un spor oval localizat subterminal. Examenul microscopic poate
permite în acelaşi timp un control al calităţii p.p. (evidenţiind prezenţa celulelor inflamatorii şi
a celulelor lezate) şi ar putea servi la alegerea terapiei antimicrobiene.
3. Pentru cultivarea p.p. vom pregăti cel puţin 3 medii de cultură: bulion VF (viande-foi) cu
acid tioglicolic şi albastru de metilen (care testează digestia cărnii de către clostridii), mediul
geloză - sânge suplimentat cu neomicină 100 mg / ml incubat în anaerobioză şi mediul geloză -
sânge incubat în condiţii aerobe. Pentru p.p. provenite din abcese sau din plăgi care sugerează
gangrena gazoasă am putea folosi şi mediul Nagler (cu gălbenuş de ou) care permite evaluarea
producerii de lecitinază şi lipază.
Pentru a distruge formele vegetative şi a reţine sporii putem proceda aşa cum am arătat
în capitolul 10 (tehnici de izolare speciale).
Incubarea în condiţii de anaerobioză durează 24-48 de ore la 35-37º C.
Înainte de a trece la etapa de identificare trebuie să încercăm să dovedim că am izolat
germeni anaerobi şi să verificăm puritatea culturii care urmează a fi identificată. În condiţiile în
care p.p. a fost însămânţat pe 2 plăci cu geloză - sânge incubate aerob şi anaerob, este util să
94
realizăm examenul microscopic al coloniilor. Dacă apar colonii asemănătoare în ambele plăci iar
din punct de vedere microscopic prezintă caractere similare, este vorba de microorganisme
facultativ anaerobe. Dacă pe frotiurile din coloniile izolate pe mediul incubat în anaerobioză
apar şi alte tipuri morfologice, înseamnă că există microorganisme strict anaerobe. Pentru a
verifica puritatea culturii obţinute, înainte de a trece la etapa de identificare, repicăm coloniile
suspecte în bulion VF regenerat (prelevăm colonia prin decupare cu geloza subiacentă).
Incubăm timp de 24 ore la 35-37º C.
În cazul în care există multiplicare bacteriană procedăm la a. realizarea unui frotiu
colorat Gram (şi comparăm rezultatele cu cele obţinute anterior); b. repicarea pe o pantă de
geloză nutritivă cu incubare în aerobioză (nu trebuie să apară cultură bacteriană în cazul în care
bacteriile izolate anterior sunt anaerobe). Dacă rezultatele sunt corecte, trecem la identificarea
microorganismelor.

caractere, aşa cum am discutat şi în capitolele precedente.
· Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-pozitivicu dimensiunile menţionate mai

sus. În culturi învechite bacteriile pot fi gram negative şi se pot detecta endosporii (deformează
bacilii). În cazul în care la examenul microscopic nu evidenţiem spori vom repica pe mediul
Nagler, cu incubare 48 de ore la 35-36º C şi apoi la temperatura camerei. Urmărim sporularea pe
un nou frotiu colorat Gram. Putem evalua fenomenul de sporogeneză şi prin metode de cultură
(vezi mai jos).
· Caractere de cultură: Speciile mobile (marea majoritate) formează la suprafaţa mediului

colonii de tip S, cu margini ondulate, neregulate, cu tendinţă de invadare a mediului (datorită
mobilităţii). În jurul coloniilor remarcăm prezenţa b-hemolizei. Dacă a avut loc inocularea şi în
profunzimea mediului, coloniile au aspect pufos. Clostridium perfringens (specia imobilă)
formează colonii de dimensiuni mari, de tip S, rotunde, cu margini regulate, convexe dar care
pot avea şi aspect rugos. Majoritatea tulpinilor produc hemoliză dublă (zona internă, de b-
hemoliză, este mai îngustă în timp ce zona externă, de a-hemoliză este mai largă); există şi
tulpini care produc zone foarte largi de hemoliză precum şi tulpini slab hemolitice. Aşa cum am
menţionat, prin cultivare putem să evaluăm fenomenul de sporogeneză (cunoscut fiind că sporii
rezistă timp de 10 minute la temperatura de 80º C). Dacă pe frotiul din cultură colorat Gram nu
evidenţiem spori, pregătim 2 tuburi cu bulion peptonă, glucoză, amidon şi extract de levură.
Repicăm coloniile suspecte în cele 2 tuburi iar unul dintre tuburi în supunem unei temperaturi
de 80º C, 10 minute. Incubăm cele 2 tuburi la 35-37º C până apare multiplicarea bacteriană. Dacă
bacteriile se dezvoltă în ambele tuburi, am dovedit existenţa sporilor. Dacă după o incubare de
cel mult 10 zile nu apare multiplicare bacteriană în tubul supus la temperatură, nu există spori.
· Caractere biochimice: Există numeroase caractere biochimice care pot fi utile în

diferenţierea speciilor de clostridii.
→ În identificarea microorganismelor din acest gen utilizăm iniţial testarea producerii de

lecitinază şi lipază. Pe mediul Nagler inoculăm tulpina în striu (se pot testa concomitent
mai multe tulpini). Pentru aprecierea producerii de lecitinază incubarea durează 48 de ore.
În cazul în care testul este pozitiv (precipitat opac în mediul din jurul striului de cultură)
poate fi vorba de o tulpină de C. perfringens. Testul este negativ pentru C. tetani sau pentru
C. botulinum. Pentru tulpinile lecitinază pozitive, la nivelul centrului de referinţă se mai pot
testa mobilitatea, fermentarea lactozei, producerea de lipază, urează, hidroliza gelatinei,
digestia cărnii etc. Pentru aprecierea producerii de lipază incubarea durează 1 săptămână. În
cazul în care testul este pozitiv (film perlat, iridescent la nivelul striului de cultură şi în
95
mediul adiacent) poate fi vorba de o tulpină de C. botulinum. Testul este negativ pentru C.
tetani şi C. perfringens.
→ Testul plăcilor semineutralizate poate fi practicat la nivelul centrului de referinţă. Folosim o
placă cu mediul Nagler. Pe jumătate din placă etalăm anti-toxină (lecitinază). După uscarea
plăcii inoculăm în striuri o tulpină martor pozitiv, o tulpină martor negativ şi câteva tulpini
de testat. Incubăm timp de 18-24 de ore la 35-37º C în anaerobioză. C. perfringens (ca şi
tulpina M+) dă un rezultat pozitiv doar pe jumătatea de placă fără anti-toxină.
→ Creşterea în lapte turnesolat sau cu bromcrezol purpur (C. perfringens produce cheag
alveolar în laptele turnesolat).
→ Clostridiile sunt sensibilie la vancomicină şi rezistente la colistin. Alţi autori propun testarea
sensibilităţii la metronidazol.
· Caractere antigenice: pot fi testate în centrele de referinţă.
· Alte teste care pot fi efectuate la nivelul centrelor de referinţă

→ Demonstrarea prezenţei tetanospasminei prin seroneutralizare la şoareci (un animal este
protejat cu 1-2 ore înainte de test prin injectare subcutanată a 1000 de UAI de anti-toxină
tetanică; injectăm la ambele animale 0,5 ml din cultura pe mediu lichid; animalul protejat
supravieţuieşte, iar celălalt va prezenta semne tipice de tetanos)
→ Testarea (la om) a prezenţei anti-toxinei tetanice în titruri protective prin ELISA sau
hemaglutinare (T ³ 0,01 UAI / ml).
→ Demonstrarea prezenţei toxinei botulinice în alimente, materii fecale, ser sau în medii de
cultură. Spre ex. prelevăm din bulionul VF pe care am identificat multiplicarea bacteriană,
centrifugăm iar supernatantul îl împărţim în 2 tuburi. Unul dintre tuburi îl supunem
temperaturii de 100º C (toxina botulinică este termosensibilă). Inoculăm intraperitoneal p.p.
la două loturi de şoareci. Dacă şoarecii injectaţi cu p.p. inactivat termic mor, nu este vorba
de toxina botulinică. Urmărim şoarecii timp de 2-4 zile pentru a remarca apariţia semnelor
de botulism (reducerea mobilităţii, respiraţii ample, contracţii ale muşchilor abdominali
urmate de convulsii şi deces). Prezenţa toxinei botulinice poate fi confirmată prin
seroneutralizare (protejăm spre ex. un animal de laborator cu anti-toxină de tip A şi un alt
animal de laborator cu anti-toxină de tip B după care îi injectăm cu p.p. respectiv; dacă
animalul seroprotejat cu anti-toxina de tip A supravieţuieşte iar celălalt animal moare cu
semne caracteristice pentru botulism, în mediul de cultură a existat C. botulinum de tip A)
→ Titrarea toxinei botulinice, prin metoda DL50 (folosind injectarea p.p. în vena cozii şi curbe
standard pentru interpretare, pentru fiecare serotip)
→ Titrarea toxinei botulinice printr-o tehnică de tip ELISA (poate detecta 10 pg)
→ Testul inhibiţiei sialidazei, pozitiv în 2-6 ore pentru C. perfringens etc.
5. Antibiograma de regulă nu se realizează. Clostridiile sunt sensibile la penicilină,

cefalosporine, vancomicină, tetracicline, metronidazol etc, însă tratamentul este mult mai
complex; în unele dintre bolile clostridiene nu a fost eficacitatea tratamentului cu antibiotice
sau chimioterapice nu a fost dovedită.
96
C. BOTULINUM
Cu toate că informaţii privind o boală cu manifestări care puteau fi determinate de infecţia cu C.

botulinum au fost descrise şi înainte, despre botulism se discută în mod clar începând cu anul
1817, în Germania, după ce 71 de persoane (din 174) au decedat datorită asfixiei, după ce au
consumat cârnaţi incomplet preparaţi termic („în sânge”). În urma acestei izbucniri epidemice
s-a stabilit numele de botulinum (botulus = cârnat).
Sunt germeni strict anaerobi sporulaţi, necapsulaţi, Gram-pozitivi, mobili, cu cili peritrichi.
Sporii sunt foarte rezistenţi. Clostridium botulinum reprezintă o specie patogenă prin
producerea de toxine (exotoxine) neurotrope.
CARACTERE GENERALE
1. Habitat: În stare vegetativă se poate evidenţia în intestinul omului şi al animalelor. Dacă sunt
eliminaţi în mediul extern (pe sol), sporulează. Sporii sunt rezistenţi (germeni telurici).
2. Morfologie: Sunt bacili mari, Gram-pozitivi, necapsulaţi, mobili, cu cili peritrichi. În prezenţa
oxigenului sporulează.
3. Caractere de cultură: Cresc pe medii simple, în condiţii de anaerobioză şi formează colonii

rotunde, netede, de tip S, înconjurate de o zonă pufoasă.
4. Caractere biochimice: Elaborează exotoxine cu neurotropism faţă de sistemul nervos

periferic. Toxinele A, B, E sunt mai comune la om, în zona noastră geografică. Produc şi enzime
proteolitice, cu formare de gaz, ceea ce se poate observa în cazul unor conserve alimentare
bombate şi care nu trebuie utilizate. Cl. botulinum sintetizează bacteriocine. Formele vegetative
sunt distruse la expunerea timp de 15-20 de minute la temperaturi de 55- precum şi de acţiunea
dezinfectantelor. Sporii rezistă, dar sunt distruşi prin autoclavare la , timp de 30 de minute, la
presiunea de 1 atmosferă sau prin menţinerea în pupinel timp de 1 oră.
5. Caractere antigenice: Cl. botulinum prezintă antigene flagelare de tip H, antigene la nivelul
peretelui precum şi antigene solubile (exotoxine). Există 8 tipuri de bacili botulinici, în funcţie
de exotoxinele elaborate (A, B, C cu 2 variante, D, E, F, G, H). Tipul G nu a fost asociat cu afecţiuni
umane. În România au fost identificate mai frecvent cazuri de toxiinfecţie alimentară cu Cl.
botulinum tipurile A şi B. Relativ recent, s-a demonstrat că o tulpină poate deţine concomitent
gene care codifică pentru sinteza mai multor tipuri de toxină.
RĂSPUNS IMUN
Apare un răspuns imun umoral, cu producere de anticorpi antitoxină, dar care nu sunt utili din
punct de vedere al protecţiei şi nici în scop diagnostic.
Cl. botulinum nu se multiplică în organism. Se multiplică în alimente şi produce o exotoxină

(dacă este lizogenizat), care este distrusă prin fierbere la 100ºC, timp de 20 minute. Se discută
implicarea acestui microorganism în botulismul neo-natal, în care se pare că este vorba de o
97
multiplicare în intestinul sugarilor care consumă de exemplu miere, contaminată cu spori de Cl.
botulinum.
Botulismul apare, mai frecvent, prin ingestia de alimente care conţin toxina, putând fi considerat
o toxiinfecţie alimentară de tip toxic (toxina este preformată în aliment). Spre exemplu, unele
conserve produse în gospodăria proprie, în finalul prelucrării pot asigura condiţii de
anaerobioză, iar sporii care au contaminat respectivul produs trec în formă vegetativă şi produc
toxină (conservele al căror capac „bombează” pot semnifica multiplicarea şi producerea de gaz
datorită unui microorganism; nu trebuie consumate).
Se recunosc următoarele forme de botulism: a. toxiinfecţia alimentară; b. botulismul plăgilor; c.

botulismul intestinal (mai ales la sugari); d. botulismul prin inhalare de spori; e. botulismul în
care sursa este necunoscută.
Toxina botulinică este cea mai puternică otravă cunoscută; doza letală pentru om este de 1-2 mg.
În prima formă de botulism, după ingerarea alimentului, toxina se resoarbe la nivel intestinal,
ajunge în circulaţie, iar pe această cale la nivelul plăcilor neuromotorii (faţă de care are afinitate).
Aici împiedică eliberarea de acetilcolină, determinând o paralizie flască. Paralizia începe la
extremitatea cefalică (de exemplu, paralizia muşchilor globilor oculari, care apare la 18-24 ore de
la ingestie şi se manifestă prin diplopie-vedere dublă sau paralizie bulbară, manifestată prin
imposibilitate de înghiţire şi de vorbire) şi este descendentă, ajungând până la paralizia
musculaturii respiratorii. Moartea poate surveni prin asfixie (datorită paraliziei muşchilor
respiratori). Bolnavul rămâne conştient până aproape de exitus. Rata mortalităţii în această
formă de botulism este mare. Se estimează, în SUA, că managementul unui caz de botulism
„costă” câteva milioane de USD (spitalizare, tratament, acţiuni în justiţie, solicitare de daune,
campanii mass-media etc).
Botulismul intestinal (mai frecvent la sugari, posibil şi la adulţi), este urmarea formării toxinei
botulinice prin germinarea la nivel intestinal a sporilor ingeraţi. Manifestările clinice sunt
similare cu cele ale toxiinfecţiei alimentare cu toxina preformată (paralizie respiratorie).
Mortalitatea este foarte mare. Nu se cunoaşte motivul pentru care cel mai mare număr de cazuri
este raportat în SUA. Autorităţile americane recomandă evitarea ingestiei de miere la sugar
(copii mai mici de 1 an).
Botulismul plăgilor poate fi suspectat atunci când apar manifestări neurologice anormale şi nu
pot fi implicate alimentele drept sursă pentru toxina botulinică. Boala afectează persoanele care
folosesc droguri injectate intravenos, cele cu leziuni traumatice contaminate cu pământ sau
gravidele la care s-a efectuat o cezariană.
Fiind o toxiinfecţie alimentară de tip toxic, nu se face diagnostic bacteriologic.
Se poate încerca determinarea a tipului (toxic) de Cl. botulinum implicat, prin toxinotipie. Din
aliment se extrage structura antigenică în formă solubilă. Produsul se tratează prin fierbere
(toxina botulinică este inactivată prin fierbere). Produsul în care presupunem prezenţa toxinei,
atât fiert (şi răcit) cât şi nefiert, se inoculează la şoareci după o schemă care va fi detaliată la
lucrările practice (vezi şi capitolul 22 şi anexa 2 - A.2.6.). Se investighează eventuala prezenţă a
toxinelor mai frecvent întâlnite în ţara noastră (A, B). În cazul în care în produs există toxină
botulinică, semnele clinice apar la circa 24 de ore iar şoarecii mor după circa 48 de ore de la
98
inocularea produsului care nu a fost supus fierberii (apariţia decesului înainte de 2 ore sau după
48 de ore de la inoculare semnifică prezenţa unei alte cauze).
Se poate încerca identificarea toxinei botulinice şi printr-o reacţie de tip ELISA.
Tehnicile de biologie moleculară (PCR) pentru determinarea genei care codifică pentru toxina
botulinică se pot efectua numai în cazul obţinerii culturii de Cl. botulinum, nu şi pornind de la
produsul patologic (ex. un aliment).
TRATAMENT
Se administrează ser antibotulinic, preferabil monovalent (dacă se cunoaşte tipul de toxină

implicată); dacă nu, se foloseşte ser polivalent. Se poate administra ser trivalent (A, B, E),
prompt, pe cale i.v., cu precauţiile seroterapiei, în condiţii de ventilaţie asistată.
PROFILAXIE
Este nespecifică şi constă în prelucrarea termică adecvată a alimentelor conservate (preferabil

produse industrial), prevenirea contaminării rănilor, prevenirea consumului de droguri pe cale
i.v. etc.
CLOSTRIDIILE GANGRENEI GAZOASE

Despre gangrena gazoasă, numită şi mionecroza clostridiană, a început să se discute în special
din timpul primului război mondial. Au fost descrise cazuri de mionecroză clostridiană, chiar şi
în urma unor operaţii chirurgicale „curate”, sau la pacienţi la care s-a injectat adrenalină sau
insulină.
CARACTERE GENERALE
1. Habitat: Clostridiile sunt ubicuitare în natură; sunt prezente în mod normal în tractul digestiv
al omului sau al animalelor (ca forme vegetative), fiind apoi eliminate pe sol (prin dejecte), unde
în condiţii nefavorabile, sporulează. Sporii sunt foarte rezistenţi. Sursa principală pentru
contaminare este reprezentată de sol (germeni telurici).
2. Morfologie: Sunt bacili Gram-pozitivi, pleomorfi, de dimensiuni mari 1µm / 6-10µm. C.

perfringens este încapsulat şi imobil; celelalte specii menţionate includ bacili care în forma
vegetativă sunt mobili, cu cili peritrichi. În condiţii de anaerobioză formează spori mai mari
decât diametrul bacililor, localizaţi central sau terminal.
3. Caractere de cultură: Se pot multiplica pe medii simple, în condiţii de anaerobioză. C.

perfringens creşte mai repede (în câteva ore) la 45°C, formând colonii de tip S sau R. Pe geloză
sânge produce hemoliză de tip cald-rece (prima zonă de hemoliză apare la termostat şi este
înconjurată de o a doua zonă de hemoliză mai largă, după menţinere în gheaţă). Celelalte
clostridii formează colonii mai întinse, cu aspect de „grenadă explodată” (datorită mobilităţii).
99
4. Caractere biochimice: Toţi aceşti germeni elaborează enzime cu caracter de toxine care
prezintă histotropism şi pot distruge orice tip de ţesut, cu producere de gaz. Exemple de astfel
de toxine sunt: lecitinaza, care acţionează asupra lecitinei din ţesutul nervos, diferite proteaze,
hialuronidaze, colagenaze, sialidaza etc. Singura structură care are numai un caracter enzimatic
este a-toxina (lecitinaza C). Pe geloză glucozată cu gălbenuş de ou, tulpinile producătoare de a-
toxină descompun lecitina şi conduc la opacifierea mediului. Cl. sporogenes şi Cl. perfringens
elaborează bacteriocine cu efect asupra Cl. botulinum. Formele vegetative sunt distruse de
menţinerea timp de 15-20 de minute la 55-60°C şi de acţiunea dezinfectantelor uzuale. Sporii
rezistă la temperatura de 100°C, fiind distruşi prin autoclavare la 120°C şi 1 atm. timp de 30 de
minute, precum şi la pupinel, timp de 1 oră la 180°C. În mediu, pe sol, sporii rezistă timp
îndelungat.
5. Caractere antigenice: Bacilii genului Clostridium au antigene parietale (somatice), antigene

capsulare de tip K (la C. perfringens), antigene flagelare de tip H (la C. novyi, C. septicum, C.
histolyticum şi C. sporogenes) şi antigene solubile, reprezentate de exotoxine. Spre exemplu, C.
perfringens poate elabora mai multe tipuri de toxine. Dacă în trecut erau cunoscute toxinele
notate A-D, ulterior A-F, în momentul de faţă se conosc patru toxine majore (numite α, β, ε şi
θ), nouă toxine minore şi enterotoxinele implicate în toxi-infecţii alimentare.
RĂSPUNS IMUN
Apare un răspuns imun umoral cu sinteză de anticorpi anti-toxici, care nu au utilitate în cursul
bolii. Sinteza de anticorpi după administrarea de anatoxine ar putea fi însă utilă.
Clostridiile gangrenei gazoase sunt patogene prin multiplicare, invazivitate şi toxinogeneză.

Germenii se multiplică la poarta de intrare. Au proprietăţi invazive, înaintând din aproape în
aproape, prin distrugerea ţesuturilor (efecte necrolitice, hemolitice şi letale). Enzimele (toxinele)
produse contribuie la invazivitate şi alterarea gravă a stării generale.
Infecţia cu aceşti germeni determină gangrena gazoasă, caracterizată prin edeme dure,
crepitante (cu apariţia de gaz, în urma fermentării zaharurilor), necroză şi gangrenă (necroză).
Sporii clostridieni ajung la nivel tisular prin contaminarea unor leziuni (traume). În condiţii de
anaerobioză sporii germinează, formele vegetative se multiplică, în cursul metabolismului
fermentează zaharuri şi apare gaz. Distensia tisulară, obstruarea mecanică a structurilor
vasculare (scade aportul sanguin) în conjuncţie cu sinteza de toxine cu efect necrotizant şi
sinteza de hialuronidază, favorizează diseminarea infecţiei. Necroza tisulară se extinde,
multiplicarea bacteriană se amplifică, apare anemie hemolitică, toxemie şi evoluţie (în 20-80%
din cazuri) către deces. De regulă gangrena gazoasă apare printr-o infecţie concomitentă cu 2
sau mai multe dintre speciile clostridiene menţionate.
TRATAMENT
Tratamentul trebuie instituit de urgenţă şi include în primul rând toaleta chirurgicală a plăgii
(debridări extinse, eliminarea ţesuturilor devitalizate), administrarea de penicilină, administrare
de oxigen hiperbar precum şi administrarea de ser antigangrenos.
PROFILAXIE
Se realizează prin tratamentul corespunzător al plăgilor, în special al celor anfractuoase,
contaminate cu pământ, praf etc. Utilizarea imunoglobulinelor antitoxice poate fi utilă.
Vaccinurile (anatoxine) sunt utilizabile, dar nu au intrat în practica curentă.
100
25. MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Identificarea şi tratarea infecţiilor datorate mycobacteriilor a început să fie realizată după

descoperirea bacilului tuberculozei (numit iniţial „Bacterium tuberculosis”) şi a bacilului leprei
(Bacillus leprae). Primele încercări de clasificare s-au realizat în anul 1896, când s-a propus ca
genul Mycobacterium să includă M. tuberculosis şi M. leprae.
Cu ajutorul unei clasificări bazate pe caractere morfologice (bacili, imobili) şi tinctoriale

(bacili acid-alcoolo rezistenţi, BAAR), cele două specii se diferenţiau cu oarecare dificultate de
speciile aparţinând altor genuri precum: Nocardia, Rhodococcus sau Corynebacterium. Din
acest motiv putem afirma că elementele minimale necesare stabilirii apartenenţei la genul
Mycobacterium ar putea fi reprezentate de: 1. rezistenţa la decolorarea cu acid-alcool; 2. prezenţa
unor acizi mycolici care conţin 60-90 atomi de carbon şi care pot fi clivaţi prin piroliză în acizi
graşi cu 22 şi respectiv 26 atomi de carbon; 3. un conţinut procentual de G+C de 61-71%.
În afară de M. tuberculosis şi M. leprae, au fost descoperite o serie de alte mycobacterii

considerate anterior saprofite dar care fiind condiţionat patogene, sunt relativ frecvent implicate
în patologia gazdelor imunocompromise. Aceste mycobacterii au fost denumite în mod diferit,
fie folosind termenul de mycobacterii ne-tuberculoase (non-tuberculous mycobacteria, NTM),
fie alte denumiri sinonime (mycobacterii „atipice”, mycobacterii altele decât M. tuberculosis,
MOTT etc).
Există diferite sisteme de clasificare care ar putea fi utilizate pentru gruparea speciilor
mycobacteriene. În mod clasic toate speciile de NTM sunt incluse în patru grupe, pe baza ratei
de multiplicare şi a pigmentogenezei. În acest sistem, elaborat de Ernst Runyon,
pigmentogeneza este evaluată atât după, cât şi fără expunere la lumină. Mycobacteriile cu ritm
lent de multiplicare fotocromogene, ale căror colonii se pigmentează numai după expunere la
lumină (ex. M. kansasii, M. marinum) fac parte din grupul I. Mycobacteriile cu ritm lent de
multiplicare scotocromogene, ale căror colonii se pigmentează la întuneric (ex. M. scrofulaceum,
M. gordonae, M. szulgai) fac parte din grupul al II-lea. Mycobacteriile cu ritm lent de
multiplicare nefotocromogene (ex. complexul M. avium) fac parte din grupul al III-lea. Din
grupul al IV-lea fac parte mycobacteriile cu ritm de multiplicare rapid (ex. M. fortuitum, M.
chelonae).
În momentul de faţă în genul mycobacterium sunt clasificate peste de specii diferite,

multe dintre acestea fiind larg răspândite în natură.
CARACTERE GENERALE
1. Habitat: Mycobacteriile ne-tuberculoase se întâlnesc ubicvitar. M. tuberculosis (hominis,

bovis, africanum) se găseşte în organismele infectate, de regulă la nivel pulmonar şi în cazul
infecţiei-boală poate fi eliminat în mediul extern prin tuse (în spută sau în nuclei de picătură)
sau prin lapte (dacă este cazul unui animal bolnav, infectat cu M. bovis).
2. Morfologie: În ţesuturile animalelor bolnave bacilii tuberculoşi apar ca bastonaşe subţiri,

rectilinii, cu dimensiunea de 0,4 / 3 µm, acid-alcoolo rezistenţi (apar roşii pe fond albastru la
coloraţia Ziehl-Neelsen), imobili, necapsulaţi, nesporulaţi.
101
Examenul microscopic rămâne o etapă esenţială în diagnosticul unei infecţii mycobacteriene
atât în momentul examinării unui produs patologic (examenul microscopic direct) cât şi în
momentul când prin microscopie se confirmă (sau infirmă) morfologia şi tinctorialitatea
microorganismelor dintr-o colonie izolată, respectiv acid-alcoolo rezistentă şi apartenenţa la
genul Mycobacterium. În tabelul următor este ilustrată modalitatea de interpretare a
rezultatelor examenului microscopic.
Fluorescenţă (200 - 250 ´) Notare semicantitativă Ziehl-Neelsen (900- 1000 ´)
0 BAAR negativ 0
1-2/30câmpuri ± 1-2/300câmpuri
1-9/10câmpuri 1+ (+) 1-9/100câmpuri
1-9/1câmp 2+ (++) 1-9/10câmpuri
10-90/1câmp 3+ (+++) 1-9/1câmp
>90/1câmp 4+ (++++) >9/1câmp
Fiecare treaptă a gradaţiei cantitative se referă la aceeaşi suprafaţă de frotiu examinată (câmpul
vizual examinat prin metoda fluorescentă este de circa 10× mai mare decât în cazul coloraţiei
Ziehl-Neelsen). Notaţia semicantitativă este obligatorie deoarece exprimă unitar densitatea
BAAR pe frotiu indiferent de metoda folosită, permiţând comparaţii între laboratoare diferite,
între bolnavi diferiţi şi pentru acelaşi bolnav în momente evolutive diferite. Dacă rezultatul final
este „nedeterminat“ trebuie să facem încă un frotiu din acelaşi produs patologic şi să indicăm
recoltarea unui nou produs patologic.
3. Caractere de cultură: În momentul actual, la nivel mondial există o mare varietate de medii
de cultură, unele dintre acestea fiind produse în mod special pentru mycobacteriologie,
mycobacteriile dezvoltându-se în general pe medii complexe. Singura specie cu semnificaţie
clinică necultivabilă este M. leprae. Principial, mediile de cultură utilizate în diagnosticarea unei
infecţii mycobacteriene se împart în 3 grupe principale: medii de cultură lichide (bulion 7H9
etc), medii de cultură pe bază de ou (ex. mediul Löwenstein) şi medii de cultură bazate pe
compoziţia în agar. Pentru izolarea primară a mycobacteriilor se pot folosi medii foarte variate,
din fiecare grup menţionat. Mediile pe bază de ouă au ca ingrediente: ouă sau gălbenuş de ouă,
făină de cartof, săruri, asparagină şi glicerol. Mediul este solidificat prin coagulare. Aceste
substanţe reprezintă elementele de bază ale mediului clasic Löwenstein-Jensen. Dezvoltarea M.
bovis, M. africanum precum şi a tulpinilor de M. tuberculosis rezistente la HIN este favorizată
de suplimentarea cu 0,4% piruvat de sodiu a mediului Löwenstein-Jensen.
Atunci când încercăm să realizăm izolarea primară, este necesar ca mediile de cultură să se
incubeze într-o atmosferă de 8-10% CO2. Culturile se incubează de rutină la o temperatură de
35-.
Mediile de cultură solide se vor examina zilnic în prima săptămână după inoculare iar apoi
săptămânal până la împlinirea a 6-8-12 săptămâni, deoarece mycobacteriile tuberculoase au o
rată de diviziune de minim 12 ore (30 minute la E. coli).
102
M. tuberculosis şi respectiv M.. bovis-BCG formează colonii R, rugoase, neregulate,
conopidiforme, grunjoase, greu de emulsionat. Tulpinile de M. tuberculosis rezistente la HIN
pot forma colonii de tip S. M. bovis formează colonii de tip S, rotunde, netede, umede, uşor
emulsionabile.
4. Caractere biochimice: În cazul că mycobacteria izolată este non-cromogenă (nu produce

pigmenţi) se vor examina caracterele de cultură (colonii de tip R-rugoase pentru M. tuberculosis
sau M. bovis, sau S-netede pentru M. bovis) şi se va trece la identificarea speciei pe baza a câteva
teste fenotipice clasice şi anume: testul producerii de niacină, testul reducerii nitraţilor, testul
catalazei la şi la , hidroliza tween 80, susceptibilitatea la hidrazida acidului 2-tiofen-carboxilic
(TCH) şi susceptibilitatea la acidul p-amino salicilic (PAS).
Primele 3 teste dau rezultate pozitive pentru M. tuberculosis (în timp ce pentru M. bovis numai
al 3-lea test este pozitiv). Testul catalazei la şi respectiv hidroliza Tween 80 sunt negative pentru
ambele specii (hidroliza Tween 80 poate fi pozitivă pentru M. tuberculosis). M. tuberculosis se
dezvoltă pe mediul cu TCH în timp ce M. bovis (sau M. bovis-BCG este inhibat de către această
substanţă). Testul este util în special în cazul tulpinilor de M. bovis care prezintă reacţii pozitive
(sau slab pozitive) la primele 2 teste.
Mycobacteriile, datorită structurii particulare a peretelui celular au o rezistenţă mai mare atât
în mediul extern cât şi faţă de diferite substanţe chimice. Diferiţi coloranţi, precum verde
malachit, care au efecte bacteriostatice faţă de alte bacterii, pot fi incorporati în mediul de
cultură fără a inhiba multiplicarea bacililor tuberculoşi. Acizii şi bazele pot fi utilizate în procesul
de decontaminare al produselor patologice (ex. al sputei) distrugând microorganismele din flora
asociată, dar permiţând supravieţuirea M. tuberculosis.
Bacilii tuberculoşi sunt rezistenţi la uscăciune şi rezistă mult timp în sputa uscată, la întuneric.
Sunt sensibili la acţiunea radiaţiilor UV.
5. Caractere antigenice: Constituenţii peretelui celular sunt recunoscuţi pentru capacitatea de

a induce apariţia unui răspuns imun de tip celular şi respectiv a unei hipersensibilităţi de tip IV.
Se acceptă faptul că aceşti constituenţi sunt implicaţi în inducerea unui grad de rezistenţă faţă
de o nouă infecţie (premuniţie).
Mycobacteriile prezintă la nivelul peretelui celular o cantitate importantă de lipide, inclusiv

acizii mycolici (cu lanţ lung de atomi de carbon, C78-C90), ceruri (ex. ceara D) şi fosfatide. Ceara
D pare a fi implicată în inducerea stării de hipersensibilitate. Lipidele sunt cuplate cu proteine
şi polizaharide.
Numeroase polizaharide au fost identificate în structura mycobacteriilor. O parte dintre acestea

reprezintă antigene utilizate în identificarea prin metode imunologice a prezenţei anticorpilor
anti-mycobacterieni.
În vederea evaluării stării de reactivitate faţă de infecţia tuberculoasă se poate utiliza

intradermoreacţia la tuberculină (PPD, derivat proteic purificat) substanţă proteică, mai precis
filtratul unei culturi de M. tuberculosis, filtrat care s-a dovedit că are în compoziţie mai multe
proteine elaborate în cursul metabolismului bacilului tuberculos. Faţă de proteinele
mycobacteriene apar anticorpi care pot fi individualizaţi prin metode de laborator.
103
RĂSPUNS IMUN
Apare atât un răspuns imun de tip umoral (anticorpii anti-mycobacterieni pot fi evidenţiaţi prin
diferite tehnici, de ex. ELISA, însă metodologia nu este încă standardizată) cât şi un răspuns
imun de tip celular. Mecanismele imunităţii celulare sunt implicate atât în protecţia faţă de
îmbolnăvire cât şi în unele evenimente patologice care apar în cursul tuberculozei.
Se estimează că la nivel mondial, numărul persoanelor infectate cu M. tuberculosis este de

aproximativ 1,7 miliarde şi cu toate că aproximativ 1/3 din populaţia globului este infectată, doar
circa 10 milioane de persoane fac anual o formă de tuberculoză clinic manifestă. Cu alte cuvinte
s-ar putea considera că M. tuberculosis nu este un microorganism strict patogen ci condiţionat
patogen. În plus, trebuie să reţinem că atunci când este vorba de o persoană imunocompromisă,
nu putem folosi termenul de mycobacterii nepatogene.
M. tuberculosis are capacitatea de a supravieţui şi de a se multiplica în macrofagele alveolare

care nu sunt activate. Interacţiunea iniţială între M. tuberculosis şi macrofage, determină atât
un răspuns din partea LT helper cât şi din partea LT citotoxice. Un subset al LT helper (Th2)
stimulează sinteza de anticorpi, dar aceşti anticorpi nu au nici un rol (dovedit) în ceea ce priveşte
protecţia. Subsetul de LT helper Th1 sintetizează interferon γ (IFN-γ) cu rol în stimularea
activităţii macrofagelor şi celulelor endoteliale.
Este probabil că la supravieţuirea intra-macrofagică să contribuie producerea unor substanţe

numite generic, invazine. Bacteriile sunt fagocitate, sunt incluse în fagolizozomi, dar o parte
dintre ele rezistă şi distrugând fagolizozomul revin în citoplasma macrofagului. M. tuberculosis
are capacitatea de a împiedica acidifierea la nivel de fagolizozom, probabil prin inducerea
sintezei de amoniac.
Lipoarabinomananul (un glicolipid) din peretele mycobacterian inhibă activarea LT, acelaşi
efect avându-l şi antigenul 85 (proteic) care are capacitatea de a lega fibronectina.
Factorul cord (acid mycolic parietal, 6-6 dimicolat de trehaloză) pare a fi implicat în producerea
leziunilor tisulare şi în inhibarea migrării leucocitare.
Fosfolipidele sunt implicate în inducerea necrozei de cazeificare.
S-a identificat la şoareci o genă implicată în susceptibilitatea la infecţia cu tulpina vaccinală. O

genă similară se află la om la nivelul cromozomului 2q; se presupune că prin clonarea acestei
gene s-ar putea identifica grupele populaţionale susceptibile la tuberculoza-boală.
Totuşi trebuie menţionat că în ciuda a numeroase studii realizate în peste 100 de ani, nu s-a
stabilit de fapt care este structura implicată cu certitudine în patogenitatea mycobacteriană şi
nici care este mecanismul exact care face ca rezultatul interacţiunii microorganism-gazdă să fie
atât de diferit de la un caz la altul.
Nucleii de picătură care au diametrul de 1-3 μm au capacitatea de a ajunge după inhalare până
la nivel alveolar. Intraalveolar chiar dacă sunt fagocitate, o parte dintre mycobacterii rămân
viabile şi chiar se pot multiplica în interiorul celulelor. Pe cale limfatică se poate realiza
diseminarea la nivelul majorităţii organelor (foarte rar însă apare o multiplicare necontrolată
mycobacteriană la nivelul ficatului, splinei sau măduvei hematogene). Microorganismele care
104
colonizează lobii superiori pulmonari, rinichiul, ţesutul osos, etc. se pot multiplica considerabil
înaintea dezvoltării imunităţii specifice.
Imunitatea specifică este de obicei capabilă să limiteze multiplicarea bacililor; gazda rămâne
asimptomatică şi leziunile se vindecă. În general, la numai aproximativ 5% dintre persoanele
infectate controlul multiplicării microorganismelor este inadecvat şi tuberculoza-boală poate
apare în primul an după infecţie. În alte 5% dintre cazuri diminuarea imunităţii organismului la
un moment mai îndepărtat de momentul infecţiei face ca boala să apară. Astfel aproximativ 10%
din persoanele infectate cu M. tuberculosis vor dezvolta o formă de tuberculoză clinic manifestă
în cursul vieţii.
Capacitatea de apărare a organismului poate fi diminuată în cursul unor boli precum silicoza,
diabetul zaharat sau boli asociate cu imunodepresie (ex. infecţia cu HIV / SIDA), sau datorită
corticoterapiei sau medicaţiei imunosupresoare. În aceste circumstanţe probabilitatea
dezvoltării tuberculozei este mult mai mare. Susceptibilitatea la tuberculoză poate fi de
asemenea mare în primii doi ani de viaţă, la pubertate şi în adolescenţă.
Tuberculoza poate avea localizări extrem de variate, dar cea mai frecvent întâlnită este
tuberculoza pulmonară. Pe de altă parte din punct de vedere epidemiologic, pacienţii cu
tuberculoză pulmonară a căror spută este pozitivă microscopic, reprezintă sursa de infecţie cea
mai importantă. Tratamentul corect şi complet al acestor pacienţi este esenţial.
Tuberculoza poate avea localizări variate, dar cea mai frecvent întâlnită este tuberculoza
pulmonară. Din punct de vedere epidemiologic, pacienţii cu tuberculoză pulmonară (care
elimină prin spută BAAR) reprezintă sursa de infecţie cea mai importantă. Diagnosticul,
tratamentul corect şi complet al acestor pacienţi este esenţial.
Diagnosticul poate fi sugerat de elemente clinice, paraclinice (ex. radiologice), alte elemente de
laborator, dar trebuie confirmat bacteriologic, prin izolarea şi identificarea M. tuberculosis.
Diagnosticul de laborator microbiologic este în mod esenţial bacteriologic, direct; se pot

adăuga datele obţinute în cadrul diagnosticului imunobiologic şi serologic. Diagnosticul de
laborator bacteriologic include etapele cunoscute.

antisepsie inclusiv protecţia personalului medical implicat etc). În funcţie de forma clinică de
tuberculoză se pot recolta următoarele produse patologice: spută, lichid de spălătură bronşică,
LCR, urină, lichide recoltate prin puncţie articulară, peritoneală, pleurală, pericardică, probe
obţinute prin biopsie, puroi etc. Uneori este necesară concentrarea p.p. prin centrifugare. În
continuare vom discuta cazul în care p.p. este reprezentat de spută. Sputa trebuie decontaminată
(de ex. prin tratare cu NaOH 4%) şi neutralizată (ex. cu acid) în vederea baciloscopiei şi
cultivării.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim trei frotiuri

din produsul patologic recoltat şi transportat corespunzător, care se vor colora cu AM, Gram şi
respectiv Ziehl-Neelsen. Frotiurile se examinează la microscopul optic cu imersie şi se notează
prezenţa celulelor de la nivelul tractului respirator (ex. macrofage alveolare), prezenţa celulelor
105
inflamatorii (ex. leucocite) şi prezenţa BAAR. În ţesuturile animalelor bolnave bacilii tuberculoşi
apar ca bastonaşe subţiri, rectilinii, cu dimensiunea de 0,4 / 3 µm, acid-alcool rezistenţi (apar
roşii pe fond albastru, toate celulele şi bacteriile non-AAR sunt colorate în albastru, la coloraţia
Ziehl-Neelsen), imobili, necapsulaţi, nesporulaţi. Se poate utiliza şi coloraţia fluorescentă.
Examenul microscopic rămâne o etapă esenţială în diagnosticul unei infecţii mycobacteriene
atât în momentul examinării unui produs patologic (examenul microscopic direct) cât şi în
momentul când prin microscopie se confirmă (sau infirmă) morfologia şi tinctorialitatea
microorganismelor dintr-o colonie izolată.
Rezultatele examenului microscopic (coloraţie fluorescentă şi Ziehl-Neelsen) trebuie

cuantificate prin numărul de BAAR în raport cu numărul de câmpuri examinate (10-30 în cazul
coloraţiei fluorescente, 100-300 în cazul coloraţiei Z-N). Spre exemplu, prezenţa a 1-9 bacili / 10
câmpuri în microscopia cu fluorescenţă şi respectiv a 1-9 BAAR / 100 de câmpuri în microscopia
optică permite notificarea în buletinul de analiză a unui rezultat cu 1+ în timp ce prezenţa a 10-
90 bacili / 1 câmp în microscopia cu fluorescenţă şi respectiv a 1-9 BAAR / 1 câmp în microscopia
optică permite notificarea în buletinul de analiză a unui rezultat cu 3+ (maxim fiind 4+, atunci
când se identifică spre ex. peste 9 BAAR / 1 câmp la coloraţia Z-N) (vezi şi tabelul nr. 5). Notaţia
semicantitativă este obligatorie deoarece exprimă unitar densitatea BAAR pe frotiu indiferent
de metoda folosită, permiţând comparaţii între laboratoare diferite, între bolnavi diferiţi şi
pentru acelaşi bolnav în momente evolutive diferite. Dacă rezultatul final este „nedeterminat“
trebuie să facem încă un frotiu din acelaşi produs patologic şi să indicăm recoltarea unui nou
produs patologic. Baciloscopia negativă nu exclude diagnosticul de tuberculoză.
Din momentul obţinerii unui rezultat pozitiv la examenul microscopic direct se poate elabora
strategia de diagnostic pentru stabilirea cu exactitate a speciei implicate, urmat de precizarea
sensibilităţii la antibiotice. În momentul de faţă avem la dispoziţie 2 tipuri de abordare (eventual
utilizate concomitent, în măsura în care există dotarea tehnică necesară) şi anume folosirea unor
metode de diagnostic convenţionale şi respectiv folosirea unor metode de diagnostic moderne,
mai rapide. Metodele rapide pot fi utile atât după izolarea M. tuberculosis (sau a unei alte
mycobacterii) în culturi, cât şi direct, pornind de la produsul patologic.

poată obţine o cultură pură, care se va identifica. În momentul actual, la nivel mondial, există o
mare varietate de medii de cultură. Mycobacteriile se dezvoltă în general pe medii complexe.
Mediile de cultură utilizate în diagnosticarea unei infecţii mycobacteriene se împart în 3 grupe
principale: medii de cultură lichide (ex. bulion 7H9), medii de cultură pe bază de ou (ex. mediul
Löwenstein) şi medii de cultură bazate pe compoziţia în agar (tip Middlebrook). Pentru izolarea
primară a mycobacteriilor se pot folosi medii foarte variate, din fiecare grup menţionat. Mediile
pe bază de ouă au ca ingrediente: ouă sau gălbenuş de ouă, făină de cartof, săruri, asparagină şi
glicerol. Mediul este solidificat prin coagulare. Aceste substanţe reprezintă elementele de bază
ale mediului clasic Löwenstein-Jensen la care se adaugă verde malachit pentru selectivitate (în
acelaşi scop se pot adăuga antibiotice). Dezvoltarea M. bovis, M. africanum precum şi a tulpinilor
de M. tuberculosis rezistente la HIN este favorizată de suplimentarea cu 0,4% piruvat de sodiu
a mediului Löwenstein-Jensen.
Atunci când încercăm să realizăm izolarea primară, este necesar ca mediile de cultură să se
incubeze într-o atmosferă de 8-10% CO2. Culturile se incubează de rutină la o temperatură de
35-. Mediile de cultură solide se vor examina zilnic în prima săptămână după inoculare iar apoi
săptămânal până la împlinirea a 6-8-12 săptămâni deoarece mycobacteriile tuberculoase au o
rată de diviziune de 12-27 ore.
106
Se pot utiliza şi sisteme de cultivare „rapidă” (ex. MB-Bact, Bactec) cu depistarea creşterii
mycobacteriene în 4-25 de zile. În România aceste sisteme au început să fie utilizate în unele
centre începând cu anul 1998. Aceste sisteme permit testarea sensibilităţii la medicamentele
anti-mycobacteriene pentru tulpinile izolate, conform recomandărilor programului naţional.

caractere:
• Caractere morfotinctoriale: în frotiul realizat din colonia izolată se evidenţiază BAAR;
• Caractere de cultură:
→ M. tuberculosis şi respectiv M. bovis-BCG formează colonii R, rugoase, neregulate,

conopidiforme, grunjoase, greu de emulsionat, nepigmentate;
→ tulpinile de M. tuberculosis rezistente la HIN pot forma colonii de tip S;
→ identificarea speciei se realizează pe baza a câteva teste fenotipice clasice [testul

producerii de niacină, testul reducerii nitraţilor, testul catalazei la şi la , hidroliza Tween
80, susceptibilitatea la hidrazida acidului 2-tiofen-carboxilic (TCH) şi susceptibilitatea la
acidul p-amino salicilic (PAS)];
→ primele 3 teste dau rezultate pozitive pentru M. tuberculosis (în timp ce pentru M. bovis
numai al 3-lea test este pozitiv);
→ testul catalazei la şi respectiv hidroliza Tween 80 sunt negative pentru ambele specii
(hidroliza Tween 80 poate fi pozitivă pentru M. tuberculosis);
→ M. tuberculosis se dezvoltă pe mediul cu TCH în timp ce M. bovis (sau M. bovis-BCG

este inhibat de către această substanţă); testul este util în special în cazul tulpinilor de
M. bovis care prezintă reacţii pozitive (sau slab pozitive) la primele 2 teste;
• Caractere antigenice: se pot examina în centre de referinţă;
• Caractere de patogenitate: M. tuberculosis este patogen pentru cobai; inocularea p.p. la cobai
este uneori practicată în vederea diagnosticului;
• Alte caractere / teste utilizate în identificare: se pot utiliza (la nivelul unor centre de
referinţă) teste care se bazează pe proprietăţi fenotipice moleculare (ex. studiul
cromatografic al acizilor graşi din peretele celular) sau genotipice (fragmente de restricţie
ale materialului genetic, sonde nucelotidice, PCR); există şi posibilitatea testării sensibilităţii
faţă de anumiţi mycobacteriofagi etc.
5. Antibiograma poate fi necesară şi se realizează conform recomandărilor Programului

Naţional de Control al Tuberculozei. Se pot utiliza metoda concentraţiilor absolute, metoda
proporţiilor, metoda rapoartelor de rezistenţă, metode radiometrice etc.
107
Diagnosticul imunobiologic are la bază un mecanism de răspuns imun de tip celular. Se
utilizează intradermoreacţia cu tuberculină (PPD, derivat proteic purificat), vezi capitolele 17-18
şi anexa nr. 3. IDR cu PPD este mai frecvent folosită în scop epidemiologic dar poate avea şi
utilitate diagnostică, în special atunci când se observă „virajul tuberculinic”, respectiv test
tuberculinic negativ, urmat de pozitivarea testului la o determinare ulterioară.
Diagnosticul serologic se bazează pe răspunsul imun de tip umoral (anticorpii anti-

mycobacterieni pot fi evidenţiaţi prin diferite tehnici, de ex. ELISA). Cu toate că metodologia nu
este perfect standardizată, subliniem faptul că în diagnosticul tuberculozei nici un element nu
poate fi considerat ca fiind lipsit de importanţă într-un anumit context clinic, paraclinic şi
epidemiologic.
TRATAMENT
Tratamentul nespecific include repausul (fizic, psihic) şi o nutriţie corespunzătoare.
Tratamentul medicamentos se realizează cu anti-tuberculoase în asociere (3 sau 4 medicamente
diferite în funcţie de situaţie). Mai frecvent utilizate sunt izoniazida (HIN), rifampicina,
pyrazinamida şi ethambutolul (medicamente de „primă linie”). Terapia este de lungă durată
(minim 4 luni în formele uşoare, 6 luni în majoritatea cazurilor) şi ar trebui să se realizeze strict
supravegheat. Ţinta operaţională este vindecarea a minim 85% dintre pacienţii cu tuberculoză
pulmonară pozitivă la microscopie.
Datorită apariţiei şi extinderii fenomenului de rezistenţă şi multi-rezistenţă la antibiotice, pe

lângă medicamentele de primă linie menţionate mai sus există şi anti-tuberculoase „de rezervă”
(ex. ethionamida, prothionamida, cicloserina etc).
PROFILAXIE
Depistarea precoce a surselor de infecţie precum şi tratamentul acestora corect şi complet
reprezintă una dintre cele mai importante măsuri de prevenire şi control.
Vaccinarea BCG este utilă cel puţin pentru prevenirea meningitei tuberculoase la nou-născut
(afecţiune extrem de gravă). Prima vaccinare se realizează în primele zile de viaţă, în maternitate.
Revaccinările se pot face numai la persoane IDR negative.
Pentru prevenirea TB, se recomandă în anumite situaţii chimioprofilaxia (de ex. administrarea
HIN la membrii de familie, contacţi ai unei persoane cu TB pulmonară pozitivă la microscopie).
Eradicarea tuberculozei la vite şi pasteurizare laptelui sunt de asemenea măsuri utile profilactic.
26. TREPONEMA PALLIDUM

Spirochetele formează un grup relativ mare şi heterogen de microorganisme spiralate, mobile.
Familia Spirochaetaceae aparţine ordinului Spirochaetales şi include trei genuri de
microorganisme. Familia Treponemataceae include trei genuri patogene pentru om: 1. genul
Treponema; 2. genul Borrelia şi 3. genul Leptospira. În genul Treponema sunt cuprinse mai
multe specii de interes medical, dintre care menţionăm Treponema pallidum agentul etiologic
al sifilisului, T. reiter o tulpină de laborator, izolată de la om, care se poate cultiva pe medii de
cultură şi permite obţinerea unor antigene de diagnostic şi T. pallidum (tulpina Nichols)
menţinută în laborator prin inoculare intratesticulară la iepure, utilă pentru obţinerea
antigenelor de diagnostic.
108
CARACTERE GENERALE
1. Habitat: T. pallidum este un microorganism parazit exclusiv al omului, nu se poate identifica

în mediul extern. Transmiterea sexuală reprezintă calea de contagiune în imensa majoritate a
situaţiilor. T. pallidum poate fi izolată din serozitatea recoltată din şancrul sifilitic sau din sânge.
2. Morfologie: Microorganismul tipic se prezintă sub forma unor spirale subţiri, măsurând
aproximativ 0,25-0,3 mm lăţime şi 6-15 mm lungime. Între buclele spiralei există o distanţă
constantă de 1mm. Prezintă mobilitate activă, putându-se roti în jurul filamentului axial central,
chiar şi după ce se ataşează de celule prin capetele efilate. Spiralele sunt atât de subţiri încât nu
se pot vizualiza decât prin imunofluorescenţă sau la microscopul cu câmp întunecat (prin
examinarea preparatului proaspăt între lamă şi lamelă). Aspectele morfologice pot fi evidenţiate
prin colorarea frotiurilor prin metode speciale (Giemsa, Fontana - Tribondeau sau impregnarea
argentică).
3. Caractere de cultură: Tulpinile de Treponema pallidum patogene pentru om nu au fost

niciodată cultivate pe medii de cultură artificiale. În anumite fluide şi în prezenţa substanţelor
reducătoare, T. pallidum poate rămâne mobilă 3-6 zile, la 25°C. În sângele total sau în plasma
păstrată la 4°C rămâne viabilă cel puţin 24 de ore, aspect important care a dus la testarea sângelui
donat şi pentru eliminarea riscului prezenţei T. pallidum în unităţile folosite pentru transfuzii.
Treponemele nepatogene (ex. tulpina Reiter) pot fi cultivate in vitro pe medii de cultură în
anaerobioză. T. reiter este înrudită antigenic cu T. pallidum. Treponema pallidum (tulpina
Nichols) este menţinută în laborator prin inoculare intratesticulară la iepure.
4. Caractere biochimice: Datorită necultivabilităţii, caracterele biochimice nu au putut fi la fel

de bine precizate ca şi pentru alte microorganisme. T. pallidum este un germen microaerofil.
T. pallidum este distrusă de uscăciune precum şi de creşterea temperaturii la 42°C. Treponemele
sunt rapid imobilizate şi distruse de arsenicul trivalent, mercur şi bismut. Acest efect distructiv
este accelerat de către temperaturile înalte şi este parţial reversibil cu reactivarea treponemelor
la tratarea cu compuşi conţinând gruparea -SH (cisteină şi dimercaptopropanol). Suspensiile de
treponeme pot fi menţinute timp de mai mulţi ani la -70°C.
5. Caractere antigenice: Primul test utilizat în diagnosticul serologic al sifilisului a fost un test
având la bază reacţia de fixare a complementului (reacţia Bordet-Wassermann, RBW). Iniţial
antigenul utilizat a fost extras din ficatul unui fetus uman (cu sifilis congenital). Ulterior s-a
descoperit faptul că acest antigen, lipoidic (difosfatidil glicerol), numit cardiolipină, poate fi
extras din muşchiul cardiac precum şi din alte structuri. De fapt structura antigenică a T.
pallidum se apreciază a fi complexă şi este incomplet elucidată până în prezent. Antigenul
lipoidic este un antigen nespecific, util în testele de screening. În structura treponemelor există
antigene proteice, un antigen specific de grup, extras din T. reiter şi altul specific de tip. Este
descris şi un antigen cu structură polizaharidică, specific de tip, diferit de antigenele extrase din
T. reiter, responsabil pentru testul de imobilizare şi care se poate extrage din tulpina Nichols.
RĂSPUNS IMUN
Rezistenţa la reinfecţie a fost verificată atât la om (voluntari) cât şi la iepure şi debutează la circa
3 săptămâni după apariţia leziunilor primare. Persistenţa unei infecţii latente previne reinfecţia,
dar în cazul în care boala este tratată corect, gazda redevine susceptibilă la infecţie. În vederea
obţinerii rezistenţei la infecţie este necesar atât răspunsul imun umoral cât şi celular.
109
T. pallidum este patogenă prin multiplicare şi invazivitate. T. pallidum afectează numai

omul şi se transmite de regulă prin contact sexual. Alte modalităţi de transmitere posibile ar fi
pe cale sanguină sau de la mamă la făt. Infectarea indirectă, ex. prin intermediul unor obiecte
contaminate, se apreciază că ar fi posibilă în circa 0,1% din cazuri.
Infecţia naturală cu T. pallidum este limitată la gazda umană. Infecţia se transmite de

obicei prin contact sexual, iar leziunile de primoinfecţie sunt cantonate la nivelul tegumentelor
şi mucoaselor din zona genitală. Totuşi în 10-20% din cazuri, leziunile primare sunt localizate la
nivel rectal, perianal sau oral. T. pallidum poate probabil penetra mucoasele intacte sau
pătrunde printr-o soluţie de continuitate de la nivelul epidermului.
Spirochetele se multiplică local la poarta de intrare, iar unele se răspândesc în vecinătatea

nodulilor limfatici, de unde ajung în torentul circulator. În 2-10 săptămâni de la infecţie, la locul
inoculării se dezvoltă o papulă care se deprimă pentru a forma o ulceraţie cu baza curată,
indurată (şancru dur). Inflamaţia se caracterizează prin prezenţa limfocitelor şi a plasmocitelor.
Această leziune „primară” se vindecă întotdeauna spontan, dar după 2-10 săptămâni apar
leziunile secundare, care constau în leziuni eritematoase maculopapulare localizate oriunde pe
corp şi papule umede, palide (condiloame) în regiunile anogenitală, axilară şi în cavitatea bucală.
Pot fi prezente de asemenea meningita sifilitică, corioretinita, hepatita, nefrita (datorită apariţiei
complexelor imune) sau periostita. Leziunile secundare se remit şi ele spontan. Atât leziunile
primare, cât şi cele secundare sunt bogate în spirochete şi foarte contagioase. Leziunile
contagioase pot reapărea la 3-5 ani de la infecţie, dar după aceea individul nu este contagios.
Infecţia sifilitică poate rămâne subclinică şi pacientul poate trece prin stadiile primar, secundar
sau prin ambele fără semne sau simptome, dezvoltând totuşi sifilis terţiar.
În aproximativ 30% din cazuri, infecţia sifilitică precoce progresează spontan către
vindecare completă în absenţa tratamentului. În alte 30% din cazuri, infecţia netratată rămâne
latentă (evidenţiată în special prin teste serologice pozitive). În celelalte cazuri, boala
progresează spre stadiul terţiar, caracterizat prin dezvoltarea de leziuni granulomatoase (gome)
în piele, oase, ficat, prin modificări degenerative la nivelul SNC (sifilis meningovascular, pareze,
tabes), sau prin leziuni cardiovasculare (aortită, anevrism aortic, insuficienţă aortică). În toate
leziunile terţiare treponemele sunt foarte rare, iar reacţiile exagerate ale ţesuturilor se datorează
hipersensibilităţii la antigene treponemice.
În cazul sifilisului congenital, o femeie însărcinată infectată cu T. pallidum poate

transmite germenul fătului prin placentă între săptămânile 10-15 de gestaţie. În unele cazuri se
produc moarte in utero şi avort spontan, iar în altele apare postmaturitate. Alţi feţi sunt născuţi
vii, dar dezvoltă semne de sifilis congenital în copilărie: keratită interstiţială, dinţi Hutchinson,
nas în şa, periostită şi diferite anomalii ale SNC. Tratamentul adecvat al mamei în timpul sarcinii
previne sifilisul congenital. Titrul „reaginelor” în sângele copilului creşte în infecţia activă, dar
scade cu timpul dacă anticorpii au fost transferaţi pasiv de la mamă. În infecţia congenitală,
copilul produce anticorpi antitreponemici de tip IgM. Pentru prevenirea sifilisului congenital,
femeile însărcinate trebuie să fie testate pe parcursul sarcinii, recomandarea fiind făcută de
doctorul obstetrician încă de la prima vizită (recomandarea trebuie făcută de asemenea şi de
medicul de familie).
110
Atât leziunile primare, cât şi cele secundare sunt bogate în spirochete şi foarte contagioase. În
cele ce urmează vom aborda diagnosticul de laborator în cazul sifilisului primar sau secundar.
Diagnosticul porneşte de la elemente clinice şi epidemiologice, dar trebuie confirmat prin
metode de laborator.
Diagnosticul de laborator în sifilis poate fi bacteriologic (direct) sau serologic.
Diagnosticul bacteriologic
Treponema pallidum nu poate fi cultivată pe medii artificiale, în laborator. Din acest motiv,
diagnosticul bacteriologic cuprinde numai primele etape din structura clasică a schemei
diagnosticului direct. Diagnosticul bacteriologic poate fi realizat atât în sifilisul primar cât şi în
sifilisul secundar.

antibioterapiei, având o serie de particularităţi. Produsul patologic poate fi reprezentat de
lichidul clar (serozitatea) de la nivelul leziunilor primare în funcţie de localizare (penian,
cervical, vaginal, perianal etc), de la nivelul leziunilor secundare (condiloma lata, rozeole
sifilitice etc), de la nivelul unor leziuni „umede” bogate în treponeme în cazul sifilisului
congenital timpuriu sau poate fi prelevat din ganglionii limfatici regionali.
În cazul şancrului, vom recolta p.p. după îndepărtarea cu grijă (fără a produce
sângerare) a crustelor care acoperă leziunea. Ar putea fi necesar să comprimăm baza leziunii
pentru a stimula acumularea de lichid (clar) din care vom efectua 2-3 preparate microscopice.
Prelevăm lichidul fie cu ajutorul ansei bacteriologice, fie cu ajutorul unei pipete Pasteur, fie
aplicând pur şi simplu lama de sticlă pe „leziunea umedă”. Acoperim cu o lamelă şi eliminăm
prin uşoară apăsare eventualele bule de aer. Transportul trebuie să fie realizat foarte rapid, de
preferat în maxim 20 de minute astfel încât se recomandă ca recoltarea să fie realizată într-un
spaţiu corespunzător, în imediata vecinătate a laboratorului. Este o etapă esenţială.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic se poate realiza fie cu ajutorul

microscopului cu fond întunecat, fie prin imunofluorescenţă directă (există şi alte tehnici, care
nu vor fi discutate în acest manual).
• Pentru examenul microscopic pe fond întunecat, pregătim 2 lame (preferabil 3) pentru

fiecare leziune pe care dorim să o examinăm. Preparatele nu trebuie să conţină hematii,
leucocite, fragmente de ţesut sau bule de aer. În timp ce examinăm primul preparat
microscopic vom introduce celelalte 2 preparate într-o cutie Petri în care există puţină vată
sau hârtie de filtru umezită, pentru a păstra atmosfera umedă şi a preveni uscarea. Preparatul
microscopic trebuie examinat sistematic (minim 10 minute în cazul unui rezultat aparent
negativ), iniţial cu obiectivul uscat, ulterior, după vizualizarea unor microorganisme care par
să aparţină genului Treponema, cu obiectivul de imersie. Este necesar ca examinatorul să
aibă experienţă în acest tip de examinare. Microorganismele caracteristice sunt foarte subţiri
şi lungi (0,25-0,3mm / 6-14 mm), spiralate, prezentând 8-14 spire (regulate, strânse, adânci
şi rigide), mobile (spirele nu se deformează), deplasarea în câmpul microscopic nu este foarte
rapidă dar seamănă cu o mişcare de înşurubare (există şi microorganisme care sunt imobile
dar păstrează mişcările de translaţie, rotaţie lentă, flexie uşoară de la un cap la celălalt sau
flexie mediană cu revenire ca un resort), luminoase pe fondul negru al câmpului microscopic.
În cazul unui rezultat negativ putem repeta recoltarea şi examinarea. În anumite situaţii se
111
poate recomanda începerea tratamentului, iar evoluţia va fi monitorizată clinic şi serologic
(rezultatul negativ nu elimină diagnosticul de sifilis). Rezultatul pozitiv, atunci când poate
fi exclusă prezenţa unor treponeme saprofite, pune diagnosticul de sifilis primar înainte ca
anticorpii să poată fi detectaţi serologic.
• Imunofluorescenţa directă permite diferenţierea T. pallidum de alte treponeme cu ajutorul

anticorpilor marcaţi fluorescent (reacţie Ag-Ac); un alt avantaj este reprezentat de faptul că
nu este necesar ca treponemele să fie mobile. În plus, pentru că reacţia este specifică, se
poate utiliza cu succes şi în cazul unor leziuni foarte probabil contaminate cu treponeme
saprofite (ex. orale, rectale). În cazul în care examinarea nu poate fi realizată imediat secreţia
poate fi recoltată într-un tub capilar care se închide la flacără şi poate fi transportat la +4ºC;
alternativ putem realiza frotiul, aşteptăm să se usuce în vecinătatea becului de gaz şi putem
să îl trimitem către laborator. Frotiul poate fi „colorat”:
o cu Ac anti-T. pallidum obţinuţi de la pacienţi cu sifilis sau de la iepuri infectaţi cu T.

pallidum; serul este tratat pentru creşterea specificităţii cu tulpina Reiter (o tulpină
nepatogenă de T. phagadenis) iar Ac sunt apoi marcaţi cu izotiocianat de fluoresceină
sau
o cu Ac monoclonali anti-T. pallidum subspecia pallidum marcaţi fluorescent.
Subliniem încă odată importanţa examenului clinic urmat de recoltarea, transportul şi

examinarea microscopică a p.p.
În laboratoarele de referinţă ar mai putea fi utilizate şi alte metode în scop diagnostic (mai rar)
sau pentru cercetare:
• Inocularea p.p. la animale de laborator reprezintă cea mai sensibilă metodă pentru
detectarea T. pallidum. Pentru menţinerea în laborator a unor treponeme viabile sau
pentru determinarea infectivităţii au fost utilizate diferite animale (hamsteri, cimpanzei
etc) însă cel mai util este iepurele. Iepurele poate fi inoculat (intratesticular sau cutanat)
cu orice tip de p.p. cu condiţia ca între momentul recoltării şi inoculare să nu treacă mai
mult de 60 minute. În caz contrar, p.p. trebuie adus rapid la o temperatură de cel puţin
-70ºC (ex. în azot lichid) şi menţinut astfel până în momentul inoculării. Testul
infectivităţii la iepure (RIT) rămâne metoda standard; cu ajutorul RIT se apreciază
sensibilitatea şi specificitatea oricărei alte metode care este propusă pentru diagnosticul
sifilisului.
• În centrele de referinţă au mai fost utilizate şi tehnici ale biologiei moleculare (sondele
nucleotidice, PCR). Tehnica PCR ar putea avea utilitatea diagnostică atunci când p.p.
este reprezentat de lichidul amniotic.
Treponema pallidum îşi păstrează sensibilitatea la penicilină, medicament care rămâne de

elecţie pentru tratamentul sifilisului. Există şi o serie de alternative, dar dorim să subliniem că
în vederea tratamentului acestei maladii trebuie respectate recomandările făcute de către
comisia de specialitate a ministerului sănătăţii, pentru fiecare formă de sifilis în parte.
Diagnosticul serologic se realizează folosind antigene nontreponemice şi antigene treponemice.

Testele nontreponemice (nespecifice) şi treponemice (specifice) sunt complementare; nu se
exclud. Testele nontreponemice sunt utilizate în screening, diagnostic şi monitorizarea
112
pacienţilor în cursul tratamentului. În vederea stabilirii diagnosticului vom utiliza şi testele
treponemice în corelaţie cu cele nontreponemice (nici unul dintre cele două tipuri nu pot
„acoperi” din punct de vedere diagnostic toate stadiile sifilisului). Cel mai frecvent utilizăm
VDRL sau RPR (din prima categorie) cuplat cu TPHA sau FTA-Abs (din a doua categorie). De
obicei utilizăm serul provenit de la pacientul suspect, dar în anumite situaţii testul este realizat
folosind plasmă sau LCR.
Reacţii serologice care utilizează antigene nontreponemice
➢ Antigenele nontreponemice sunt lipide care pot fi extrase din diferite ţesuturi. Cardiolipina
este un difosfatidil-glicerol. Pentru creşterea sensibilităţii, cardiolipina este cuplată cu
colesterol şi lecitină. Anticorpii anti - cardiolipină au fost numiţi „reagine”. Sunt depistaţi în
serul pacienţilor la 2-3 săptămâni şi în LCR la 4-8 săptămâni de la debutul infecţiei, în
cazurile netratate.
➢ Reacţia de fixarea a complementului Bordet-Wasserman (RBW) a fost utilizată o lungă

perioadă de timp, începând cu 1906. Datorită faptului că RFC este o metodă laborioasă şi în
special datorită apariţiei unor alte tehnici, RBW este discutată în prezent din punct de vedere
istoric. Există şi RFC Kolmer, care se execută la 4ºC.
➢ Tehnica actuală standard este VDRL (Veneral Disease Research Laboratories), un test de
floculare. Testele de floculare se bazează pe faptul că particulele antigenice rămân dispersate
în serul normal, dar formează grunji vizibili atunci când se combină cu reaginele. Testele se
pretează la automatizare şi la folosirea pentru screening datorită costului redus. O variantă
economică şi elegantă este microreacţia VDRL care se practică în plăci cu godeuri.
→ Ag tip VDRL se prepară conform recomandărilor producătorului.
→ Pregătirea serului de cercetat include controlul aspectului serului (se clarifică prin
centrifugare), inactivarea timp de 30 minute la 56ºC şi o nouă centrifugare (în cazul
apariţiei unor particule în suspensie). Nu vor fi testate serurile infectate sau hemolizate.
În cazul în care trec mai mult de 4 ore din momentul inactivării, serul va fi inactivat din
nou timp de 10 minute la 56ºC.
→ Temperatura din camera de lucru trebuie să fie între 23-29ºC. Testul se efectuează pe ser
nediluat (pentru monitorizarea evoluţiei sub tratament se pot face diluţii binare). Se pot
testa mai multe seruri concomitent şi este necesară o notare clară a godeurilor, pentru
fiecare godeu în parte. Fiecare test va include martori (seruri cu reactivitate cunoscută,
martor pentru Ag). În fiecare godeu punem câte 0,05 ml ser (în godeul pentru martor Ag
punem soluţie salină fiziologică). După agitarea flaconului cu suspensia antigenică,
utilizând o seringă cu ac calibrat depunem câte o picătură (1/60 ml) în fiecare godeu.
Acoperim placa şi o aşezăm pe un agitator care poate fi reglat la 180 turaţii pe minut, pe
o durată de 4 minute.
→ Citim imediat rezultatul, prin transiluminare pe fond negru, cu ajutorul unei lupe,
începând cu martorii (negativ, slab pozitiv, pozitiv, martorul pentru Ag) şi continuând cu
serurile de testat.
→ Rezultatul este negativ dacă lichidul nu prezintă flocoane şi este asemănător martorului
negativ şi martorului Ag. Rezultatul este slab pozitiv atunci când vizualizăm flocoane de
113
dimensiuni mici într-un lichid uşor turbid în timp ce rezultatul este intens pozitiv atunci
când vizualizăm flocoane de dimensiuni mari iar lichidul este clar. Repetăm rezultatele
slab pozitive sau dificil de interpretat. În cazul în care suspicionăm existenţa fenomenului
de prozonă (inhibiţia totală sau parţială a floculării prin exces de Ac), vom repeta testarea
se va repeta pe diluţii de ser.
→ Rezultatul negativ nu elimină diagnosticul de sifilis; pacientul se poate afla în perioada de

incubaţie sau poate fi cazul unui sifilis latent (evidenţiabil prin TPHA). În cazul unui
pacient suspect pentru sifilis primar, repetăm testul după 1 săptămână, 1 lună şi la 3 luni.
→ Vom lua în considerare un rezultat pozitiv în corelaţie cu rezultatul obţinut la testul

treponemic, rezultatul diagnosticului bacteriologic, elementele clinice şi epidemiologice.
Un rezultat pozitiv în condiţiile în care toate celelalte date sunt negative este de obicei
un rezultat fals-pozitiv. Pot apărea rezultate fals-pozitive la persoane cu hepatită virală
acută, pneumonii virale, rujeolă, malarie, mononucleoză infecţioasă, alte infecţii virale, la
persoane care au fost recent vaccinate, precum şi la persoane cu boli ale ţesutului colagen,
persoanele cu lepră, persoane cu diferite neplazii, persoane care se droghează, la
persoanele în vârstă etc. Reacţii fals-pozitive pot apărea şi pe parcursul sarcinii.
→ Testul VDRL semi-cantitativ, efectuat pe 2 probe consecutive de ser este util în

următoarele situaţii: scăderea de 4 ori a titrului în sifilisul recent, tratat, semnifică de
regulă eficacitatea tratamentului; creşterea de 4 ori a titrului sugerează o infecţie activă
în evoluţie, o reinfecţie sau ineficacitatea tratamentului.
→ VDRL-CSF, reprezintă o variantă a VDRL, tehnica fiind utilizată în suspiciunea de

neurosifilis, pentru identificarea anticorpilor prezenţi în LCR.
Alte teste de floculare utilizate în practică
➢ Testul RPR (Rapid Plasma Reagin) este executat pe carduri din material plastic pe care apar
mai multe cercuri de . Antigenul este preparat dintr-o suspensie antigenică tip VDRL
modificată (pentru a elimina etapa de inactivare prin căldură). Reactivul conţine şi particule
de cărbune. Antigenul RPR este amestecat cu serul de cercetat în cercul de pe card. Daca Ac
anti-T. pallidum sunt prezenţi, se combină cu particulele lipidice din Ag şi produc
aglutinarea lor. Particulele de cărbune coaglutinează cu Ac şi duc la apariţia unor granule
negre pe fondul alb al cardului. În absenţa Ac rezultă un aspect gri uniform. Testul se poate
realiza calitativ şi cantitativ (diluţii de ser).
➢ Testul RST (Reagin Screen Test)

➢ Testul USR (Unheated Serum Reagin)
➢ Testul TRUST (Toluidine Red Unheated Serum Test)
Reacţii serologice care utilizează antigene treponemice
Au fost realizate şi tehnici serologice care utilizează antigene treponemice extrase din T. reiter
(specifice de grup) de tipul RFC şi CIE. De mare utilitate practică sunt reacţiile serologice care
utilizează antigene treponemice extrase din tulpina Nichols de T. pallidum, cu o mare
specificitate.
114
➢ Pentru o lungă perioadă de timp, tehnica standard a fost testul imobilizării treponemelor
(TIP). Tehnica a fost pusă la punct în anul 1949. Serul de cercetat era diluat şi amestecat cu
complement şi treponeme vii, mobile, obţinute din şancrul testicular de la iepure. În
prezenţa Ac specifici, treponemele erau imobilizate, în timp ce în lipsa acestora, mobilitatea
era păstrată (examinarea se făcea cu microscopul pe fond întunecat).
➢ Testele de imunofluorescenţă indirectă (Fluorescent Treponemal Antibody, FTA) au început

să fie utilizate în 1957, serul de cercetat fiind diluat 1/5. Datorită rezultatelor fals-pozitive,
ulterior s-a trecut la diluarea 1/200 a serului (FTA-200). Din 1962 a început să fie utilizată
tehnica pe care o avem la dispoziţie şi astăzi, FTA-Abs. Pornind de la tulpina Reiter s-a
obţinut prin ultrasonicare un extract antigenic, pentru a îndepărta Ac care nu sunt specifici
pentru T. pallidum. Probele de ser şi/sau LCR de la pacienţi sunt diluate 1/5 cu un extract
care conţine Ag treponemice de grup (Reiter), comune treponemelor patogene şi comensale.
Astfel sunt înlăturaţi Ac nespecifici. Există lame pe care a fost fixată tulpina Nichols de T.
pallidum. Probele de ser şi/sau LCR absorbite şi martorii corespunzători se depun pe
spoturile de pe lamă. Dacă în ser/LCR există Ac specifici, aceştia se vor lega de treponemele
fixate pe lamă formând complexe antigen-anticorp. După îndepărtarea materialului nelegat
prin spălări repetate, Ac legaţi se detectează prin incubare cu un conjugat fluorescent anti Ig
umane. După îndepărtarea prin spălare a conjugatului nelegat de complexele antigen-
anticorp, lamele se examinează la microscopul cu fluorescenţă (UV). În cazul în care serul
de cercetat este pozitiv, treponemele de pe lamă apar fluorescente (galben-verzui).
➢ Testul de hemaglutinare (Treponema pallidum Hemagglutination Test, TPHA) a fost pus la

punct în urmă cu 30 de ani. În prezenţa unor Ac faţă de Ag adsorbite pe membrana lor,
hematiile aglutinează în reţele caracteristice formate din complexe imune. Ag treponemic
este extras din tulpina Nichols şi adsorbit pe suprafaţa hematiilor de oaie sau pasăre fixate
(hematii sensibilizate). Drept martor sunt folosite hematii fără Ag treponemice
(nesensibilizate). În cazul în care în serul de cercetat sunt prezenţi Ac anti-T. pallidum,
hematiile sensibilizate aglutinează; hematiile nesensibilizate nu aglutinează şi se depun sub
forma unui „buton” pe fundul godeului. Pentru creşterea specificităţii, majoritatea truselor
comerciale includ în diluent un extract de treponeme nepatogene. Testul poate fi realizat
calitativ sau semi-cantitativ (diluţii ale serului de cercetat). Există metode automate,
utilizate pentru testarea sângelui donat.
Tehnica ELISA
Tehnica ELISA pentru detectarea Ac de tip IgM anti-T. pallidum; este utilă pentru documentarea
infecţie intra-uterine.
Tehnica Western blot poate detecta atât Ac de tip IgM cât şi de tip IgG.
Aşa cum am mai menţionat, interpretarea rezultatelor obţinute se face ţinând cont de contextul
clinic, epidemiologic şi de laborator. Luând în considerare numai rezultatele de laborator pentru
testele menţionate în acest capitol, ar putea rezulta mai multe variante. Spre exemplu, dacă
testul VDRL este negativ şi testul TPHA este tot negativ, de regulă infecţia este exclusă. Dacă ne
gândim că pacientul este la debutul bolii iar anticorpii sunt încă nedectabili, repetăm testele
după 3 săptămâni. În cazul în care testul VDRL este pozitiv iar testul TPHA este negativ, este
posibil să ne aflăm în situaţia de mai sus, la debutul bolii şi repetăm testele după 3 săptămâni.
115
Dacă rezultatele rămân nemodificate, este vorba de o reacţie fals-pozitivă. Pot fi luate în discuţie
şi alte posibilităţi.
TRATAMENT
Penicilina în concentraţie de 0,003 unităţi / ml are activitate bactericidă dovedită şi continuă să

reprezinte tratamentul de elecţie în sifilis. În sifilisul mai vechi de 1 an sau în sifilisul latent,
benzatin penicilina G (2,4 milioane unităţi) se administrează de 3 ori la interval de câte o
săptămână. În neurosifilis se acceptă aceeaşi terapie, dar se utilizează cantităţi mai mari de
penicilină (penicilina G apoasă, 20 de milioane unităţi intravenos zilnic, timp de 2-3 săptămâni).
La câteva ore de la începerea tratamentului se poate produce o reacţie adversă (Jarish-
Herxheimer), datorată eliberării masive de endotoxine din treponemele distruse. La persoanele
care prezintă hipersensibilitate de tip I faţă de penicilină se pot administra tetraciclină,
doxiciclină sau ceftriaxonă.
27. GENUL BORRELIA
Sunt treponematacee cu spire largi şi inegale care produc spre exemplu febra recurentă, boală
transmisă de artropodele hematofage. Borreliozele transmise prin căpuşe poartă de obicei
numele regiunii geografice în care se găsesc preponderent. Despre febra recurentă s-a discutat
în special după un episod din Edimburgh (1843); după 30 ani, agentul etiologic a fost numit
Spirocheta recurrentis. Numele definitiv a fost stabilit în 1907, în amintirea şi onoarea lui A.
Borrel (Borrelia recurrentis).
CARACTERE GENERALE
1. Habitat: Borreliile sunt germeni strict paraziţi, care nu se întâlnesc niciodată în stare liberă în
natură, existenţa lor nefiind posibilă decât în organismele parazitate (rozătoare, artropode, om).
2. Morfologie: Microorganismele caracteristice (ex. Borrelia recurrentis) au o formă spiralată,

neregulată şi măsoară circa 8-30 mm lungime şi 0,2-0,5 mm lăţime. Distanţa dintre spire variază
între 2 şi 4mm. Sunt foarte flexibile şi se deplasează atât prin rotaţie cât şi prin răsucire. Borreliile
se colorează prin metode utilizate în hematologie (coloraţia Giemsa sau Wright).
3. Caractere de cultură: Microorganismul poate fi cultivat pe medii fluide ce conţin sânge, ser
sau ţesuturi, dar îşi pierde rapid patogenitatea pentru animale când este transferat în mod
repetat in vitro. Multiplicarea are loc rapid în embrionul de găină când sângele de la pacient este
inoculat în membrana chorioalantoidiană.
4. Caractere biochimice: Se cunosc destul de puţine date cu privire la necesităţile metabolice sau
activitatea biochimică a boreliilor. Sursa majoră de energie este reprezentată de carbohidraţi (în
special, glucoza).
116
Borrelia recurrentis (febra recurentă) - aspecte generale şi date privind boala
produsă
B. recurrentis supravieţuieşte mai multe luni în sângele contaminat sau în culturi la 4°C. În
anumite căpuşe, bacteriile sunt transferate din generaţie în generaţie.
Tulpinile de B. recurrentis izolate în diverse părţi ale lumii, de la diferite gazde şi de la vectori
diferiţi (căpuşe sau purici) au primit denumiri variate sau au fost catalogate drept subtipuri ale
speciei principale.
În urma infecţiei apare un răspuns imun umoral, putând fi detectaţi anticorpi aglutinanţi şi
anticorpi fixatori de complement. De remarcat faptul că, inclusiv în decursul unei singure infecţii
apar modificări antigenice, care explică recăderile. Ultima vindecare (după 3-10 recăderi) este
asociată cu prezenţa anticorpilor împotriva mai multor variante antigenice. Imunitatea
consecutivă infecţiei este de obicei de scurtă durată.
După o perioadă de incubaţie (3-10 zile), debutul este brusc, cu frisoane şi creşterea rapidă a
temperaturii. În acest timp, spirochetele se află în număr mare în sânge. Febra persistă 3-5 zile,
apoi scade. Perioada afebrilă durează 4-10 zile şi este urmată de un al doilea atac de frisoane,
febră, cefalee intensă şi stare de rău. Pot apare succesiv până la 10 asemenea recăderi, a căror
severitate scade în general progresiv. Puseele febrile se asociază cu bacteriemie.
Febra recurentă este endemică în multe zone ale globului. Principalul rezervor este reprezentat
de rozătoare, sursă de infecţie pentru căpuşe. Distribuţia focarelor endemice şi incidenţa
sezonieră a bolii sunt în mare parte determinate de modul de răspândire al căpuşelor. La aceste
insecte, Borrelia poate fi transmisă transovarian din generaţie în generaţie. Spirochetele sunt
prezente în toate ţesuturile căpuşelor, care pot transmite bacteriile prin muşcătură sau atunci
când sunt zdrobite. În cazul păduchilor, infecţia nu se transmite generaţiilor următoare, iar
boala la om se datorează contactului păduchilor zdrobiţi cu leziunile determinate de înţepătură.
La populaţiile infectate cu păduchi pot apărea epidemii severe, transmiterea fiind favorizată de
aglomeraţii, malnutriţie şi de climatul rece.
Prevenirea febrei recurente se bazează pe evitarea contactului cu căpuşe, păduchi şi prin

despăduchiere (curăţenie, dezinsecţie).
Marea variabilitate a remisiunilor spontane în cazul febrei recurente, face foarte dificilă
evaluarea eficacităţii chimioterapiei. Tetraciclina, eritromicina (şi alte macrolide), penicilina şi
cefalosporinele de generaţia a 3-a sunt considerate utile.
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN FEBRA RECURENTĂ
Diagnosticul de laborator în borrelioza recurentă este bacteriologic, direct urmând etapele

cunoscute. Diagnosticul serologic poate oferi unele informaţii, în context. Diagnosticul
borreliozelor porneşte de la elemente clinice, epidemiologice, anumite date de laborator şi este
confirmat prin diagnostic bacteriologic.

antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de sânge dar s-ar putea
recolta şi vectori (păduchi, căpuşe) sau LCR, lichid sinovial etc, în funcţie de manifestarea
117
clinică. Sângele trebuie recoltat în perioadele febrile. În cazul în care produsele nu se pot
examina imediat, recomandăm transportul acestora la temperatura frigiderului (+4ºC) sau
inocularea unor animale receptive (ex. şoareci albi sau şobolani tineri) şi transportul acestora
către laborator.

proaspăt între lamă şi lamelă utilizând sângele ca p.p., cu examinare la microscopul cu fond
întunecat. Borreliile se văd ca spirochete luminoase de dimensiuni mai mari (0,2-0,5 mm / 8-30
mm), cu spire largi şi inegale, foarte mobile (cu mişcări de rotaţie şi răsucire), pe fondul negru
al preparatului. Se pot realiza frotiuri subţiri sau examenul picăturii groase, colorate Giemsa
prelungit, May-Grünwald-Giemsa sau Wright precum şi cu acridin-orange sau cu Ac
monoclonali marcaţi fluorescent şi cu examinare la microscopul cu fluorescenţă. Pe frotiul
colorat Giemsa prelungit spirochetele apar albastre, lungi, cu capetele efilate, situate printre
hematii. Examenul microscopic realizat de către un medic experimentat permite identificarea
borreliilor în circa 70% dintre cazuri, în condiţiile respectării normelor diagnosticului
bacteriologic.
Preparatele microscopice ar mai putea fi realizate pornind de la hemolimfa vectorilor infectaţi

(păduche, căpuşă). De menţionat faptul că în cazul acestui p.p. borreliile îşi menţin pentru o
lungă durată de timp forma şi mobilitatea caracteristice în timp ce în sângele recoltat de la gazda
umană suferă modificări datorită prezenţei anticorpilor specifici, iar în timp îşi pierd
mobilitatea).
În ultima perioadă s-a introdus tehnica PCR pentru identificarea ADN-ului borrelian, pornind
de la produsul patologic.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează de regulă la nivelul

centrului de referinţă, existând mai multe tehnici care ar putea fi utilizate.
Se pot inocula animale de experienţă sensibile (ex. şoareci sau şobolani), cu inoculare
intraperitoneală. Animalele vor fi monitorizate zilnic clinic şi prin examinarea microscopică a
sângelui (p.p. se poate recolta de la nivelul venei cozii). Se mai pot inocula vectori (păduchi sau
căpuşe) sau oul de găină embrionat (la nivel intra alantoidian sau în membrana
chorioalantoidiană).
Se pot utiliza şi medii de cultură artificiale speciale (cu agenţi reducători, N-acetilglucozamină,
acizi graşi nesaturaţi cu catenă lungă, ser de iepure), în condiţii de microaerofilie, cu incubare la
32-37ºC. Se recomandă şi utilizarea mediilor selective care includ o combinaţie de agenţi
antimicrobieni precum rifampicină, amfotericină B şi fosfomicină. Datorită faptului că mediile
de cultură sunt lichide, nu se obţin colonii izolate. Creşterea microbiană trebuie verificată prin
realizare de preparate proaspete examinate la microscopul cu fond întunecat la fiecare 3 zile,
pentru o durată de 2-6 săptămâni.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se poate realiza pe baza:
Caracterelor morfotinctoriale
→ sunt spirochete luminoase de dimensiuni mai mari (0,2-0,5 mm / 8-30 mm), cu spire
largi şi inegale, foarte mobile (cu mişcări de rotaţie şi răsucire), pe fondul negru al
preparatului;
→ pe frotiul colorat Giemsa prelungit spirochetele apar albastre, lungi, cu capetele efilate;
118
Caracterelor de cultură
→ dacă are loc multiplicarea borreliilor pe mediul de cultură acesta rămâne limpede, fără
sediment, dar îşi modifică culoarea (ex. virează de la roşu-portocaliu spre roz-gălbui)
Caracterelor biochimice
→ Borreliile sunt microaerofile, fermentează glucoza producând bioxid de carbon şi acid
lactic (dar aceste teste nu sunt utilizate de regulă în diagnostic);
Alte caractere / teste utilizate în identificare la nivelul centrelor de referinţă - tehnici ale
biologiei moleculare (PCR).
5. Nu a fost pusă la punct o metodă pentru realizarea antibiogramei. Febra recurentă se tratează
cu tetraciclină, cloramfenicol, penicilină sau eritromicină. În urma tratamentului poate apărea
sindromul Jarisch-Herxheimer (frison sever, creşterea temperaturii, hipotensiune, leucopenie).
Diagnosticul serologic nu a fost considerat ca fiind foarte util, datorită variaţiilor antigenice
(care au loc inclusiv pe parcursul bolii) şi complexităţii fenomenului de recurenţă.
În ser pot fi decelaţi anticorpi aglutinanţi, imobilizanţi şi fixatori de complement. Sunt foarte
puţine laboratoare care practică aceste reacţii, de obicei în scop de cercetare. La pacienţii cu
febră recurentă epidemică (purtători de păduchi) pot apărea aglutinine faţă de Proteus OXK şi
o reacţie VDRL fals-pozitivă.
În momentul de faţă se recomandă utilizarea unor tehnici de tip ELISA sau reacţia de
imunofluorescenţă. Dacă aceste reacţii sunt negative, rezultatul este considerat negativ. Dacă
reacţiile sunt pozitive sau „indeterminate”, confirmarea se face prin Western Blot.
Se poate înregistra o leucocitoză de până la 25.000 PMN / mm3 şi o creştere importantă a VSH-
ului (de până la 110 mm / oră).
Borrelia burgdorferi (Boala Lyme)

Boala a fost denumită astfel după numele oraşului unde au fost identificate iniţial câteva cazuri.
Este determinată de spirocheta B. burdogferi care se transmite la om prin muşcătura unei mici
căpuşe din genul Ixodes. Rezervorul animal principal este reprezentat de şoareci şi cerbi, dar pot
fi infectate şi alte animale precum şi păsări. Cele mai frecvente expuneri apar vara, atunci când
căpuşele sunt foarte frecvente.
Numărul de cazuri de infecţie cu Borrelia burgdorferi a fost în scădere în SUA, în 1996

raportându-se 16.455 cazuri (cu o incidenţă de 6,210/0000) şi în 1997 12.801 cazuri, incidenţa
ajungând la 4,790/0000. În 1998 şi 1999 au fost raportate anual peste 16.000 de cazuri de boală
Lyme. În ţara noastră este în curs de organizare un sistem de supraveghere, raportare şi control
a cazurilor de borrelioză Lyme.
Răspunsul imun este foarte complex şi neelucidat în totalitate, însă reacţiile autoimune se pare
că joacă un rol important. Structura genetică a gazdei, pare a influenţa reactivitatea particulară
ce apare în cursul bolii Lyme.
119
Din punct de vedere clinic boala are manifestări precoce şi manifestări tardive. Faza precoce este
frecvent marcată de o leziune epitelială unică numită erithema cronicum migrans, la început
este o leziune plată eritematoasă în jurul muşcăturii căpuşei, care se extinde lent şi se clarifică
în zona centrală. În asociere cu leziunea tegumentară apare frecvent stare patologică
asemănătoare gripei, cu febră, frisoane, mialgii şi cefalee.
Cele mai frecvente manifestări clinice tardive (apărute după săptămâni sau luni de la momentul
infectant) sunt reprezentate de: 1) artralgii şi artrite ce se pot manifesta intermitent ani de zile;
2) manifestări neurologice: meningită, paralizie de nerv facial, radiculopatie dureroasă; 3)
afectare cardiacă cu tulburări de conducere şi miopericardită. Spirochetele au fost izolate din
toate aceste zone ale corpului, fiind probabil ca aceste manifestări să fie datorate unui mecanism
de hipersensibilitate cu depozitare de complexe antigen-anticorp.
Din punct de vedere al diagnosticului de laborator, în vederea unui diagnostic bacteriologic

(direct), microorganismul a putut fi izolat din sânge, LCR şi din leziunile tegumentare, însă
obţinerea culturii reprezintă apanajul unor laboratoare specializate. Examinarea la microscopul
cu fond întunecat după 3-5 zile de incubare la 32ºC poate fi utilă.
Diagnosticul este sugerat de istoricul bolii (înţepătură de căpuşă) în zonele endemice şi se

bazează pe evidenţierea anticorpilor serici de tip IgM care apar şi se menţin circa 3-6 săptămâni
de la instalarea bolii.
În primele 2 săptămâni care urmează contaminării, serologia este negativă. În primul stadiu de
boală, serologia devine slab pozitivă, astfel încât un rezultat negativ, nu exclude diagnosticul.
Tehnicile serologice includ imunofluorescenţa indirectă, ELISA, hemaglutinarea pasivă, etc. De

menţionat posibilitatea apariţiei unei serologii fals-pozitive datorită unor reacţii imune
încrucişate cu alte infecţii spirochetale (sifilis, leptospiroză, febră recurentă), diferite infecţii
virale (varicelă, mononucleoză infecţioasă) sau în cazul unor maladii autoimune (lupus
eritematos diseminat, artrită reumatoidă).
Tratamentul cu tetraciclină ameliorează simptomele precoce şi ajută la vindecarea leziunilor

tegumentare. Tetraciclinele pot fi mai eficace decât penicilinele în prevenirea manifestărilor
tardive. Artrita răspunde frecvent la doze mari de penicilină. În cazurile refractare, ceftriaxona
s-a dovedit eficace.
28. GENUL LEPTOSPIRA
Genul Leptospira include mai multe specii, dintre care mai cunoscute sunt L. interrogans şi L.
biflexa. Leptospirele sunt spirochete foarte mobile, descriind mişcări de burghiu imprimate de
dispoziţia particulară a flagelilor, cu dimensiuni de 0,1 µm / 6-15 µm, prezentând un „cârlig” la
unul sau la ambele capete. În cadrul speciei Leptospira interrogans există peste 218 serotipuri
(serovaruri în terminologia anglo-saxonă, de ex. L. icterohaemorrhagiae; un serovar include mai
multe grupe) care pot determina boala la animale şi accidental la om. Specia Leptospira biflexa
reuneşte peste 63 de serotipuri saprofite.
L. interrogans este patogenă prin multiplicare şi invazivitate. Leptospiroza se caracterizează prin

polimorfism, pe parcursul evoluţiei aspectul clinic putându-se modifica. După o perioadă de
incubaţie de 1-2 săptămâni, debutul bolii poate fi marcat de febră, perioadă în care leptospira
120
este prezentă în sânge. Microorganismul se cantonează apoi în organele parenchimatoase (ficat
şi rinichi), în forma cea mai gravă (sindromul Weil) putând determina apariţia de icter,
hemoragii, necroză tisulară şi disfuncţii de organ. Boala este frecvent bifazică (după o ameliorare
iniţială urmează faza a doua a bolii remarcându-se creşterea titrului de anticorpi de tip IgM).
Infecţia leptospirotică poate conduce relativ frecvent la meningită „aseptică” (cu lichid clar).
Diagnosticul de laborator în leptospiroză poate fi bacteriologic şi / sau serologic.
Diagnosticul bacteriologic este relativ dificil, laborios, respectând etapele cunoscute şi este
cel mai frecvent realizat la nivelul centrului de referinţă.
Diagnosticul porneşte de la elemente clinice şi epidemiologice. Diagnosticul bacteriologic al
leptospirozei este laborios şi costisitor.

antibioterapiei. Produsul patologic poate fi reprezentat de sânge sau LCR (în primele 7-10 zile),
urină (după 9 zile de la debut până la 2-8 săptămâni de boală), dar s-ar putea recolta şi lichid
peritoneal, pleural etc. Datorită fragilităţii leptospirelor şi fenomenului de autoliză, transportul
trebuie să fie realizat rapid, în maxim 1-3 ore, la temperatura camerei.

proaspăt (fără a folosi însă lamela). Preparatul se examinează la microscopul cu fond întunecat.
Există o serie de proceduri utilizate pentru pregătirea preparatului. În cazul lichidului peritoneal,
LCR etc, produsul de centrifughează la 1.500´g pentru o durată de 30 minute, utilizându-se
sedimentul obţinut. În cazul sângelui, recoltarea se face pe anticoagulant (dar nu cu citrat),
urmând o primă centrifugare la 500´g pentru o durată de 5 minute. Preluăm supernatantul pe
care îl centrifugăm la 1.500´g pentru o durată de 30 minute şi utilizăm sedimentul obţinut. În
aceste condiţii, un medic microbiolog cu experienţă ar putea stabili diagnosticul prezumtiv.
Leptospirele apar ca filamente luminoase, spiralate, foarte mobile, cu mişcări de înşurubare şi
flexiune, dar şi cu o uşoară deplasare în spaţiu, pe fondul negru al preparatului.
Unii autori recomandă realizarea de frotiuri colorate Giemsa prelungit sau prin impregnare
argentică (Fontana-Tribondeau), mai ales pentru preparatele histo-patologice; leptospirele apar
ca filamente regulat spiralate cu extremităţile fin îngroşate sub formă de “buton”, de culoare
maro. A fost recomandată şi colorarea imunofluorescentă (IF directă) în cazul suspicionării
diagnosticului de leptospiroză. În ultima perioadă, pornind de la p.p. (ser, urină, LCR etc) au
fost puse la punct tehnici PCR.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează dificil, cu costuri

ridicate, datorită sensibilităţii în mediul extern şi particularităţilor de multiplicare a
leptospirelor. De regulă cultivarea se face la nivelul centrului de referinţă; utilizând medii de
cultură lichide nu obţinem colonii izolate.
Există şi posibilitatea inoculării p.p. la cobai sau alt animal de laborator, intraperitoneal. Starea
clinică trebuie monitorizată zilnic. Identificarea infecţiei se poate face prin diagnostic serologic,
prin izolarea leptospirelor (hemocultură) sau anatomopatologic şi bacteriologic după decesul
sau sacrificarea animalului respectiv.
În cazul utilizării mediilor de cultură este recomandat ca toate p.p. să fie însămânţate atât pe
medii de cultură selective cât şi neselective. Mediul de cultură cel mai cunoscut este mediul
Korthof (cu acizi şi alcooli graşi, care conţine şi ser de iepure), pregătind în acest scop mai multe
tuburi în care însămânţăm cantităţi progresive de p.p. (ex. pornim de la o picătură, continuăm
cu 2 picături etc). Mediile selective includ neomicină şi / sau 5-fluorouracil.
121
Realizăm incubarea la 28º C. Multiplicarea bacteriană nu determină o tulburare a mediului
(apariţia turbidităţii reprezintă cel mai frecvent o contaminare cu o altă bacterie). După 3 zile,
respectând cu stricteţe normele de asepsie, realizăm preparate native pe care le examinăm la
microscopul cu fondul întunecat. În cazul în care rezultatul este negativ, repetăm această
examinare la interval de circa 3 zile pentru o durată totală de minim 4 săptămâni, sau până la
obţinerea unui rezultat pozitiv. În general creşterea bacteriană are loc în 3-14 zile de la momentul
însămânţării.
Costul şi durata diagnosticului cresc şi datorită faptului că, pentru identificare sunt necesare cel
puţin 1-2 repicări pe un alt mediu lichid, după detectarea microscopică a unor microorganisme
care ar putea fi implicate patogenic. O alternativă (şi mai costisitoare, utilizată mai ales dacă
presupunem contaminarea culturii cu o altă bacterie) este reprezentată de inocularea
intraperitoneală a culturii respective la cobai. După 30-60 minute, având în vedere faptul că
leptospirele invadează sistemul circulator mai rapid în comparaţie cu alte bacterii, după
anestezierea animalului se recoltează sânge (prin puncţie cardiacă) şi realizăm o hemocultură.

caractere:
Caractere morfotinctoriale: Realizăm un preparat proaspăt (fără a folosi lamela) din mediul
de cultură şi îl examinăm la microscopul cu fond întunecat. Leptospirele cu dimensiuni de 0,1
mm / 6-15 mm, apar ca filamente luminoase, spiralate, foarte mobile, cu mişcări de înşurubare
şi flexiune, dar şi cu o uşoară deplasare în spaţiu, pe fondul negru al preparatului. Se pot realiza
frotiuri colorate Giemsa prelungit sau prin impregnare argentică (Fontana-Tribondeau) precum
şi prin IF directă.
Caractere de cultură: Leptospirele nepatogene se multiplică la 11-13º C în timp ce L. interrogans

nu.
Caractere biochimice: Leptospirele nepatogene sunt rezistente la 8-azaguanină în timp ce L.

interrogans este sensibilă
Caractere antigenice: Se utilizează seruri de referinţă cu anticorpi faţă de serogrupurile

cunoscute şi tulpina de identificat izolată în cultură pură şi concentrată la o densitate standard,
prin reacţii de aglutinare microscopică, la nivelul centrului de referinţă care a elaborat protocolul
standard de operare; în mod similar se poate identifica şi serovarul implicat
Alte caractere / teste utilizate în identificare la nivelul centrelor de referinţă: tehnici ale
biologiei moleculare (amplificarea prin PCR a fragmentelor obţinute prin restricţie
endonucleazică etc).
5. Antibiograma nu se realizează (nu a fost pusă la punct o tehnică în acest scop). Este cunoscut
faptul că leptospirele sunt sensibile la penicilină, amoxicilină, tetraciclină, doxiciclină etc dar
tratamentul se stabileşte în funcţie de forma şi gravitatea bolii.
Anticorpii specifici se pot evidenţia în serul pacienţilor începând cu a 4-6 - a zi de la debutul
bolii, atingând un nivel maxim între săptămâna a 3-6 - a de boală, după care scad progresiv.
Tehnica de referinţă este reprezentată de reacţia de aglutinare microscopică, realizată pe seruri
pereche (primul recoltat la 1-2 săptămâni de la debut, al doilea recoltat la 3-4 săptămâni de la
debut). O creştere de 4 ori a titrului la a doua determinare semnifică un diagnostic pozitiv. Un
titru ³ 1/800 în prezenţa unor semne clinice este foarte sugestiv. Trebuie să menţionăm că pentru
122
unii pacienţi seroconversia are loc mai tardiv. O altă problemă este reprezentată de faptul că se
utilizează leptospire vii în calitate de Ag cunoscut, motiv pentru care această reacţie nu se poate
practica decât în centrul de referinţă.
La nivelul altor unităţi sanitare se pot practica reacţii de tip ELISA, reacţia de hemaglutinare
indirectă sau reacţia de aglutinare pe lamă utilizând Ag preparate din tulpini saprofite
(sensibilitatea şi specificitatea acestor reacţii este mai scăzută). Tehnica ELISA de identificare a
anticorpilor de tip IgM pune diagnosticul infecţiei acute dar nu poate permite determinarea
serogrupului implicat aşa cum se întâmplă în cazul tehnicii de referinţă.
29. Rickettsiaceae
Rickettsiile sunt microorganisme care iniţial au fost încadrate printre virusuri deoarece
au dimensiuni mai mici decît bacteriile (600/300 nm) şi în majoritate nu se pot cultiva decât pe
gazde vii. Familia Rickettsiaceae include trei genuri, genul Rickettsia, genul Coxiella şi genul
Ehrlichia.
Microorganismele sunt transmise de obicei de către artropode (păduche, purice, căpuşă)

multiplicîndu-se în corpul acestora. Cel puţin patru rickettsii (Rickettsia rickettsii, Rickettsia
conorii, Rickettsia tsutsugamushi, Rickettsia akarii) şi probabil şi altele sunt transmise
transovarian în artropode care servesc deopotrivă ca vector şi rezervor. Rickettsia prowazeckii,
agentul etiologic al tifosului exantematic este considerată ca specia tip a genului Rickettsia.
În cele mai multe cazuri, rickettsiozele se caracterizează prin asocierea unui sindrom
infecţios sever cu un exantem. Clasificarea lor se poate face după mai multe criterii. După
principalele caractere clinice şi epidemiologice rickettsiozele se pot împărţi în următoarele
grupe: a). tifosul de păduche sau purice; b). grupul febrelor butonoase (febrele peteşiale)
reuneşte rickettsiozele transmise prin căpuşe care parazitează animalele domestice şi sălbatice;
c). grupul tifos tropical reuneşte rickettsiozele transmise de larvele unor mici acarieni. „Tifosul
pulmonar” sau febra Q are ca agent etiologic Coxiella burnetii poate fi transmisă şi de căpuşe,
contaminarea este însă posibilă şi pe cale respiratorie sau digestivă.
Microorganismele se multiplică în celulele endoteliului vaselor sanguine mici şi produc

vasculite. Celulele se umflă şi se necrozează, apar tromboze ale vaselor care duc la ruptură şi
necroză. Leziunile vasculare par a fi baza alterărilor hemostazei. Pot apărea coagulare
intravasculară diseminată şi ocluzii vasculare. La nivel cerebral apar agregări limfocitare,
leucocitare şi ale macrofagelor ceea ce conduce la apariţia „nodulilor tifici”. Se observă leziuni
similare în vasele mici la nivel cardiac sau la nivelul altor organe. Infecţiile rickettsiene se
caracterizează prin febră, cefalee, indispoziţie, prostraţie (stare generală foarte alterată), rash
(erupţie) cutanat şi mărirea splinei şi ficatului. În febra Q nu există leziuni cutanate.
Vom discuta în continuare despre diagnosticul febrei Q deşi Coxiella burnetii poate
produce şi un sindrom febril auto-limitat (2-14 zile), endocardită, hepatită, osteomielită etc.
Febra Q se poate manifesta prin pneumonie atipică, pneumonie rapid progresivă sau pneumonie
în care semnul principal este reprezentat de febră (simptomatologia pulmonară fiind absentă iar
implicarea pulmonară putând fi demonstrată paraclinic). Pornim de la elemente clinice
(nespecifice), paraclinice şi de laborator şi încercăm stabilirea etiologiei prin diagnostic
microbiologic (bacteriologic şi serologic). Obţinerea de hemoculturi şi sputoculturi negative
pentru alte microorganisme este un element care în contextul clinic şi paraclinic reprezintă un
element sugestiv.
123

antibioterapiei. Produsul patologic este reprezentat cel mai frecvent de spută; putem recolta şi
sânge (ar fi de preferat cheagul sanguin), lichid pleural, lichid pericardic, fragmente de placentă
(în cazul unui avort) etc. Transportul trebuie realizat rapid şi în condiţii de maximă siguranţă
(ceea ce trebuie respectat în toate etapele diagnosticului bacteriologic; microorganismele din
familia Rickettsiaceae prezintă un grad însemnat de infecţiozitate prin aerosoli). În cazul în care
p.p. nu poate fi procesat şi inoculat imediat este recomandată menţinerea la -20º C (inclusiv pe
parcursul transportului).
2. Examinarea microscopică a produsului patologic este rareori utilă pentru diagnostic. În

spută, mai ales dacă este recoltată prin biopsie transbronşică, putem remarca prezenţa
macrofagelor alveolare iar printre acestea prezenţa unor cocobacili de dimensiuni mici. Pornind
de la gena pentru superoxid-dismutază au fost obţinuţi primeri (amorse) utilizaţi în amplificarea
genetică, pornind de la produsul patologic.
3. Cultivarea pe produsului patologic se poate realiza numai pe gazde vii, la nivelul unui
laborator de referinţă. Trebuie luate toate măsurile de prevenire a unei infecţii în laborator.
Coxiella burnetii poate cultiva pe animal de laborator (cobai), culturi de celule sau ou de găină
embrionat (la nivelul sacului vitelin). În afară de p.p. menţionate mai sus am putea folosi pentru
inoculare şi artropode. La nivelul sacului vitelin C. burnetii suferă o variaţie de fază, întrucâtva
similară variaţiei de la forma S la forma R întâlnită la alte bacterii. Tulpinile recent izolate sunt
în faza I în timp ce după subcultivare se obţin tulpini cu virulenţă scăzută, în faza II.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza astfel:

Caractere morfotinctoriale:
· evidenţierea prin imunofluorescenţă directă a microorganismelor în hemolimfa animalelor
infectate sau la nivelul sacului vitelin al oului de găină embrionat
· realizarea de frotiuri colorate prin metoda Gimenez (microorganismele apar de culoare
roşie pe fondul verde al frotiului) sau Machiavello (microorganismele apar de culoare roşie pe
fondul albastru al frotiului); se poate utiliza şi metoda Giemsa
· Evaluarea prezenţei anticorpilor anti-C. burnetii la animalele de laborator inoculate cu p.p.
· Tehnici ale biologiei moleculare (PCR) etc.
5. Testarea sensibilităţii la antibiotice nu se realizează de rutină. Cercetări efectuate după

cultivarea C. burnetii pe linii de celule fibroblastice L929 au permis autorilor să afirme că
tulpinile studiate au fost sensibile la chinolone (în special) şi rifampicină dar mai puţin la
cloramfenicol, doxicilină şi trimetoprim. Totuşi, tratamentul febrei Q se poate face cu se face cu
tetraciclină sau macrolide în asociere cu rifampicină.
Datorită dificultăţii şi riscurilor diagnosticului bacteriologic, cel mai frecvent în practică
se utilizează diagnosticul serologic. Există mai multe tehnici de laborator care pot fi utilizate dar
RFC rămâne în continuare metoda de referinţă. O creştere de 4 ori a titrului la a 2-a determinare
ajută la punerea diagnosticului pozitiv în febra Q. Mai putem utiliza reacţia de microaglutinare,
reacţia de microimunofluorescenţă indirectă, o tehnică de tip ELISA sau reacţia de
latexaglutinare (pozitivă în infecţia acută). Reacţia de microimunofluorescenţă indirectă
prezintă un nivel ridicat de sensibilitate şi specificitate în condiţiile în care personalul de
laborator este bine pregătit şi are experienţă în acest tip de diagnostic. În ceea ce priveşte
124
depistarea specifică a Ac de tip IgM, în acest caz nu este utilă deoarece IgM pot persista între 1
şi 2 ani după infecţia acută.
În diferite studii epidemiologice a fost utilizată şi reacţia de seroneutralizare. Injectând
la şoarece ser specific anti-C. burnetii, acesta va neutraliza efectul inoculării de microorganisme
vii pe cale intraperitoneală sau intravenoasă. Pentru ultima metodă reamintim necesitatea luării
tuturor măsurilor de prevenire a unei infecţii a personalului de laborator.
30. GENUL CHLAMYDIA

Chlamydiile sunt bacterii de dimensiuni mici (0,25-1 mm), gram negative, strict parazite,
imobile, care se multiplică în citoplasma celulelor gazdă printr-un ciclu de dezvoltare
caracteristic. Datorită importanţei pentru diagnostic, vom prezenta ciclul de dezvoltare al
chlamydiilor. După ce pătrunde în interiorul celulei gazdă, particula infecţioasă (corpusculul
elementar, formă cocoidă, cu diametrul de 0,25-0,3 mm) se transformă într-o particulă mai mare
(corpuscul reticulat, cu diametrul de 0,5-1 mm). Corpusculii reticulaţi se reunesc şi se multiplică
prin diviziune binară, formând colonii (incluzii) intracitoplasmatice. După o perioadă variabilă
în funcţie de specia de chlamydii şi de celula parazitată, de la nivelul incluziilor apar noi
corpusculi elementari, care sunt expulzaţi, urmând să paraziteze alte celule. Întregul ciclu
durează 24-48 ore.
Genul conţine trei specii care pot fi implicate în patologia umană. De regulă infecţia este
subclinică, boala reprezentând o excepţie la gazdele naturale ale acestor germeni. Transmiterea
de la păsări la om favorizează apariţia bolii. C. trachomatis produce incluzii compacte
intracitoplasmatice, cu glicogen. Include tulpini care determină pneumonie la şoarece şi câteva
afecţiuni umane: trahom (serovarurile A, B, Ba şi C), conjunctivite, uretrite nongonococice,
salpingite, cervicite, pneumonii la nou-născuţi (serovarurile D-K) şi limfogranulomatoza
veneriană (serovarurile L1-L3). C. psittaci produce incluzii intracitoplasmatice difuze, sărace în
glicogen. Include tulpini care determină psitacoza umană, ornitoze la păsări, meningită,
pneumonie la feline şi multe alte afecţiuni ale animalelor. (provoacă infecţii la animale dar poate
fi transmisă omului). C. pneumoniae poate provoca la gazda umană pneumonii atipice la fel ca
şi C. psittaci, Coxiella burnetii sau Mycoplasma pneumoniae. Unii autori clasifică C. psittaci şi
C. pneumoniae în genul Chlamydophila.
Diagnosticul de laborator în infecţiile chlamydiene poate fi bacteriologic şi imunologic.

Infecţiozitatea (prin aerosoli) este importantă astfel că trebuie luate toate măsurile necesare
pentru prevenirea apariţiei unor infecţii la personalul de laborator.
Diagnosticul bacteriologic complet poate fi realizat la nivelul unor centre de referinţă.

antibioterapiei şi respectând măsurile de precauţie. Produsul patologic poate fi reprezentat
deraclat conjunctival sau de la nivelul altor mucoase (ex. cervivală), urină, spermă, secreţie
purulentă uretrală, secreţii nazale, secreţii faringiene, spută, aspirat ganglionar, puroi din fistulă
etc. Ne vom referi în continuare la diagnosticul infecţiei produse de C. trachomatis. În cazul în
care spre ex. secreţia uretrală nu este evidentă, putem utiliza un tampon subţire pe care îl
introducem cu blândeţe 3-5 cm în uretră, rotindu-l uşor. Indiferent de p.p. recoltat, tampoanele
125
nu trebuie să fie din vată sau alginat de calciu ci din Dacron. Produsul trebuie să fie prelucrat
imediat. Dacă acest lucru nu este posibil, transportul se va face în medii speciale de transport
sau la cel puţin -20º C (preferabil -70º C).
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea unor frotiuri pe care

le colorăm după cum urmează. Cea mai sensibilă şi specifică metodă pentru punerea în evidenţă
a incluziilor intracitoplasmatice sau corpusculilor elementari este imunofluorescenţa. Frotiul
este uscat, fixat chimic (cu acetonă, la -20º C) şi „colorat” imunofluorescent (metoda directă sau
indirectă). Urmărim prezenţa celulelor inflamatorii (PMN) şi a celulelor caracteristice ţesutului
de la nivelul căruia am realizat recoltarea. Incluziile apar ca o masă bine definită, cu fluorescenţă
de ex. galben-verzui, în interiorul celulelor epiteliale. Frotiul va fi examinat cel puţin 3 minute
în cazul în care pare să fie negativ. În afară de Celelalte frotiuri le putem colora prin metoda
Gimenez (corpusculii elementari apar aglomeraţi şi de culoare roşie pe fondul verde al frotiului),
cu lugol (incluziile de C. trachomatis conţin glicogen; apar ca o masă de culoare brună) sau
Machiavello (corpusculii elementari apar aglomeraţi şi de culoare roşie pe fondul albastru al
frotiului). Unii autori menţionează că examenul citologic, cu punerea în evidenţă a unor
limfocite „transparente” şi a unui număr crescut de histiocite este sugestiv pentru infecţia cu C.
trachomatis. Prin tehnici de tip ELISA se pot pune în evidenţă antigene în p.p. Există şi tehnici
ale biologiei moleculare care pot fi aplicate direct pe p.p. (sonde nucleotidice, PCR etc).
3. Pentru cultivarea produsului patologic am putea utiliza oul de găină embrionat (la nivelul
sacului vitelin) dar de regulă se folosesc culturile de celule. Pentru Chlamydia trachomatis se pot
utiliza liniile celulare BGMK, HeLa 229 (tratate cu dextran şi cicloheximidă), McCoy (tratate cu
cicloheximidă 1 mg/ml), pentru Chlamydia pneumoniae se pot utiliza liniile celulare HeLa, HEp-
2, pentru Chlamydia psittaci se poate utiliza linia celulară McCoy etc. Înainte de inocularea pe
culturile de celule, p.p. este centrifugat (3000´g, timp de 60 minute). Se pot utiliza culturile de
celule în sistemul clasic sau micrometoda de cultivare pe culturi de celule în godeuri. Incubarea
durează 48-72 de ore. Tehnica incubării este destul de complexă (incubări repetate, în condiţii
diferite) şi trebuie să respecte strict protocolul de lucru.
4. Identificarea se va realiza diferenţiat. În cazul în care s-a utilizat micrometoda, godeurile se

examinează microscopic după colorare cu lugol sau prin imunofluorescenţă. În cazul cultivării
prin metoda clasică, realizăm frotiuri pe care le fixăm chimic (de ex. cu metanol). Un frotiu va fi
colorat cu lugol (incluziile de C. trachomatis conţin glicogen) iar altul cu Ac monoclonali marcaţi
fluorescent. Se pot aplica şi tehnici de biologie moleculară.
5. Nu există tehnici standardizate de stabilire a sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice

a tulpinilor de Chlamydia spp. În tratament se pot folosi eritromicina (sau alte macrolide),
tetraciclinele sau fluorochinolonele.
Diagnosticul serologic implică utilizarea reacţiei de fixare a complementului, reacţiei de
microimunofluorescenţă şi a tehnicilor de tip ELISA. Se consideră că un titru ³ 1/64 este sugestiv
în timp ce o creştere de 4 ori a titrului în dinamică permite diagnosticul pozitiv. Identificarea
prezenţei Ac de tip IgM la nou născuţi permite diagnosticul de pneumonie cu C. trachomatis.
Tehnicile imunologice sunt frecvent utilizate în scop epidemiologic (studii de seroprevalenţă).
Utilizarea intradermoreacţiei (IDR Frei) a intrat în istoria medicinii.
126
31. GENUL MYCOPLASMA
Clasa Mollicutes include patru ordine. Ordinul Mycoplasmataceae include genurile
Mycoplasma (circa 100 specii) şi Ureaplasma (6 specii). Câteva dintre speciile acestor genuri
prezintă interes medical. Mycoplasmele sunt cele mai mici microorganisme care pot trăi liber în
natură (125-250 nm) şi se pot multiplica pe medii de laborator. M. pneumoniae este implicată în
infecţii respiratorii, M. hominis poate produce infecţii cu localizare genitală inclusiv infecţii
post-abortum şi post-partum în timp ce U. urealyticum a fost izolată din uretrite non-gonococice
şi din alte infecţii uro-genitale.
Diagnosticul de laborator poate fi bacteriologic şi / sau serologic, în funcţie de localizarea

infecţiei şi specia implicată.
Diagnosticul infecţiilor respiratorii porneşte de la elemente clinice şi paraclinice şi poate
fi confirmat etiologic prin diagnosticul microbiologic.

antibioterapiei. Produsul patologic poate fi reprezentat de exsudat faringian, secreţii nazale,
spută, secreţii genitale, urină etc dar în continuare vom discuta numai diagnosticul de laborator
în infecţiile respiratorii. Transportul trebuie realizat la rece (la +4º C) cât mai rapid posibil, fără
a depăşi un maxim de 3-4 ore de la recoltare. O alternativă este reprezentată de utilizare mediilor
speciale de transport care pot asigura conservarea p.p. pentru cel mult 24 de ore. Utilizarea
azotului lichid (-70º C) permite conservarea probelor timp de mai multe zile dar nu este încă
accesibilă (cu foarte puţine excepţii) sistemului sanitar românesc.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic nu permite obţinerea unor rezultate

utile, M. pneumoniae ca şi celelalte specii ale ordinului are dimensiuni foarte reduse. Unii autori
recomandă realizarea de frotiuri colorate imunofluorescent. Pornind de la p.p. s-ar putea realiza
amplificarea genetică (PCR) cu o sensibilitate foarte bună. Prin tehnici de tip ELISA pot fi puse
în evidenţă Ag de M. pneumoniae în spută.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se poate realiza utilizând tehnici şi

medii speciale. Unul dintre mediile de cultură cunoscut este mediul îmbogăţit, pe bază de
infuzie de cord bovin numit generic PPLO. Acest mediu include atât substanţe nutritive, surse
de energie, indicator de pH (roşu fenol) cât şi substanţe care îi asigură selectivitatea (penicilină
şi/sau acetat de taliu). Cei mai mulţi autori recomandă însămânţarea p.p. atât pe un mediu de
cultură solid cât şi pe un mediu de cultură lichid (ex. bulion PPLO). Vom realiza o incubare la
37º C în atmosferă de 5% CO2 şi urmărim culturile pe mediul lichid pentru a sesiza cât mai rapid
(dar nu mai devreme de 48-72 ore de incubare) modificările de culoare care trădează virajul pH-
ului. Mediul devine acid prin fermentarea glucozei în cel mult 3-4 săptămâni. Este recomandat
să realizăm repicări pe medii solide şi lichide cât mai curând după ce am observat virajul pH-
ului.

caractere:
Caractere morfotinctoriale nu sunt utile în identificarea M. pneumoniae
127
· Se pot examina la stereomicroscop (cu mărire de minim 25´). În scopul identificării trebuie
să „citim” placa cu mediu agarizat de cel puţin 2 ori pe săptămână. Pot apărea colonii de
dimensiuni foarte mici (cu diametru de la 10 mm până la 200 mm), cu aspect muriform. Sunt
descrise şi colonii cu aspect de „ou-ochi”, cu centrul dens, opac, înconjurat de o zonă periferică
mai clară pe care unii autori le consideră drept tipice pentru Mycoplasma (astfel de colonii ar
mai putea fi produse de bacterii în formă L şi necesită realizarea diagnosticului diferenţial).
· Se poate realiza şi cultivarea pe oul de găină embrionat (inoculare intravitelină) sau în
culturi de celule.
· Fermentează glucoza, nu metabolizează arginina, nu hidrolizează ureea dar reduce (în
aerobioză) tetrazoliul. Acesta este un compus incolor, iar în cazul în care este redus la formazan,
culoarea devine roşie. Testul se poate realiza direct pe placa pe care presupunem prezenţa
coloniilor de M. pneumoniae.
· Alte caractere care ar putea fi utilizate în identificare sunt
· Fenomenul adsorbţiei hematiilor de cobai
· Colorarea imunofluorescentă a coloniilor cu seruri specifice marcate cu fluorocromi
· Inhibarea dezvoltării coloniilor în jurul unor discuri impregnate cu anticorpi specifici
· Tehnici ale biologiei moleculare (sonde nucleotidice, PCR) etc.
5. Nu există o standardizare a tehnicilor pentru determinarea sensibilităţii la antibiotice şi

chimioterapice. Tratamentul pneumoniei cu M. pneumoniae se poate face cu eritromicină sau
alte macrolide sau cu tetracicline. Durata tratamentului este de circa 3 săptămâni.
În cursul infecţiei se produc Ac din diferite clase, unii fiind utili pentru neutralizarea M.
pneumoniae în timp ce alţii acţionează ca auto-Ac. Dintre aceştia, aglutininele „la rece” sunt Ac
de tip IgM oligoclonali care reacţionează cu un Ag de la suprafaţa hematiilor pacienţilor infectaţi
cu M. pneumoniae. Cu toate că există şi alte maladii în care apar aglutinine la rece, iar pe de altă
parte aceştia nu se pot identifica la toţi pacienţii infectaţi cu M. pneumoniae, demonstrarea
aglutininelor la rece continuă să fie utilă în diagnosticul serologic. Utilizăm serul pacientului pe
care îl amestecăm cu eritrocite provenite de la pacienţi de grup O, incubăm la 0º C câteva minute
şi urmărim apariţia aglutinării. Dacă apare aglutinarea repetăm testul realizând diluţii de ser
pentru a determina titrul. Un titru ³ 1/32 este sugestiv pentru infecţia cu M. pneumoniae.
Se poate utiliza şi RFC, dar pentru că Ac fixatori de complement apar tardiv este utilă în
studii epidemiologice. Tehnica de tip ELISA poate determina Ac de tip IgM şi este utilă în infecţia
acută.
32. GENUL CANDIDA

Genul cuprinde peste 81 de specii, din care 7 sunt sigur implicate în patologia umană. Fac
parte din levuri. Candida albicans produce pseudomicelii atât în culturi, cât şi în produse
patologice sau la nivel tisular.
CARACTERE GENERALE
1. Habitat: Speciile de Candida pot fi izolate de la omul sănătos, spre exemplu de la nivelul
tractului respirator superior, digestiv şi de la nivel vaginal. În aceste zone echilibrul între
microorganism şi gazdă poate fi modificat, situaţie în care pot apărea o serie de aspecte
128
patologice. Mai rar (de obicei la persoane a căror apărare antiinfecţioasă este deficitară) pot
rezulta diseminări hematologice (fungemie) şi diferite infecţii de tipul tromboflebitei,
endocarditei, infecţiilor oculare sau la nivelul altor organe.
2. Morfologie: În frotiurile realizate din produse patologice, Candida albicans apare ca o levură
ovalară, Gram-pozitivă, cu dimensiuni de 2-3/4-6 µm, cu posibilitatea apariţiei unor pseudohife.
3. Caractere de cultură: Pe mediul de cultură Sabouraud, incubate la temperatura camerei sau

la 37ºC, apar colonii de tip S, cu o consistenţă cremoasă şi cu un miros relativ caracteristic.
4. Caractere biochimice: Candida albicans fermentează glucoza şi maltoza cu producere de

acid şi de gaz. Produce acid din sucroză şi este lactoză-negativă. Fermentarea carbohidraţilor
permite diferenţierea C. albicans de alte specii de Candida.
5. Caractere antigenice: În structura corpului celular al speciilor de Candida există antigene

zaharidice care permit împărţirea genului în două grupe (A şi B). Extrasele antigenice utilizate
în testele serologice şi respectiv imunobiologice constau de fapt din mai multe structuri
antigenice nediferenţiate. Anticorpii care apar faţă de aceste structuri antigenice pot fi
identificaţi prin reacţii de precipitare, imunodifuzie, contraimunoelectroforeză sau latex
aglutinare.
RĂSPUNS IMUN
S-a reuşit experimental imunizarea unor animale de laborator care devin rezistente faţă de o
eventuală candidoză sistemică. În cazul omului, se poate afirma deocamdată doar că
mecanismul imun este complex şi în curs de elucidare.
Factorii de patogenitate ai C. albicans sunt reprezentaţi de anumite enzime, spre

exemplu proteinaze, hidrolaze, esteraze, ribonucleaze şi de anumite substanţe care inhibă
răspunsul imun (spre exemplu mananul, care s-a dovedit că inhibă proliferarea limfocitelor T).
Este necesar de subliniat că în apariţia unei infecţii diseminate cu Candida sunt implicaţi în
special anumiţi factori care ţin de gazda infectată, aceasta având anumite deficienţe în apărarea
antiinfecţioasă.
Factorii implicaţi în apariţia unei candidoze
Factorii care sunt implicaţi în apariţia unei candidoze ar putea fi împărţiţi în două categorii:
intrinseci şi extrinseci.
Factorii intrinseci mai importanţi sunt reprezentaţi de:
- vârstă (nou-născuţi, vârstnici);

- sarcină, începând din luna a IV-a;
- endocrinopatii (diabet zaharat, insuficienţă suprarenaliană, insuficienţă tiroidiană);
- hemopatii maligne;
- anemii aplazice;
- agamaglobulinemie şi hipogamaglobulinemie;
- infecţia cu HIV şi SIDA;
- alte cauze de imunodepresie.
129
Factorii extrinseci mai importanţi sunt reprezentaţi de:
- antibioterapia incorect administrată, care poate conduce la dismicrobisme şi la un grad de

inhibare a răspunsului imun;
- terapia antituberculoasă şi antiparazitară;
- terapia imunosupresivă;
- utilizarea (pe cale generală) a medicamentelor anticoncepţionale;
- efectuarea anumitor manopere medico-chirurgicale (cateterisme, implante etc);
- utilizarea radiaţiilor ionizante.
Speciile de Candida implicate patogenic (de exemplu Candida albicans) aderă la epitelii
şi mucoase (au afinitate pentru componente ale peretelui celular), colonizează şi se multiplică,
trecând în starea de pseudofilamente. Ulterior pot traversa epiteliul şi pot invada capilarele
sanguine, ducând la fungemie şi eventual la septicemie fungică.
Forme clinice
Formele clinice mai frecvent întâlnite sunt:
a) bucale şi peribucale:
- stomatită (mucoasa bucală este eritematoasă, cu depozite albicioase);
- glosită (limba este netedă, depapilată sau prezintă depozite albicioase, cu aspect „păros”, cu
următoarele simptome: arsuri la deglutiţie, mâncărime, dureri);
- amigdalită;
- cheilită (buzele sunt crăpate, scuamoase, sângerânde, leziunile fiind localizate la nivelul
comisurii bucale).
b) genitale:
- vaginite;
- vulvite;
- balanoprostatite;
c) cutanate şi ale fanerelor:

- onixis şi perionixis (dureri şi tumefacţii periunghiale);
- intertrigo axilar, submamar, interfesier, interdigital, cu leziuni exsudative, eritematoase,
scuame şi uneori vezicule cu lichid clar sau purulent (în cazul unor suprainfecţii bacteriene).
d) generalizate:
- viscerale (bronhopneumonie, endocardită, meningită, infecţii digestive, infecţii urinare);
- septicemii.
Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Candida albicans
Diagnosticul infecţiilor fungice nu este un diagnostic facil, dar este foarte important şi ar
trebui realizat de rutină, pentru că trebuie să avem în vedere că aceste afecţiuni sunt mult mai
frecvente decât sunt raportate, în ţara noastră.
Oricare laborator clinic ar trebui să poată realiza cel puţin examinarea microscopică în
vederea evidenţierii levurilor sau structurilor miceliene sau pseudo-miceliene precum şi testul
filamentării. Dintre infecţiile fungice vom discuta în continuare doar despre infecţiile produse
de levuri şi dintre acestea numai despre infecţiile produse de levurile din genul Candida, mai
precis de specia Candida albicans.
130
În ceea ce priveşte diagnosticul unei infecţii cu Candida spp. (respectiv C. albicans) există
anumite particularităţi de care trebuie ţinut cont atunci când se diagnostichează o candidoză
localizată la nivel muco-cutanat în comparaţie cu o candidoză localizată profund. Diagnosticul
poate fi micologic (direct) sau imunologic (indirect).
Diagnosticul micologic

de reguli (cât mai aproape de debutul bolii, înainte ca pacientului să fi primit antibiotice
antifungice, cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate
normele de asepsie şi antisepsie etc). În cazul candidozelor superficiale, după antiseptizarea
suprafeţei leziunii raclăm spre ex. tegumentul şi colectăm scuamele rezultate într-un recipient.
Mai putem recolta fire de păr, fragmente de unghie etc. În principiu putem introduce p.p.
recoltat în pachet de hârtie, introdus la rândul lui într-o cutie Petri. Transportul trebuie să
dureze maxim 48 de ore. În cazul candidozelor profunde ca şi în cazul candidozelor localizate
la nivelul mucoaselor trebuie să evităm uscarea p.p. pe parcursul transportului. Vom utiliza
recipiente care se pot închide ermetic şi dacă estimăm că transportul va dura mai mult de 1-2 ore
introducem în recipient un tampon de vată sau tifon umezit cu soluţie salină fiziologică. Pentru
a preveni multiplicarea bacteriană putem adăuga p.p. antibiotice (ex. penicilină, streptomicină,
cloramfenicol). Este bine ca volumul de p.p. recoltat să fie cât mai mare. În cazul candidozelor
profunde preferăm ca recoltarea să fie urmată imediat de realizarea preparatelor microscopice
şi însămânţare pe medii de cultură (la patul bolnavului).
2. Examinarea microscopică a produsului patologic se realizează diferit, în funcţie de p.p.

prelucrat, dar face parte din orice examen micologic.
În cazul în care examinăm o secreţie sau un produs obţinut prin raclare de la nivel
tegumentar sau fragmente de unghie vom realiza un preparat proaspăt (umed), montat în
soluţie de 10-30% KOH-glicerol. Putem utiliza pentru colorare calcofluor alb, un fluorocrom care
permite evidenţierea levurilor datorită faptului că au în compoziţie chitină (la nivelul peretelui
celular). Elementele fungice (levuri ovoide, cu dimensiunea de 4/6 mm, pseudomicelii şi micelii)
apar galben-verzui sau alb-albăstrui în funcţie de lungimea de undă a radiaţiei de excitaţie.
Punerea în evidenţă a formaţiunilor menţionate mai sus permite suspicionarea prezenţei
Candida spp., dar pentru confirmarea prezenţei C. albicans este necesară obţinerea culturilor
pure şi identificarea acestora.
În cazul în care examinăm secreţii de la nivelul mucoaselor vom pregăti atât preparate umede
cât şi frotiuri pe care le vom colora (Gram, AM sau Giemsa). Pentru creşterea sensibilităţii
examinării preparatelor umede, acestea vor fi colorate cu calcofluor alb sau cu lactofenol
albastru cotton. Indiferent de metoda utilizată, punerea în evidenţă a levurilor şi
pseudomiceliilor ridică o suspiciune, însă datorită prezenţei Candida spp., în flora microbiană
normală (ex. bucală, vaginală etc) doar punerea în evidenţă a miceliilor alături de prezenţa
formelor levurice (Gram pozitive la coloraţia Gram) poate permite confirmarea infecţiei. Este
necesară obţinerea culturilor pure şi identificarea acestora. Pe de altă parte, dorim să menţionăm
că o cultură pozitivă în absenţa unui examen microscopic pozitiv ridică semne de întrebare
privind diagnosticul infecţie cu C. albicans.
În cazul candidozelor profunde, interpretarea se va face diferenţiat. Atunci când p.p. este normal
steril (recoltat prin puncţie lombară, lavaj bronho-alveolar, puncţie bioptică etc), identificarea
structurilor fungice (levuri, micelii) este foarte importantă pentru diagnostic. Dacă p.p. este
reprezentat de urină, materii fecale, spută sau alt produs potenţial contaminat de flora
131
microbiană normală, interpretarea este mai dificilă în ceea ce priveşte semnificaţia structurilor
fungice observate. Pentru examinarea p.p. recoltate de la pacienţi care prezintă candidoze
profunde vom realiza atât preparate umede cât şi frotiuri fixate, colorate prin metodele amintite.
Este posibil ca elementele fungice să apară deformate datorită fixării precipitatelor de colorant,
pe frotiul colorat Gram. În cazul biopsiilor tisulare am putea utiliza coloraţiile histochimice.

poată obţine colonii izolate şi respectiv o cultură pură, care se va identifica. Există mai multe
medii de cultură care pot fi utilizate. Cel mai cunoscut este mediul Sabouraud (agar, glucoză sau
maltoză, polipeptonă) produs şi de INCDMI „Cantacuzino”. În cazul p.p. contaminate vom folosi
şi medii selective, de ex. mediul Sabouraud cu antibiotice (cloramfenicol, gentamicină şi/sau
tetraciclină) şi/sau mediul Sabouraud cu cicloheximidă. Dorim să menţionăm că în cazul p.p.
necontaminate realizăm cultivarea numai pe mediul Sabouraud neselectiv în timp ce în cazul
p.p. contaminate vom realiza cultivarea atât pe mediul neselectiv cât şi pe mediile selective.
Putem incuba plăcile la 22-30º C, dar mai frecvent incubarea se realizează la 28º C (sau la
temperatura camerei) şi la 35-37º C, timp de 24-96 ore în cazul candidozelor superficiale şi până
la maxim 3 săptămâni în cazul candidozelor profunde.

caractere:
Caractere morfotinctoriale: Examenul microscopic al culturilor de levuri se realizează

asemănător cu ceea ce am discutat în cazul identificării bacteriilor. Există însă şi anumite
particularităţi.
Vom realiza atât preparate proaspete, colorate de ex. cu lactofenol cât şi frotiuri fixate şi colorate.
Vom putea remarca prezenţa levurilor (blastoconidii), rotunde, ovoide sau puţin mai alungite,
gram pozitive, putând prezenta muguri şi pseudomicelii. Prin examenul microscopic dovedim
şi puritatea coloniei.
După repicarea pe agar cu făină de porumb sau agar cu extract de cartof (medii sărace din punct
de vedere nutritiv), examinarea microscopică a preparatului proaspăt va demonstra producerea
de chlamidoconidii (chlamidospori) care apar la extremitatea pseudomiceliilor. Testul este
negativ în numai 3-4% dintre cazuri.
Produc colonii de tip S, rotunde, bombate, netede, asemănătoare cu unele colonii bacteriene dar
cu dimensiuni mai mari. Coloniile apar în 1-4 zile, au o culoare albă sau alb-gălbuie şi consistenţă
cremoasă. În timp suprafaţa coloniilor capătă un aspect „zbârcit”.
Auxanograma: Levurile prezintă un anumit echipament enzimatic cu ajutorul căruia pot să

utilizeze un anumit carbohidrat ca unică sursă de carbon. Dezvoltarea pe un mediu în care este
inclus un singur carbohidrat demonstrează utilizarea acestuia ca unică sursă de carbon. În mod
asemănător se poate testa capacitatea asimilării unor substanţe azotate. C. albicans asimilează
glucoză, maltoză, trehaloză, galactoză etc.
Zimograma: Testarea fermentării unor carbohidraţi
Utilizarea unor teste produse comercial precum API 20C, API 32C, Vitek etc
132
Relativ recent au fost puse la punct medii cromogene (ex. CHROM-agar) care testează
producerea anumitor enzime şi sunt utile în identificarea C. albicans, C. krusei şi C. tropicalis.
Se pot utiliza reacţia de aglutinare pe lamă, reacţia de latex-aglutinare sau ELISA folosind
antiseruri cunoscute. Ultimele două tehnici sunt folosite şi în scopul identificării prezenţei Ag
de Candida spp. în diferite p.p.
Caractere de patogenitate:
Pornind de la o cultură de 24 de ore în mediul Sabouraud lichid separăm sedimentul şi realizăm

o suspensie 0,2% a acestuia în soluţie salină fiziologică sterilă; inoculăm în venele cozii la un lot
de şoareci (câte 0,2-0,8 ml pentru fiecare animal) suspensia obţinută şi urmărim evoluţia
animalelor timp de 4-10 zile; dacă este vorba de o tulpină de C. albicans patogenă, animalele vor
muri după circa 1 săptămână (anatomopatologic vom putea evidenţia abcese miliare renale,
splenice, hepatice) etc.
Alte teste ce pot fi studiate în scopul identificării germenilor:
Testul filamentării (testul producerii de tubi germinativi): Verificăm capacitatea blastoconidiilor

de a produce, în anumite condiţii, tubi germinativi. Repicăm tulpina de studiat pe medii care
conţin ser de iepure sau de berbec. La intervale de 60 de minute realizăm preparate proaspete
(între lamă şi lamelă), examinăm microscopic pentru a identifica apariţia tubilor germinativi.
C. albicans produce în maxim 4 ore pseudofilamente (tubi germinativi) relativ scurte, fără
stricturi, cu acelaşi calibru.
Detectarea unor metaboliţi prin gaz-lichid cromatografie (GLC)
Teste de biologie moleculară (sonde nucleotidice, PCR).
5. Antifungigrama (verificarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea stabilirii

tratamentului) a fost pusă la punct relativ recent. Eforturile depuse în vederea standardizării
acestei tehnici au avut la bază creşterea interesului faţă de infecţiile fungice precum şi apariţia
fenomenului de rezistenţă la medicamentele antifungice a tulpinilor izolate. Metoda
recomandată de NCCLS este cea a diluţiilor în bulion.
Diagnosticul imunologic poate fi serologic şi imunobiologic.
Cu toate că o serie de autori consideră drept nerelevant acest tip de diagnostic, diferite studii
arată că identificarea şi titrarea Ac anti-C. albicans poate fi utilă în diagnosticul candidozelor
profunde. Iniţial au fost utilizate tehnici de aglutinare pentru detectarea prezenţei Ac anti-
manan. Ulterior au fost puse la punct tehnici pentru detectarea prezenţei Ac faţă de Ag localizate
în citoplasma C. albicans. Au fost utilizate imunodifuzia în gel, contraimunoelectroforeza, ELISA
şi tehnica de latex-aglutinare.
133
Intradermoreacţia cu candidină este pozitivă la practic toate persoanele adulte, fiind astfel utilă
nu în diagnosticarea unei infecţii cu Candida, ci în aprecierea RIC. Se mai poate utiliza testul
transformării blastice a limfocitelor în prezenţa unor Ag de C. albicans. Trebuie să menţionăm
că există o serie de probleme privind standardizarea şi interpretarea tehnicilor diagnosticului
imunologic. Cu toate că prin aceste modalităţi utilizate izolat nu putem pune diagnosticul de
candidoză, interpretarea ansamblului rezultatelor de laborator obţinute poate fi de folos în
elucidarea implicării patogenice a tulpinilor de Candida albicans.
Tratament
Nistatina nu se absoarbe intestinal, astfel încât nu este eficace în infecţiile candidozice sistemice.
Pot fi utile ketoconazolul sau amfotericina B. În infecţiile localizate este de preferat folosirea
unor medicamente antifungice topice locale. Trebuie reţinut: cel mai bun tratament este
reprezentat de eliminarea cauzei care a predispus la infecţie în cazul gazdei respective.
Profilaxie
Numărul de cazuri de candidoză înregistrate şi raportate la nivel naţional, în perioada 1998-

2006, a variat între 25.714 (1999) şi 40.990 (2002, incidenţă 188,10/0000). Care este motivaţia unui
număr semnificativ mai mare de cazuri în anul 2002 nu a explicat nimeni, până în prezent. În
ultimii 5 ani au fost raportate peste 30.000 de cazuri anual (peste 32.000/an în ultimii 3 ani). În
anul 2006 au fost înregistrate 32.520 cazuri, cu o incidenţă de 150,70/0000.
Cea mai importantă metodă de prevenire este evitarea interferenţei (negative) cu mecanismele
normale de apărare a gazdei, spre exemplu evitarea distrugerii florei normale prin utilizarea
judicioasă a antibioticelor şi în special a antibioticelor cu spectru larg.
134

Subiecte Micro

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Subiecte Micro

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

MICROBIOLOGIE

stud. Laura Stănescu

6. Constituție chimică și structură antigenică

B) Structuri Ag extracelulare produse de stafilococi

FACTORI DE PATOGENITATE ȘI PRINCIPALELE AFECȚIUNI PRODUSE

Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, cu următoarele etape:

3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic

Tratamentul unei stafilococii, în cazul în care este necesară antibioterapia, se va face

• S. agalactiae - flora normală a tractului genital feminin

6. Constituție chimică și structură antigenică

Alte structuri antigenice sunt reprezentate de către:

FACTORI DE PATOGENITATE ȘI PRINCIPALELE AFECȚIUNI PRODUSE

I. Diagnosticul de laborator bacteriologic, direct, în faringita streptococică.

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor

• Alte teste utilizate în identificare:

II. Diagnosticul de laborator serologic

2. Morfologie: coci Gram-pozitivi, alungiţi, lanceolaţi, dispuşi în general în diplo, încapsulaţi

5. Constituție chimică și structură antigenică

Alţi factori de patogenitate ar fi reprezentaţi de:

În majoritatea infecţiilor pneumococice există o fază iniţială bacteriemică, perioadă în

2. Examinarea microscopică a produsului patologic

3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic

1. Specii principale: N. meningitidis (meningococul) şi N. gonorrhoeae (gonococul), dar se pot

3. Morfologie - meningococul şi gonococul sunt diplococi Gram-negativi, reniformi, imobili,

- ambele microorganisme au nevoie medii de cultură îmbogăţite, necesităţile nutritive fiind

În cazul germenilor Gram-negativi, la nivelul membranei externe se găseşte lipopolizaharidul

Sunt prezente anumite plasmide implicate în rezistenţa la antibioticele beta-lactamice.

În cazul meningococului, imunitatea este asociată cu prezenţa serică a anticorpilor anti-

FACTORI DE PATOGENITATE ȘI PRINCIPALELE AFECȚIUNI PRODUSE

În cazul ambelor microorganisme, patogenitatea se datorează existenţei factorilor care

Infecţiile gonococice continuă să reprezinte o problemă importantă de sănătate publică inclusiv

DIAGNOSTIC DE LABORATOR - GONOREE

Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct) atât în gonoree cât şi în meningita

3. Cultivarea pe medii de cultură

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic

5. Antibiograma (testarea sensibilităţii tulpinilor izolate în vederea stabilirii tratamentului)

DIAGNOSTIC DE LABORATOR – MENINGITĂ MENINGOCOCICĂ

3. Cultivarea pe medii de cultură

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic

5. Antibiograma (testarea sensibilităţii tulpinilor izolate în vederea stabilirii tratamentului)

Familia Enterobacteriaceae cuprinde un număr foarte important de genuri şi specii de

Lipopolizaharidul (LPZ) caracteristic microorganismelor Gram-negative este format din:

- lipidul A, responsabil pentru activitatea toxică, format din unităţi dizaharidice de

Antigenul K se situează extern faţă de antigenul O, la bacteriile capsulate. Este un antigen

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR - COPROCULTURA

Gruparea agenţilor etiologici în funcţie de mecanismul patogenic

Examinarea materiilor fecale

Cultivarea materiilor fecale

E. coli se găsește în intestinul animalelor homeoterme, inclusiv al omului, fiind considerată

Ca şi în cazul celorlalte enterobacterii, diversele structuri antigenice situate la suprafața

FACTORI DE PATOGENITATE ȘI PRINCIPALELE AFECȚIUNI PRODUSE

Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu localizare digestivă

1. Recoltarea şi transportul produsului patologic

2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea preparatului nativ,

3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează în aşa fel încât să se

4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor

5. Antibiograma este recomandată de regulă numai pentru supravegherea apariţiei

Examinarea macroscopică şi microscopică a urinei

1. Specii principale: K. pneumoniae, K. ozaenae, K. rhinoscleromatis şi K. oxytoca

3. Morfologie: Klebsiella pneumoniae cuprinde bacili Gram-negativi, capsulaţi (capsula are

5. Caractere biochimice: pe mediile multitest germenii au următorul comportament