UTILIZAREA CIPURILOR „MICROARRAY” ÎN

FARMACOGENETICĂ: NOI PERSPECTIVE

PENTRU INDIVIDUALIZAREA TERAPIEI
MEDICAMENTOASE
 FARMACOGENETICA
 Fiecare individ este diferit
în ceea ce priveşte
răspunsul la tratamentul
medicamentos
 Medicina începutului
mileniului III va dezvolta
terapia individualizată,
care se va “mula” pe
constelaţia genetică
unică a fiecărui individ.
 FARMACOGENETICA
 Farmacogenetica studiază variaţiile interindividuale
ale enzimelor implicate în metabolizarea
medicamentelor, ale receptorilor şi transportorilor.
 Diferenţele înregistrate printre subiecţii umani normali,
în ceea ce priveşte eficacitatea unor agenţi terapeutici şi
riscul pentru manifestarea unei stări de toxicitate sunt
cauzate de existenţa mai multor alele care codifică
enzime deosebite prin activitatea lor metabolică. Aceste
constituţii sunt denumite polimorfisme genetice.
Efectul polimorfismelor enzimelor, transportatorilor
şi receptorilor asupra răspunsului la droguri

 Variaţia individuală a răspunsului la

medicamente este o problemă clinică
deosebit de importantă
 Variaţiile individuale pot merge de la
absenţa răspunsului la un agent
farmacologic până la apariţia de reacţii
adverse
 Un studiu din Marea Britanie sugerează că
una din cinsprezece spitalizări sunt datorate
reacţiilor adverse medicamentoase
FARMACOGENOMICA
 Finalizarea după anul 2000 a Proiectului
Genomul Uman a dus la lărgirea bruscă a
ariei de investigaţie a farmacogeneticii -
studiile implicând întregul genom uman
dând naştere farmacogenomicii.
 Farmacogenomica reprezintă aplicarea
conceptelor şi tehnologiilor genomicii în
studiul acţiunii şi metabolizării
medicamentelor;
 ea urmăreşte analiza locilor implicaţi în
metabolizarea medicamentelor cu scopul
identificării alelelor care afectează
eficacitatea medicamentelor sau determină
o reacţie adversă la un anumit medicament.
 FARMACOGENOMICA
 Arii de cercetare
specifice
farmacogenomicii:
– Identificarea genelor
responsabile pentru
variabilitatea
răspunsului la
medicamente
– Analiza locilor polimorfi
– Cipurile genice
“microarray”
 FARMACOGENOMICA
 Analiza locilor polimorfi
– Polimorfismele sunt în general definite ca variaţi ale secvenţei ADN
prezente la peste 1% din populaţie.
– Majoritatea polimorfismelor implică modificarea unui singur nucleotid –
single nucleotid polimorphism (SNPs).
– Întrucât genomul uman conţine circa 3 miliarde de nucleotide, iar
variaţiile între indivizi apar cu o frecvenţă de 1/300 de perechi de baze,
putem deduce că există în jur de 10 milioane SNPs.
– Doar 1% dintre acestea au, probabil, consecinţe funcţionale; ca urmare,
doi indivizi umani diferă unul de celălalt din punct de vedere genetic prin
circa 100 000 de situsuri polimorfe.
 Tehnologia microarray
 Utilizând metodele tradiţionale de analiză
a expresiei genică, cercetătorii pot studia
un număr mic de gene pe analiză.
 Cipurile genice “microarray”
– Această nouă tehnologie permite
scanarea întregului genom uman
pentru polimorfismele relevante cu
ajutorul unor microcipuri genice.
– Se pot determina, în mod simultan,
mai multe mii de polimorfisme pentru
un singur pacient.
 Tehnologia microarray
 Tehnologia microarray este utilizată pentru:
– înţelegerea proceselor fundamentale ale
creşterii şi dezvoltării,
– explorarea cauzelor genetice ale bolilor umane
– în farmacogenetică pentru identificarea
polimorfismenlor genetice responsabile pentru
răspunsul individual la medicamente şi pentru
crearea de noi medicamente.
 Un cip microarray poate fi definit ca
un test de analiză a expresiei genice
care constă dintr-un suport solid sau
semisolid pe care sunt dispuse într-
un mod regulat probe ale mai multor
gene.
 Suportul poate fi:
– material solid neporos (sticlă) tratată cu silan
la care sunt ataşate grupări aminice,
aldehidice sau epoxi pentru a lega stabil
moleculele de ADN, ARN etc.
– microfiltre de nylon, nitroceluloză
– geluri cu silicon
– diverse membrane artificiale polimerice
 •Probele sunt dispuse pe suport cu
ajutorul unor printere robotizate
ultrarapide, printr-un procedeu de
blotare ink-jet, fotolitografică sau
electochimică.
 Probele pot fi compuse din:
•Diametrul punctelor dispuse pe
– ADN, suport nu trebuie sa fie mai mare
– ADNc, de 200 microni (peste 300 microni
– ARN, tehnologia se numeşte
macroarray)
– oligonucleotide,
– Oligopeptide, proteine
(imunoglobuline)
– sau chiar alte substanţe organice
(chemical compound microarray ) pentru
descoperirea de noi medicamente.
 Probe ADNc
Probe oligonucleotidice sau
oligopeptidice
 Principiul tehnologiei
microarray

 Tehnologia microarray a fost

creată pe principiul hibridizării
utilizând molecule de ADN
marcate fluorescent capabile
să identifice molecule
complementare de ADNc sau
ARNm.
 După hibridizare cipul se
plasează într-un scanner
special compus din câteva
lasere, un microscop special
şi o cameră de luat vederi.
 Punctele fluorescente sunt excitate de
razele laser iar microscopul şi camera
de luat vederi vor crea o imagine
digitală a cipului ;
 datele sunt stocate şi analizate de un
computer care are instalat un
program special de calculare a ratei
de fluorescenţă roşu/verde şi de
analiză a intensităţii fiecărui spot de
pe imaginea digitală a cipului.
 Codul culorilor pentru cipurile
microarray
 Fiecare spot al cipului reprezintă o anumită
genă; fiecare culoare reprezintă ADN-ul
extras din ţesutul sănătos (controlul) sau
proba de ADN extrasă din ţesutul de
cercetat (proba).
 În funcţie de tipul de cip utilizat localizarea
şi intensitatea fiecărei culori precizează
nivelul de expresie (prezenţa/absenţa) unei
gene (sau a mutantei sale) în probele de
ADN (5).
– Verdele: ADN-ul control, adică ADN-ul (sau
ADNc) provenit din ţesutul normal care a
hibridizat cu ADN-ul ţintă.
– Roşu: ADN-ul probă, adică ADN-ul (sau
ADNc) provenit din ţesutul de cercetat care
a hibridizat cu ADN-ul ţintă.
– Galben: o combinaţie de ADN probă şi
control care a hibridizat în mod egal cu
ADN-ul ţintă.
– Negru: spoturile unde ADN-ul control sau
probă nu au hibridizat cu ADN-ul de control.
 TIPURI DE CIPURI
MICROARRAY
Tipul de cip Aplicaţii
microarray
Cipuri cipuri de lasificarea tumorilor, evaluarea riscului,
hibridizare genomică prezicerea prognosticului
comparativă (CGH)
Cipuri de analiză a Dezvoltarea de noi medicamente,
expresiei genice evaluarea răspunsului la medicamente,
dezvoltarea terapeuticii medicamentoase

Cipuri de analiză a Dezvoltarea de noi medicamente,

mutaţiilor/SNPs evaluarea răspunsului la medicamente,
dezvoltarea terapeuticii medicamentoase,
urmărirea evoluţiei bolilor
Cu ajutorul unui cip care conţine mai multe probe ADN se poate determina, într-
un singur experiment nivelul de expresie a sute sau chiar mii de gene a unei celule
prin măsurarea cantităţii de ARNm legat de fiecare probă a cipului
 Cipurile genice “microarray”

 Asemenea studii de asociere la nivelul

întregului genom sunt deja utilzate pentru a
detecta genele de susceptibilitate în unel boli,
cum ar fi astmul sau cancerul de prostată.
 Scanarea întregului genom poate fi utilizată în
acelaşi mod pentru a determina genele
implicate în răspunsul la medicamente, chiar şi
în cazul în care nu se cunoaşte mecanismul de
acţiune al acelui medicament.
 Compania franceză Genset foloseşte în mod
curent cipuri cu 60 000 de markeri SNPs,
suficienţi pentru o scanare completă a
genomului, în cazul testării clinice a
medicamentului.
Tehnologia microcipurilor
 Microcipurile pot servi şi pentru a determina
modelul de expresie a genelor (proteom) într-
un ţesut ţintă, ceea ce contribuie la
demonstrarea mecanismelor de acţiune a unui
agent farmacologic în context genomic;
 de asemenea, pot defini diferenţele
interindividuale în răspunsul la medicamente
la nivelul diferitelor ţesuturi.
 Caracterizarea din punct de vedere
transcripţional a unui ţesut este foarte utilă în
cancere, deoarece din biopsii pot fi extrase
probe de ARNm care pot ghida alegerea unei
chimioterapii adecvate, eficiente, dar cu o
toxicitate scăzută.
 Tendinţe şi promisiuni
 Căile de dezvoltare care se întrevăd în viitorul apropiat sunt :
– stabilirea unor profiluri farmacogenetice personale prin
identificarea genotipurilor individuale ale pacienţilor;
– testarea farmacogenentică va reduce în mod substanţial
necesitatea spitalizării şi a costurilor sale datorată reacţiilor
adverse medicamentoase, producerea de noi medicamente pentru
pacienţii cu genotipuri specifice (“stratificarea medicamentelor”)
 Testarea farmacogenetică ar putea fi primul exemplu al aplicării anlizei
ADN la nivel populaţional, dar mai este încă o cale lungă până la
apariţia unor kituri farmacogenetice disponibile pentru medicii curanţi
în vederea identificării medicamentelor la care este sensibil un anumit
pacient.
 S-ar putea ca peste nu mulţi ani să fie considerat lipsit de etică
administra anumite medicamente fără a fi testat în prealabil profilul
farmacogenetic.
 Tendinţe şi promisiuni
 În ultimii ani, genotiparea şi analiza
funcţională au intrat în practica
curentă a celor mai mari centre de
tratament al cancerului (ex. Mayo
Clinic).
 Probabil, în viitorul apropiat, se va
extinde scanarea întregului genom şi
genotiparea de la nivelul testelor
populaţionale la nivel clinic.
 Tot în viitorul apropiat, noile
medicamente vor fi create din start
astfel încât să nu producă reacţii
adverse populaţiilor umane care
prezintă polimorfisme genetice bine
definite.
 Limite
 Cel mai important obstacol este reprezentat de
complexitea genomului uman care presupune
implicarea unor mecanisme poligenice în răspunsul la
medicamente;
 Mai mult, deşi răspunsul la medicamente este
determinat poligenic, fiecare din aceste gene poate
prezenta mai multe polimorfisme răspândite în
populaţia generală
 Diferenţele etnice adaugă şi alte obstacole: modelele
de predicţie a profilurilor SNPs variază larg la nivel
populaţional, ceea ce pledează pentru studiile pe
populaţii stratificate din punct de vedre genetic.
 Limite
 Deşi tehnologiile genomice evoluează foarte rapid nu
putem prezice dacă acest ritm de dezvoltare se va menţine
în următorii ani (vezi cazul terapiei genice).
 Un ultim obstacol îl reprezintă problemele etice:
– deţinerea de informaţie asupra constelaţiei genetice a unui
individ pune accente importante pe termenii de « privat şi
securitate», precum şi dileme etice în legătură cu
prognosticul unei boli şi alegerea tratamentului adecvat.
– Divulgarea informaţiilor legate de susceptibilitatea la boală
pot bulversa viaţa unui individ, atât din punct de vedere
psihic cât şi material (prime de asigurare mai mari pentru
sănătate).
– Legiferarea modalităţilor de testare genetică a indivizilor şi
de aplicare a farmacogenomicii în practica clinică va provoca
dezbateri aprinse în parlamente, dezbateri a căror rezultat
nu poate fi încă prevăzut.
 Concluzii
 Cunoaşterea variaţiilor interindividuale ale
enzimelor, receptorilor şi transportorilor are o
importanţă deosebită, atât pentru eficacitatea
tratamentului medicamentos, cât mai ales, pentru
prevenirea apariţiei de reacţii adverse
 În cercetarea farmacogenetică, tehnologia
microarray permite scanarea întregului genom
uman pentru polimorfismele relevante ale
răspunsului individual la medicamente.
 Considerăm că tehnologia microarray este una
dintre cele mai importante descoperiri recente
din genetica moleculară cu aplicabilitate
deosebită în farmacogenetică.