Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
1.Definiţie. Încadrare
Stafilococii sunt coci Gram-pozitivi aerobi, facultativ anaerobi, imobili, nesporulaţi, catalază-pozitivi.
Genul Staphylococcus cuprinde mai multe grupe de microorganisme de interes medical.
Unele dintre aceste grupuri includ mai multe specii.
S. aureus este şi specia recunoscută cel mai de mult (Rosenbach, 1884).
S. succinus este una dintre speciile recunoscute recent, dar se crede că ar avea o „existenţă” de milioane de ani.
Nr speciilor din acest gen = 35, însă numărul este şi mai mare dacă luăm în consideraţie şi subspeciile (de ex. S. aureus
subspecia aureus şi subspecia anaerobius).
Cele mai cunoscute specii sunt reprezentate de:
- S. aureus - reprezintă specia cel mai frecvent implicată în clinic
- S. epidermidis (produce un pigment alb) - sunt de obicei nepatogene
- S. saprophyticus (produce un pigment citrin) - sunt de obicei nepatogene
!!! Toţi stafilococii coagulazo-pozitivi sunt grupaţi ca S. aureus.
2. Caractere generale
2. 1. Habitat
S. aureus se poate multiplica la nivelul:
tegumentelor - în special în zonele piloase
mucoaselor - în special la nivelul vestibulului nazal
Factori care determină şi/sau influenţează starea de purtător pentru S. aureus:
o parte dintre aceşti factori sunt legaţi de apărarea la nivel de gazdă.
o parte sunt corelaţi cu anumite proprietăţi ale bacteriei ca:
- formarea de biofilm:
caracteristica tulpinilor care se pretează portajului nazal
facilitează supravieţuirea bacteriilor în contextul tratamentului antibiotic
facilitează evitarea mecanismelor de apărare specifice gazdei, care pot fi de tip peptide antimicrobiene precum:
- lizozimul,
- lactoferina,
- SLPI (secretory leukoprotease inhibitor),
- catelicidine,
- alfa şi beta defensine: beta defensina umană 3 (HBD-3) = cea mai eficientă dintre beta defensine în ceea
priveşte rolul în infecţiile cu S. aureus.
Deoarece unele studii arată că:
circa 20% dintre persoanele sănătoase sunt purtătoare în mod permanent de S. aureus
în circa alte 50-60% dintre cazuri este discutată situaţia portajului temporar
=> există un anumit grad de influenţă genetică privind starea de purtător de S. aureus.
2. 2. Caractere morfotinctoriale
Stafilococii sunt coci Gram-pozitivi
Diametrul de 0,6-1,5 microm
Pe frotiul realizat din cultură pe medii solide -> dispoziţie în grămezi neregulate.
În frotiurile realizate din culturi pe medii lichide sau din p.p -> dispunere în lanţuri scurte, perechi sau coci izolaţi.
În culturile cu o vechime >2 zile, stafilococii pot apărea ca şi Gram-variabil sau chiar şi Gram-negativi „la limită”.
2. 3. Caractere de cultură
Se dezvoltă în general pe medii de cultură obişnuite în 18-24 ore, la 35-37°C.
Coloniile au aspect de tip S, au diametrul cuprins între 1-3 mm şi sunt pigmentate în funcţie de specia izolată.
Pigmentarea devine mai pronunţată după menţinerea plăcii cu mediul de cultură încă 24-48 ore la temperatura camerei.
Pe mediul geloză-sânge, în jurul coloniilor poate apărea o zonă de hemoliză clară (β-hemoliză).
S. aureus poate produce mai multe tipuri de hemolizine.
Stafilococii se pot multiplica pe medii hiperclorurate, tolerând o concentraţie de 7-10% NaCl (ex mediul Chapman).
2. 4. Caractere biochimice
Stafilococii au un metabolism glucidic respirator + fermentativ.
Fermentează glucoza, manitolul, xiloza, lactoza, zaharoza etc. cu producere de acid.
Capacitatea de acidifiere a mediului conţinând manită este utilizată ca test de diferenţiere între S. aureus (manită-pozitiv)
şi SCN (manită-negativ).
Stafilococii sunt catalază-pozitivi !!!
c). Proteina A apare ca o componentă de suprafaţă la toate tulpinile de S. aureus (proteina Cowan).
o poate induce apariţia de anticorpi specifici => este imunogenă.
o interacţionează nespecific cu porţiunea Fc a Ig de la toate speciile de mamifere => o serie de efecte biologice:
- anafilaxie locală şi sistemică la animale,
- reacţii urticariene la om,
- activarea complementului pe calea clasică şi alternativă urmată de generarea de factori chemotactici,
- inhibarea activităţii opsonizante a Ac (prin competiţie cu receptorii pentru Fc de pe fagocite),
- proliferarea limfocitelor B umane etc.
o Proteina de suprafaţă A este unul dintre factorii determinanţi ai virulenţei şi ai formării de biofilm.
o Statusul de purtător nazal de S. aureus se asociază cu un nivel crescut al expresiei acestei proteine.
d). Coagulaza este factorul răspunzător de reacţia de aglutinare a majorităţii tulpinilor necapsulate de S. aureus când
sunt suspensionate în plasmă sau în soluţii de fibrinogen.
Coagulaza e legată la nivelul suprafeţei celulei bacteriene.
Acest factor poate fi prezent şi la circa 10% dintre tulpinile de S. intermedius.
În cazul în care în testul coagulazei pe lamă se foloseşte plasmă umană, rezultatul poate fi + şi pentru S. lugdunensis
şi S. schleiferi.
e). Adezinele sunt proteine de suprafaţă specifice, prin care stafilococii se fixează pe proteinele matriciale de la
suprafaţa celulelor gazdei (ex. laminină, fibronectină, elastină, colagen, proteina A etc).
Adezinele par a fi implicate în:
colonizarea matricei intercelulare,
invazia ţesuturilor
rezistenţa la fagocitoză.
c). Stafilococii pot produce o serie de hidrolaze cu structuri antigenice diferite, precum:
- stafilokinaza - determină liza cheagului (prin convertirea plasminogenului în plasmină) sub controlul unui material
genetic fagic;
- nucleaza (termonucleaza), cu activitate endo- şi exonucleazică asupra ADN şi ARN, generând 3'-nucleotide;
- diferite lipaze (contribuie la supravieţuirea stafilococului la nivel dermic) evidenţiabile prin:
opacifierea agarului cu gălbenuş de ou sau
scindarea substanţei Tween;;
- hialuronidaza;
- ureaza;
- diferite proteaze (serin protează, cistein protează, metaloprotează).
d). Se cunosc 4 hemolizine produse de stafilococi. O tulpină poate produce mai multe hemolizine.
Unele dintre hemolizine distrug şi alte celule => necroză locală şi pot avea efecte letale asupra animalelor de experienţă.
Principalele caractere ale hemolizinelor:
1. a-hemolizina (a-toxina):
principala hemolizină produsă de S. aureus.
= toxină producătoare de pori
se inseră la nivel membranar, creează canale => integritatea membrane este distrusă
are activitate maximă asupra hematiilor de iepure, dar hematiile de om nu sunt susceptibile.
induce modificări proinflamatorii în celulele mamiferelor
afectează trombocitele şi celulele umane în cultură
produce multe dintre semnele prezente în sepsis: hipotensiune + trombocitopenie
este dermonecrotică asupra animalul de experienţă (injectată local) şi are efect letal (injectată intravenos).
efectul ei principal este reprezentat de producerea de spasme ale muşchilor netezi vasculari
2. β-hemolizina e produsă de majoritatea stafilococilor identificaţi la animale, dar de 10-20% dintre cei umani.
Produce o hemoliză de tip „cald-rece“.
Este o sfingomielinază, activată de Mg2+, nu însă şi de Ca2+.
Efectul se exercită asupra hematiilor de oaie, om (acţionează pe sfingomielina hematiilor).
Este citotoxică pentru diferite culturi de celule
În doze mari, este toxică pentru animalele de experienţă
3. g-hemolizina = un complex de 2 proteine bazice care acţionează în cooperare.
Hematiile susceptibile sunt cele de iepure, oaie, om.
Efectul ei este inhibat de agar => nu are efect atunci când se utilizează plăci cu agar-sânge.
Acţiunea este inhibată de colesterol şi de alte lipide.
4. d-hemolizina este produsă de majoritatea tulpinilor umane de S. aureus.
Constă din agregate heterogene
Acţionează pe diferite celule (hematii, leucocite, celule de mamifere cultivate)
Nu are specificitate de specie.
e). Stafilococii pot produce o serie de exotoxine piretogene = un grup de toxine cu activităţi patogene, de ex:
cu efecte imunosupresoare,
cu un efect mitogen mai pronunţat la nivelul LTs (au capacitatea de a activa policlonal toate LT);
cresc toxicitatea endotoxinelor germenilor G- (blochează funcţia de clearance a sistemului reticuloendotelial);
produc eritrodermie prin mecanisme de hipersensibilitate de tip întârziat.
EFECTUL PIRETOGEN se realizează prin stimularea producerii de IL-1.
din acest grup fac parte exotoxinele piretogene A şi B + enterotoxinele stafilococice, din care TSST-1 =
cauza sindromului de şoc toxic stafilococic.
Circa 50% din tulpinile de S. aureus izolate produc una sau mai multe enterotoxine.
Aproximativ 15% produc TSST-1.
Mai rare sunt tulpinile care produc exotoxine piretogene A şi B.
f). Leucocidina este produsă de majoritatea tulpinilor de S. aureus şi acţionează numai asupra PMN, monocitelor şi
macrofagelor de om şi iepure.
Este dermonecrotică.
Tulpinile care produc L sunt associate cu apariţia furunculozei la om.
Are două componente, F şi S.
Componenta S se fixează pe receptorul pentru toxina holerică şi activează o fosfolipază legată de membrană.
Produşii fosfolipazei se fixează apoi pe componenta F, inducând un canal ionic pentru K+ => citoliză.
3) Bacteriocine
S. epidermidis produce epidermina (stafilococina) şi Pep5, care sunt lantibiotice.
S. gallinarum produce galidermina.
Aceste lantibiotice au efecte în special asupra bacteriilor G+, chiar şi asupra unor tulpini de stafilococi din altă specie
decât cea producătoare.
2. 7. Răspuns imun
Imunitatea postinfecţioasă este specifică faţă de:
produşii extracelulari (toxine, enzime)
antigenele legate de corpii bacterieni.
Titrul anticorpilor antistafilococici este scăzut (creşte, eventual, în cursul unor infecţii generalizate, dar nu
influenţează evoluţia spre vindecare) şi nu are utilitate practică în diagnostic.
S. aureus are posibilitea de a-şi modifica fenotipul, prezentându-se sub forma de SCV (small colony variants), pentru a
scăpa sistemului imun şi pentru a genera o infecţie cronică.
Tehnicile de persistenţă:
modificarea expresiei factorilor de virulenţă,
auxotrofismul (abilitatea unui m-o de a sintetiza un compus necesar procesului de creştere)
diversitate fenotipică = proces dinamic, fenotipurile SCV transformându-se rapid înapoi în fenotipurile sălbatice
complet virulente în momentul părăsirii localizării intracelulare.
2. 8. Caractere de patogenitate
S. aureus + o parte dintre SCN = microorganismelor condiţionat patogene.
S. aureus apare mai frecvent implicat în producerea unor infecţii, de obicei la nivelul tegumentelor şi
mucoaselor, însoţite de formarea de puroi cu potenţial de generalizare.
Tulpinile de S. aureus au capacitatea de a adera la mucoase, epitelii, endotelii, în special datorită prezenţei
acidului lipoteichoic, proteinei A şi altor adezine.
După aderare şi multiplicare, în cursul infecţiilor pot fi produse o serie de substanţe cu rol în patogenitate.
1. S. aureus este implicat ca agent etiologic într-o mare varietate de infecţii supurative (cu puroi):
infecţiile superficiale ale tegumentelor şi mucoaselor
panariţii,
furuncule,
abcese profunde,
infecţii ale diferitelor organe interne cu sau fără generalizarea infecţiei.
2. S. aureus produce și toxinoze (datorate în special toxinelor elaborate) = toxiinfecţiile alimentare, necroliza
toxică a epidermului, sindromul de şoc toxic etc.
Toxiinfecţiile alimentare - provocate de exotoxinele preformate, existente în alimente în care s-au multiplicat
stafilococi enterotoxigeni.
Simptomele principale sunt reprezentate de greţuri, crampe abdominale, vărsături, diaree care apar la 1-4/(1-6) ore
după ingestia alimentelor contaminate.
Se vindecă în general în ~24 de ore.
Alimentele sunt contaminate în general de către cei care le manipulează (de exemplu bucătarul prezintă un panariţiu).
Alimentele mai frecvent incriminate sunt cremele, brânza, îngheţata, carnea şi produsele din carne (pot constitui
adevărate medii de cultură pentru bacterii).
Enterotoxinele stafilococice sunt termostabile (rezistă 30 minute la 100°C), ceea ce impune păstrarea alimentelor
la frigider, înainte şi după preparare.
3. SCN sunt implicaţi în infecţii apărute după manevre medico-chirurgicale care penetrează bariera cutaneo-mucoasă
(cateterisme, implante, protezări intravasculare etc).
7. O infecţie gravă produsă de SCN este enterocolita postantibiotice a nou născutului (mai ales a prematurului,
situaţie în care administrarea necontrolată / abuzivă a antibioticelor poate produce disbacteriemii cu consecinţe grave).
În etiologia enterocolitei postantibiotice sunt recunoscute mai multe specii de stafilococi, S. aureus ocupând primul loc.
4. Diagnostic de laborator
Este doar bacteriologic (direct) şi respectă etapele clasice ale acestui tip de diagnostic.
▪ Antibiograma completează în mod necesar diagnosticul de laborator al unei infecţii stafilococice.
Pentru a discuta diagnosticul de laborator în infecţiile produse de stafilococi se aleg drept reprezentative infecţiile
purulente ale tegumentelor şi mucoaselor şi ne vom referi numai la Staphylococcus aureus.
Etape:
1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând o serie de reguli:
▪ cât mai aproape de debutul bolii,
▪ înainte ca pacientului să fi primit antibiotice,
▪ cât mai rapid şi corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de asepsie şi antisepsie etc.
În funcţie de maladia provocată se pot recolta următoarele produse patologice:
♤ secreţii purulente – de obicei (din foliculite, abcese, celulite, fistule, infecţii ale plăgilor şi arsurilor),
♤ lichide (de puncţie sinusală, otică, mastoidiană, articulară, peritoneală, pleurală, pericardică),
♤ exsudat nazal sau exsudat faringian,
♤ sânge, LCR, spută, urină,
♤ secreţie vaginală, tampoane vaginale, lichid de vomă, materii fecale, alimente,
♤ prelevate de pe suprafaţa cateterelor şi a inserţiilor iv. ale acestora.
În continuare vom discuta cazul în care p.p. este reprezentat de puroi.
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea a minim două frotiuri din p.p recoltat şi
transportat corespunzător, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) şi respectiv Gram.
Frotiurile se examinează la MO cu imersie şi se notează:
- prezenţa celulelor de la nivel tegumentar (eventual modificate faţă de normal), - prezenţa celulelor inflamatorii (ex.
leucocite, piocite)
- prezenţa cocilor Gram-pozitivi, cu diametrul de 0,6-1,5 mm, dispuşi în lanţuri scurte, perechi, izolaţi sau în
grămezi neregulate.
- cocii se pot situa intra sau extraleucocitar.
Se are în vedere locul de unde a fost recoltat p.p.:
● puroiul poate fi necontaminat, dacă se recoltează de ex. prin puncţie-aspirare dintr-o colecţie purulentă profundă
● foarte probabil contaminat cu floră de asociaţie dacă a fost recoltat dintr-o leziune superficială.
3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se realizează cât mai rapid (pentru a diminua riscul
modificărilor ce ar putea apărea în structura microbiană) şi în aşa fel încât să se poată obţine colonii izolate şi respectiv
o cultură pură, care se va identifica.
Stafilococii se dezvoltă în general pe medii de cultură obişnuite în 18-24 ore, la 35-37°C.
Coloniile:
~ au aspect de tip S, diametrul cuprins între 1-3 mm şi sunt pigmentate în funcţie de specia izolată.
Pe mediul geloză-sânge, în jurul coloniilor poate apărea o zonă de hemoliză clară.
Stafilococii se pot multiplica pe medii hiperclorurate, tolerând o concentraţie de 7-10% NaCl (ex. mediul Chapman)
– folosit în cazul în care produsul este recoltat de la nivel nazal (existând certitudinea că produsul conţine mai multe
specii de microorganisme).
Caractere antigenice: Pentru diferențierea S. aureus de SCN se pot utiliza teste comerciale care includ
fibrinogen şi IgG care cuplează coagulaza legată şi proteina A (tehnici de aglutinare indirectă).
Caractere de patogenitate:
Trebuie efectuat testul coagulazei; factorul care produce coagularea pe lamă poate fi prezent la ~10% dintre
tulpinile de S. intermedius.
În cazul în care în testul coagulazei pe lamă se foloseşte plasmă umană, rezultatul poate fi pozitiv pentru S.
lugdunensis şi S. schleiferi.
Pentru identificarea exotoxinelor se poate utiliza o tehnică de tip ELISA.
Alte caractere / teste utilizate în identificare: Se pot utiliza (în centre de referinţă) teste care se bazează
pe proprietăţi fenotipice moleculare (studiul acizilor graşi celulari, al unor enzime sau al unor polipeptide totale) sau
genotipice (fragmente de restricţie ale materialului genetic, hibridarea moleculară etc.).
S-au dezvoltat tehnici rapide utilizând truse de identificare pentru evidenţierea:
□ unor elemente ale peretelui celular (proteina A, coagulaza legată),
□ a enzimelor elaborate în aliment sau lichidul de hemocultură (testul pentru termonuclează)
□ a toxinelor (enterotoxine, TSST1, exfoliatine).
Există metode care utilizează markeri moleculari pentru:
evidenţierea prezenţei MRSA (stafilococ rezistent la meticilină, de ex. amplificarea genică, PCR pentru
gena mecA, dar şi pentru genele femA, femB)
diferenţierea S. aureus de SCN. => tehnica PCR utilizată pentru identificarea S. aureus rezistent la meticilină,
direct în produsul patologic.
5. Antibiograma (testarea sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice în vederea stabilirii tratamentului) este
obligatorie şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice.
În cazul unor infecţii grave trebuie să fie însoţită de alte determinări. Pentru a identifica tulpinile rezistente la
meticilină (MRSA) se poate detecta prezenţa genei mecA (după amplificare genică, prin PCR).
5. Tratament
Multe persoane sunt purtătoare de stafilococi la nivel tegumentar, nazal sau faringian. Chiar dacă stafilococii ar
fi eliminaţi complet de la nivelul vestibulului nazal, recolonizarea s-ar produce foarte rapid.
Totuşi, în anumite situaţii (ex. pacienţi supuşi dializei peritoneale sau hemodializei, pacienţi infectaţi cu HIV sau la
personalul medical care lucrează de ex. în secţii de arşi) încercarea de eliminare a stării de purtător are justificare.
Se poate utiliza tratamentul local cu mupirocină.
Este se studiază utilizarea lizostafinei (o enzimă litică produsă de o tulpină de S. simulans - atacă lanţurile de
peptidoglican ai S. aureus).
Tratamentul unei stafilococii, în cazul în care este necesară antibioterapia, se va face conform antibiogramei.
Dacă un stafilococ este sensibil la penicilină (majoritatea tulpinilor au devenit rezistente, dar nu toate), atunci
tratamentul ar trebui să includă acest antibiotic. Procentul tulpinilor sensibile la penicilină este de circa 5%.
Ab β-lactamice se leagă de penicillin binding-proteins PBPs = transpeptidazele care catalizează ultima etapă în
formarea peretelui bacterian. S aureus produce 4 PBPs.
Stafilococii reprezintă unele dintre primele m-o pentru care s-a descris rezistența la antibiotice.
Rezistenţa la penicilină a S. aureus e datorată şi producerii de o β-lactamază, care degradează inelul β-
lactamic, inactivând medicamentul.
În majoritatea studiilor, 70-90% dintre tulpinile de S. aureus produc β-lactamază.
Datorită rezistenței la penicilină au fost produse peniciline rezistente la acțiunea β-lactamazelor (penicilinele M – de la
”meticilină”), de ex. oxacilina, cloxacilina și derivații acestora.
Rezistenţa la meticilină (prima penicilină sintetică, stabilă la β-lactamază) a apărut în doar un an de la introducerea
sa în practică. MRSA rezistă la toate Ab cu nucleu β-lactam (peniciline, cefalosporine, carbapeneme).
Utilizându-se diferite antibiotice (inclusiv a „penicilinelor penicinilazo-rezistente“), s-au selectat tulpini rezistente la
meticilină, oxacilină, tetraciclină, cloramfenicol, macrolide, aminoglicozide etc.
Medicamentul de elecţie pentru MRSA = vancomicina = > MRSA răspunde potențial la tratamentul cu vancomicină.
Până la sfârşitul sec XX, vancomicina = tratamentul de elecţie al infecţiilor cu S. aureus rezistent.
Au fost raportate tulpini stafilococice intermediare sau rezistente la vancomicină.
În privinţa sensibilităţii/rezistenţei la vancomicină există 3 variante de S. aureus :
S. aureus cu un nivel intermediar de rezistenţă la vancomicină (VISA),
S. aureus cu hetero-rezistenţă la vancomicină (hVISA) şi
S. aureus rezistent la vancomicină (VRSA).
Opţiunile de tratament în infecţiile cu VRSA sunt limitate.
O clasă de antimicrobiene care poate fi utilizată în tratamentul VRSA este reprezentată de streptogramine
(pristinamicina, virginiamicina, etamycin).
S. aureus rezistent la streptogramina B se poate trata cu lincosamide, dacă tulpina nu este rezistentă și la acestea.
Elemente esenţiale în tratament:
- Drenajul colecţiei purulente – drenajul are o importanţă extrem de mare !!!
- Eliminarea ţesuturilor necrotice,
- Eliminarea corpilor străini şi
- Administrarea medicamentelor antimicrobiene.
Stafilococul auriu:
Sensibil la: VANCOMICINĂ, LINEZOLID
Intermediar la: TEICOPLANIN
Rezistent la: Oxa, Cipro, Genta, Meropenem, Imipenem, Cefuroxim, Lovofloxacin.
6. Epidemiologie
7. Profilaxie
Prevenirea transmiterii infecţiei are la bază metodele de igienă, asepsie şi antisepsie. În spital, secţiile cu risc sunt
cele de neonatologie, terapie intensivă, sălile operatorii şi saloanele unde se află pacienţi cu cancer aflaţi sub
chimioterapie / sau cu alte cauze de imunodepresie.
În aceste situaţii, personalul medical trebuie investigat prin metode de laborator.
Este de preferat ca persoanele purtătoare de stafilococi coagulază-pozitivi să nu aibă acces în aceste incinte şi să nu
aibă contact direct cu pacienţii în cauză.
Utilizarea substanţelor antiseptice şi încercarea de eradicare cu ajutorul antibioticelor a portajului nazal (ex.
lizostafină, mupirocină) ar putea fi utile.
Utilizarea vaccinului stafilococic poate să amelioreze starea clinică în anumite situaţii, de ex. la pacienţi care necesită
hemodializă, prezenţa de catetere etc.
La nivel internaţional (EU) nu există un vaccin stafilococic care să fi primit autorizaţie de utilizare.
În ţara noastră vaccinul stafilococic produs de INCDMI ”Cantacuzino” a avut autorizație de utilizare până în anul
2010.
8. Direcţii de cercetare
Printre metodele de detecţie directă a rezistenţei la meticilină a S. aureus se numără şi testele de latex aglutinare.
Se propune efectuarea acestui test de latex aglutinare (pe mediu de tip geloză-sânge) prin utilizarea unei proteine
de legare a penicilinei (Penicillin Binding Protein 2a).
Acest test (PBP-LA) şi-a demonstrat o sensibilitate şi o specificitate, doar cu puţin mai scăzute faţă de sensibilitatea şi
specificitatea efectuării tehnicii PCR.
Dintre avantajele utilizării acestei metode menţionăm:
obţinerea de rezultate rapide,
tehnică uşor de utilizat,
preţuri scăzute ale reactivilor utilizaţi.
În vederea creşterii sensibilităţii testului, acesta poate fi utilizat în combinaţie cu alte teste de identificare rapidă,
precum: DNA-aza termostabilă, API Rapidec, şi FISH (peptide nucleic acid-fluorescence in situ hybridization).