INGINERIA GENETICA SI BIOTEHNOLOGIILE MODERNE Ingineria genetica reprezinta un ansamblu de tehnici de modificare a structurii genetice a unui organism prin

n introducerea de gene noi apartinand unui organism din aceeasi specie sau din specii diferite, prin inserarea de gene sintetizate artificial sau prin reorganizarea materialului genetic propriu. Ingineria genetica reprezinta instrumentul principal cu ajutorul caruia biotehnologiile se perfectioneaza in continuu. Cele mai cunoscute si des utilizate procedee sau tehnologii de inginerie genetica sunt urmatoarele: a. tehnologia ADN recombinat (tehnologia clonarii genelor); b. hibridarea celulara; c. transferul de gene mediat de microcelule; d. transferul de gene mediat de cromozomi; e. transferul de gene mediat de ADN; In principal tehnologiile de inginerie genetica permit atat extragerea si purificarea genelor din diferite organisme, cat si transferul lor de la un organism donor la unul acceptor. Interesul stiintific, industrial si medical al acestor tehnologii este considerabil. Exista astazi posibilitatea de a utiliza, la nivel industrial, capacitatea genelor de a dirija sinteza unor produse de mare valoare: enzime, hormoni, efectori celulari, imunomodulatori, factori sanguini [32, 38,44].

Elementele constitutive ale tehnologiei ADN Recombinat

1. PREZENTAREA ELEMETELOR CONSTITUTIVE Tehnologia ADN recombinat se bazeaza, in principal, pe utilizarea urmatoarelor elemente constitutive: I. Un set de enzime care intervin in metabolismul acizilor nucleici, in general, si in mod special in tehnologia ADN recombinat. In particular, doua tipuri de enzime sunt esentiale pentru obtinerea de ADN recombinat : endonucleaze de restrictie si ADN ligaze. II. Vectorul de clonare (vehiculul) este o structura alcatuita din ADN, care poate fi acceptata intr-un organism gazda si care are capacitatea de a se replica autonom. Prin insertia genelor de interes in vehicul, acesta realizeaza transferul genelor de la un organism la altul. III. Gena de interes reprezinta un fragment de ADN ce cuprinde secventa de nucleotide corespunzatoare produsului polipeptidic a carui sinteza se urmareste. Gena de interes, dupa insertia in vector, este clonata odata cu acesta. IV. Receptorul este reprezentat, de regula, de celule bacteriene care au rolul de a accepta ADN recombinat, asigurand exprimarea genelor, respectiv sinteza unui produs specific, in cantitati proportionale cu ritmul de diviziune a celulei [50, 96]. 2. ENZIMELE DIN TEHNOLOGIA ADN RECOMBINAT In tehnologia ADN recombinat un rol cu totul deosebit il are un set de enzime care au facut obiectul unor decenii de cercetare privind metabolismul acizilor nucleici. In tabelul nr.2.I sunt prezentate enzimele care intervin in metabolismul acizilor nucleici si care sunt adevarate instrumente de cercetare in acest domeniu. Dintre enzimele prezentate in tabelul nr.2.I, in mod particular, doua tipuri de enzime stau la baza metodei generale de a izola si propaga o molecula de ADN recombinat. 1

Tabelul 2.I Enzimele folosite in tehnologia ADN recombinat Enzima Endonucleaze de restrictie de tip II ADN ligaze ADN polimeraza I (E.coli) Reverstranscriptaza Polinucleotid kinaza Transferaza terminala Exonucleaza III Bacteriofag exonucleaza Fosfataza alcalina Functia (Activitatea) scindeaza ADN in secvente ce contin baze specifice leaga doua molecule de ADN sau doua fragmente de ADN foloseste in procesul de replicare semiconservativa a ADN sintetizeaza o copie ADN pe matrita de ARN fosforileaza unele lanturi polinucleotidice transfera un homopolimer la gruparea 3-OH finala din structura duplexului linear scindeaza nucleotide reziduale din pozitia 3 finala a uneia din catenele de ADN scindeaza nucleotide din pozitia 5 terminala din ADN bicatenar eliberand catena la pozitia 3 finala scindeaza fosfatul terminal din fiecare capat 5 sau 3 terminal din amandoua catenele

In primul rand, endonucleazele de restrictie scindeaza (taie) molecula de ADN cand recunosc anumite secvente specifice pentru a genera un set de fragmente de ADN mai mici. In al doilea rand, fragmentul de ADN de clonat este izolat si legat de alt fragment de ADN care este vectorul de clonare folosindu-se ADN ligaze. Vectorul recombinat este apoi introdus intr-o celula gazda care il cloneaza pe masura ce celula trece prin numeroase generatii de diviziune celulara. 3. VECTORII DE CLONARE IN TEHNOLOGIA ADN RECOMBINAT 3.1.CARACTERISTICI GENERALE ALE VECTORULUI DE CLONARE Vectorul de clonare (vehiculul) reprezinta un element extracromozomial capabil sa se multiplice si sa exprime o gena straina atasata de el in vitro, independent de cromozomul celulei gazda. Operatia prin care o plasmida este convertita intr-un vector de clonare genica se numeste constructia vectorului. Vectorul trebuie sa posede o serie de proprietati esentiale de care se tine seama in alegerea si constructia lui: Capacitatea de a se replica rapid si intr-un numar cat mai mare de copii in celula gazda (30-50 copii/celula); Dimensiune cat mai redusa (pentru a facilita patrunderea in celula gazda); Capacitate cat mai ridicata de acceptare (vehiculare) a unei gene straine; Sa nu contina in structura sa gene generatoare de efecte nedorite ( de exemplu, gene inductoare de tumori); Sa posede cel putin un marker genetic (de exemplu, gena rezistentei la anumite antibiotice) care sa permita selectia celulelor ce contin ADN recombinat; In tehnologia ADN recombinat se folosesc mai multe tipuri de vectori de clonare: plasmide, bacteriofagi, cosmide si chiar cromozomi . 2

3.2. ETAPELE TEHNOLOGIEI ADN RECOMBINAT Tehnologia ADN recombinat implica parcurgerea unor etape esentiale care sunt prezente in continuare. I. Obtinerea in vitro a unei plasmide himerice Aceasta etapa presupune utilizarea unor metode specifice de pregatire atat a vectorului cat si a genei de interes in vederea inserarii genei in vehicul. Vectorul de clonare este izolat prin metode specifice si apoi clivat intr-un singur loc cu o enzima de restrictie ( aceeasi endonucleaza folosita la izolarea genei). Clivarea produce deschiderea vectorului (plasmidei) care este transformat dintr-o molecula circulara intr-o molecula liniara, avand doua capete ce pot interactiona cu gena. Gena de interes este izolata cu ajutorul enzimelor de restrictie sau sintetizata prin una din metodele descrise mai sus. Vectorul si gena astfel pregatite se asociaza spontan in vitro pe baza complementaritatii capetelor coezive. Prin interventia unei ADN ligaze se restabileste continuitatea structurala covalenta prin formarea de legaturi fosfodiesterice intre fragmentele de ADN. Rezultatul este obtinerea unei plasmide himere, o structura circulara bicatenara in care este inserata gena de interes. Eficienta cuplarii genei de vector poate fi marita prin modificari structurale ale vectorului si/sau genei, ca de exemplu:defosforilarea vectorului, sinteza de capete coezive pe plasmida si pe fragmentul ADN de inserat, atasarea de linkeri. II.Patrunderea vectorului in celula gazda Aceasta etapa consta in introducerea ADN recombinat in celula gazda, urmata de exprimarea lui independenta de cromozomul celular. Problema patrunderii vectorului este in general rezolvata prin permeabilizarea artificiala a membranei celulei receptoare. In cazul utilizarii E.Coli, cultivarea in prezenta de CaCl 2 precum si socul termic de scurta durata ( 30 secunde la 42 C) determina celulele sa intre intr-o stare de competenta care permite acceptarea moleculelor de ADN strain. In cazul celulelor care poseda un perete celular este necesar ca acesta sa fie inlaturat cu enzime litice. O alta posibilitate este utilizarea de lipozomi in care se incorporeaza ADN strain. III. Selectia clonei de interes Exista mai multe metode pentru identificarea coloniei (clonei) de lecule care a acceptat vectorul himeric in urma experientei de transformare. Una dintre acestea consta in utilizarea plasmidelor purtatoare de gene care confera rezistenta la antibiotice si a bacteriilor gazda sensibile la antibiotice. De exemplu, se poate utiliza plasmida continand gene pentru rezistenta la ampicilina (A R) si la tetraciclina (T R) cu situsul de restrictie aflat in interiorul genei T R. Dupa transformare, cultivand bacteriile pe un mediu de ampiclina, vor creste numai bacteriile care au acceptat plasmida. Cultivarea mai departe a acestor colonii pe un mediu continand tetraciclina va impiedica cresterea celulelor continand fragmentul de ADN strain a carui inserare la nivelul genei T R din plasmida inactiveaza aceasta gena. Prin recuperarea coloniilor sensibile la tetraciclina se constituie o banca. Etapa urmatoare consta in selectionarea dintre diferitele colonii ale bancii a celei care poarta gena de interes. Pentru aceasta exista metode variate. Astfel, daca gena de interesse exprima in mod normal in celula gazda, se pot utiliza celule deficiente pentru aceasta gena si identifica celulele care redobandesc aceasta functie prin introducerea genei lipsa. Daca gena nu exista in mod natural in celula gazda, prezenta ei poate fi reperata prin sinteza produsului specific de activitate a genei.

Multe metode sunt insa bazate pe utilizarea sondelor moleculare, ca de exemplu ARNm codat de gena de interes, marcat radioactiv. Coloniile continand segmente de ADN neidentificate sunt transferate pe filtre speciale (nitroceluloza) care au proprietatea de a fixa ADN. Celulele sunt lizate in situ, ADN denaturat si filtrele sunt plasate in contact cu o solutie continand ARNm. Daca o colonie contine plasmide asociate genei corespunzatoare, ARNm se ataseaza de ADN genei si colonia astfel marcata este vizualizata prin autoradiografie (tehnica hibridizarii acizilor nucleici). 3.3. PRODUSELE TEHNOLOGIEI ADN RECOMBINAT In mod normal, clonarea unei gene reprezinta numai primul pas intr-un proiect mai complex de obtinere de proteine biotech. O gena clonata poate fi folosita pentru a genera proteine codificate de ea, in cantitati mari. Secventa de aminoacizi a proteinei poate fi modificata operand schimbari de baze in gena; aceasta strategie permite verificarea anumitor ipoteze privind structura si functia proteinei. Metode din ce in ce mai sofisticate de transport de ADN in interiorul si in afara celulelor de toate tipurile au deschis drumuri noi pentru studierea functiei si reglarii genelor si permit introducerea de noi trasaturi la animale si plante [16,51]. Intelegerea metabolismului acizilor nucleici, a metabolismului proteic si a reglarii lor in Escherichia coli a facut posibila exprimarea genelor clonate pentru a studia proteinele produse de ele. Deoarece multe gene eucariote nu au promotorii necesari pentru exprimarea lor in E.coli, trebuie inserate secvente de reglare de origine bacteriana pentru transcriere si traducere, in anumite pozitii specifice in vectorul ADN fata de gena eucariota insasi. In unele cazuri, genele clonate sunt exprimate atat de bine incat apare o supraproductie a proteinei respective, uneori reprezentand 10% sau mai mult din productia totala de proteine celulare. O concentratie atat de mare de proteine poate distruge o celula de E.coli, in aceste cazuri exprimarea genelor trebuie limitata la numai cateva ore inainte de recoltarea celulelor. Vectorii de clonare care au semnalele de transcriptie si de traducere necesare pentru exprimarea reglata a unei gene clonate sunt numiti vectori de expresie. Au fost construiti multi vectori de expresie cu situsuri de restrictie specifice oentru clonare plasate langa un promotor bine cunoscut ( cum este de exemplu promotrolul lac din E.Coli) si elementele de reglare. Structura unei proteine poate fi schimbata prin modificarea secventei de ADN a genei clonate pentru acea proteina. Unul sau mai multi aminoacizi specifici pot fi inlocuiti prin mutageneza directionata, ceea ce reprezinta una din metodele de varf pentru studierea structurii si functiei proteinei [105]. 4. PROCEDEE DE OBTINERE A INSULINEI PRIN INGINERIE GENETICA Tinand cont de complexitatea sintezei insulinei in pancreas, obtinerea insulinei umane cu ajutorul bacteriilor reprezinta intr-adevar o realizare deosebita. Trebuie precizat ca insulina produsa de bacteriile modificate este absolut identica cu insulina umana pancreatica. Exista in momentul de fata doua procedee de obtinere a insulinei umane cu ajutorul bacteriilor modificate prin tehnologia clonarii genelor. Primul se bazeaza pe clonarea genelor corespunzatoare catenelor A si B ale insulinei, sintetizate chimic, iar al doilea pe clonarea ADNc corespunzator proinsulinei. In ambele cazuri, clonarea se face in bacteria E.coli. A. Obtinerea insulinei prin ADN recombinat construit din genele sintetizate chimic Din structura insulinei mature s-a dedus structura genelor corespunzatoare in baza echivalentelor dictate de codul genetic. In acest fel s-a stabilit ca pentru catena A a insulinei sunt necesare 63 de nucleotide inlantuite in mod specific, iar pentru catena B 90 de nucleotide cuplate. Proiectul sintezei celor doua gene a mai 4

prevazut atasarea la capetele lor a unor nucleotide care sa asigure, pe de o parte, cuplarea corecta a genelor de vector si, pe de alta parte, prezenta semnalelor necesare pentru pornirea si oprirea exacta a transcrierii genelor [50, 73, 74]. Pentru cuplarea corecta s-a prevazut adaugarea a 12 nucleotide, dintre care 6 asigura jumatate din situsul enzimei de restrictie EcoRI, iar celelalte 6 nucleotide jumatate din situsul enzimei de restrictie BamHI (figura nr.3.6). La randul ei, pornirea este realizata de codonul ATG plasat la inceputul genei intre situsul enzimei EcoRI si gena structurala; oprirea transcrierii este asigurata de doi codoni (TAA si TAG) plasati intre capatul genei structurale si situsul enzimei de restrictie BamHI. Gena A a fost obtinuta din 12 oligodeoxinucleotide sintetizate chimic prin metoda fosfotriesterilor, iar gena B a fost obtinuta din 18 oligodeoxinucleotide diferite sintetizate prin aceasi metoda chimica. Cele doua gene corespunzatoare catenelor A si B ale insulinei mature au fost apoi inserate independent de cate un vector de clonare genetica prevazut cu elementele de control ale operonului lac. Moleculele de ADN recombinat rezultate au fost utilizate pentru transformarea celulelor de E.coli. In celulele transformate ADN recombinat se replica. Sub controlul elementelor de reglaj ale operonului lac se sintetizeaza complexul -galactozidaza-catena A a insulinei in celulele transformate cu ADN recombinat continand gena A si complexul -galactozidaza-catena B in celulele transformate cu ADN recombinat continand gena B a ainsulinei. In final, cele doua catene ale insulinei sunt detasate de -galactozidaza cu ajutorul unui reactiv chimic (BrCN) care actioneaza asupra metioninei situata exact la locul de jonctiune dintre cele doua componente [73.96]. Dupa purificare, cele doua catene se amesteca si, prin simpla oxidare cu aer, ele se cupleaza prin legaturi disulfurice, dand nastere insulinei, care este identica atat structural cat si functional cu insulina umana. In figura nr.3.6 sunt prezentate schematic etapele principale privind obtinerea insulinei umane cu ajutorul tehnologiei ADN recombinat folosind genele catenelor A si B sintetizate chimic. B. Obtinerea insulinei prin ADN recombinat continand gena pentru proinsulina Acest procedeu are la baza construirea unor plasmide care sa contina secventele (genele) care codifica proinsulina sub forma de ADNc. Acest ADNc se poate sintetiza in vitro din ARNm pentru proinsulina izolat din celulele beta din insulele Langerhans ale pancreasului. ARNm se izoleaza din aceste celule, se purifica prin cromatografie pe oligo-dT-celuloza si este apoi utilizat la sinteza de ADNc cu ajutorul reverstranscriptazei. La inceputul lantului de ADNc se ataseaza codonul ATG (sintetizat chimic) corespunzator metioninei. In acest fel are loc marcarea pentru ADNc si se asigura si delimitarea galactozidazei de proinsulina, ceea ce usureaza procesul de purificare a proinsulinei prin tratarea cu BrCN. ADNc astfel pregatit este apoi cuplat cu vectorul plasmidic prevazut cu elementele de control ale operonului lac continand o mica parte din gena structurala a galactozidazei. ADN recombinat rezultat este utilizat pentru transformarea bacteriilor E.coli. Celulele transformate produc o proteina compusa prin -galactozidaza si proinsulina. Aceasta, tratata cu BrCN, elibereaza proinsulina, care apoi este convertita in insulina matura pe cale enzimatica (figura nr.3.7) [51,96]. Avantajele insulinei umane obtinuta prin ADN recombinat fata de insulina izolata din pancreasul animal sunt: nu induce afectiuni oculare (retinopatie) si renale (nefropatie), nu provoaca alergii (fata de 5% alergii la insulina animala), are un grad inalt de puritate, se poate obtine prin orice cantitate, productia nu este dependenta de abatoare, care sunt aprovizionate discontinuu, iar testele clinice au stabilit ca insulina umana obtinuta prin inginerie genetica este mai activa decat insulina umana.

5.FORMULARI FARMACEUTICE ALE INSULINEI UMANE RECOMBINATE 5.1.FORMULARI FARMACEUTICE ALE INSULINEI SUB FORMA DE PREPARATE SOLUBILE CU ACTIUNE RAPIDA La inceput produsele cu insulina solubila au fost formulate in solutii de pH acid care din punct de vedere chimic deveneau instabile. In aceste formulari vechi a fost identificat un proces de dezamidare considerabil la nivelul asparaginazei din pozitia 21 a lantului A si a fost observata pierderea activitatii biologice pe parcursul unei conservari prelungite in conditii de pH acid. Eforturile facute pentru a ameliora stabilitatea chimica a acestor formulari solubile a dus la conceperea solutiilor neutre, stabilizate cu zinc. In formularile simple (normale) neutre, insulina este stabilizata chimic prin adaugarea de zinc (~0.4%) si conservanti fenolici. Cuplarea acestor excipienti mareste stabilitatea insulinei prin inducerea formarii unor structuri hexamerice specifice. Formularile normale (simple) neutre numite INSULINA REGULAR prezinta o activitate maxima a insulinei dupa 2-3 ore, cu o durata maxima de 6-8 ore. Ca si in cazul altor formulari, variatiile intervenite in relatia timp-actiune pot fi atribuite factorilor urmatori: doza, locul injectarii, temperatura si activitatea fizica a pacientului. In pofida starii solubile a insulinei, in aceste formulari s-a observat o intarziere a declansarii actiunii. Aceasta intarziere a fost atribuita timpului necesar hexamerului pentru a disocia in dimeri si/ sau monomeri inaintea absorbtiei prin membrane biologice. Aceasta disociere necesita difuziunea conservantului si a insulinei de la locul de injectare, diluarea efectiva a proteinei si deplasarea echilibrului de la hexameri la dimeri si monomeri (figura nr. 3.8). Au fost elaborati analogi monomerici ai insulinei in scopul obtinerii unui raspuns mai natural la cresterile post-prandiale ale concentratiei glucozei. Elaborarea analogilor monomerici ai insulinei pentru tratamentul diabetului zaharat (diabetes mellitus) dependent de insulina s-a facut cu scopul evitarii proprietatii de autoasociere a insulinei si deci de a reduce intarzierea intervenita in relatia timp-actiune. A fost elaborat un asemenea analog monomeric, INSULINA LISPRO care prezinta un profil mai rapid al relatiei actiune-timp, avand o activitate maxima dupa aproximativ o ora . In afara formularilor rapide mentionate mai inainte, fabricantii au conceput formulari solubile care sa fie utilizate in pompe externe sau implantate. In majoritatea privintelor, aceste formulari sunt foarte asemanatoare cu INSULINA REGULAR (simpla sau normala in cea ce priveste starea de asociere hexamerica, conservantul si zincul); cu toate acestea in formularile respective pot fi inclusi: agenti de tamponare si/sau surfactanti pentru a reduce agregarea fizica a insulinei care poate determina astuparea tubului pompei. In sistemele de pompare mai vechi s-a folosit pentru pompele externe o tubulatura permeabila la gaz. In consecinta s-a incorporat in formulare un agent de tamponare in scopul de a reduce modificarile de pH provocate de dioxidul de carbon dizolvat, care ar putea duce la precipitarea insulinei. Progresele facute in domeniul formularilor au dus la rezolvarea acestei probleme. 5.2. FORMULARI FARMACEUTICE ALE INSULINEI CU ACTIUNE INTERMEDIARA Exista doua tipuri de preparate de insulina cu actiune intermediara: INSULINA NPH si INSULINA LENTE.

Initialele NPH se refere la Neutral Protamine Hagedorn, nume care vine de la inventatorul acestui preparat de insulina H.C.Hagedorn si este o suspensie cristalina neutra care este preparata prin co-cristalizarea insulinei cu protamina. Ambele formulari permit obtinerea unor profile prelungite privind relatia timp-actiune prin faptul ca necesita dizolvarea unei forme precipitate si/ sau cristaline a insulinei. Aceasta dizolvare este considerata a fi faza sau treapta care limiteaza viteza de biodiponibilitate a insulinelor cu actiune intermediara si lunga. In consecinta, profilul timp-actiune al formularilor este prelungit prin intarzierea ulterioara a disocierii hexamerului in dimeri si monomeri. Protamina reprezinta un grup de proteine cu caracter bazic puternic, grup de substante strans inrudite care sunt obtinute din sperma de peste. In general, protamina este caracterizata printr-un numar de aproximativ 30 aminoacizi, dintre care arginina este in proportie de 65-70% [16,20]. Folosind metodologiile de cristalizare propuse de Krayenbhl si Rosenberg se pot prepara in mod corespunzator, din protamina si cristale de insulina, cristale de INSULINA NPH de forma tetragonala cu volume curpinse intre 1 si 20 mm. Astfel aceste formulari au concentratii foarte mici de insulina solubila si protamina. Conditia la care in solutie nu mai exista protamina sau insulina masurabila, dupa cristalizare, este denumita ca fiind punctul de isophane. De aceea INSULINA NPH se mai numeste INSULINA ISOPHANE. INSULINA NPH are o declansare a actiunii cuprinsa intre1-2 ore, o activitate maxima cuprinsa intre 6-12 ore si o durata a activitatii de 18-24 ore. Ca si in cazul altor formulari, variatiile observate la relatia timp-actiune sunt datorate unor factori cum ar fi : doza, locul injectarii, temperetura si activitatea fizica a pacientului. INSULINA NPH poate fi amestecata usor cu INSULINA REGULAR fie ex tempore, de catre pacient, fie in forma in care se obtine de la fabricant, respectiv sub forma unei formulari preamestecate. Insulina preamestecata, de exemplu NPH/REGULAR in raportul 70/30 sau 50/50, ofera pacientului o ameliorare a exactitatii la dozare si, in consecinta, o ameliorare a controlului glicemiei. Au fost solutionate si controversele privind imunogenitatea la protamina. Astfel, pacientii care au prezentat sensibilitate la protamina in cazul formularilor NPH au fost trecuti pe tratament cu preparate de INSULINA LENTE sau INSULINA ULTRALENTE pentru a se putea controla concentratiile bazale ale glucozei. INSULINA LENTE este o suspensie de zinc-insulina care a fost conceputa pentru o singura injectie zilnica. Ea este un amestec constituit din doua forme insolubile de insulina, 70% cristale romboedrice de zinc-insulina (componenta ultralente) si 30% particule de insulina amorfa (componenta semilente). Formularea aceasta este un preparat neutru care contine tampon pe baza de acetat si un exces de zinc. Surplusul de zinc se leaga la suprafata hexamerului insulinei, reducand astfel solubilitatea insulinei si, in felul acesta, se produce o incetinire a profilului timp-actiune. Volumul componentei cristaline ultralente este cuprins in mod obisnuit intre 200 si 1 000 mm. INSULINA LENTE are o declansare a actiunii dupa 1-3 ore, activitatea maxima este intre 6-12 ore si durata actiunii revine la 18-24 ore. Ca si in cazul altor formulari, variatiile observate in ceea ce priveste profilul timp-actiune sunt datorate unor factori cum ar fi: doza, locul injectarii, temperatura si activitatea fizica a pacientului. Capacitate de amestecare a INSULINA LENTE cu INSULINA REGULAR este limitata la amestecurile ex tempore care sunt utilizate imediat dupa preparare. 5.3.FORMULARI FARMACEUTICE ALE INSULINEI CU ACTIUNE PRELUNGITA

In mod curent singura insulina cu actiune prelungita disponibila este INSULINA ULTRALENTE, care este o suspensie de insulina cristalizata. Cristalele au fost identificate ca fiind romboedrice cu un volum cuprins intre 200 si 1 000 mm. Formularea contine un agent de tamponare cu valoare neutra a pH-ului si un surplus de zinc. INSULINA ULTRALENTE are o declansare a actiunii la 4-6 ore, o activitate maxima curpinsa intre 8-20 ore si o durata actiunii situata intre 24-48 ore. Ca si celelalte formulari, variatiile profilului timp-actiune sunt datorate unor factori cum ar fi: doza, locul injectarii, temperatura, activitatea fizica a pacientului. Amestecarea preparatului INSULINA ULTRALENTE cu INSULINA REGULAR este limitata la amestecarea ex tempore si utilizarea imediata.