CURS 7

INGINERIE GENETICA
 Ingineria genetica
• Ansamblul de tehnici realizate in vitro cu gene,
cromozomi sau celule intregi.
• Inginerie genetica celulara = fuziunea de
protoplasti
• Inginerie genetica moleculara = tehnologia
ADN recombinant
 Ingineria genetica
• Modelul cel mai utilizat la bacterii: E coli
• Implica:
- Vectori de clonare: care duc in celula gazda
gena sau secventa de interes
- secventa de interes = ADN heterolog
- endonucleaze de restrictie: care permit
introducerea ADN-ului in vector
- ADN-ligaze
 Endonucleaze de restrictie
• Sistemele de restricţie şi modificare (metilare) au fost
descoperite în urma analizei interacţiilor bacteriofag-
bacterie.
• ADN-ul fagic eliberat de o anumită tulpină bacteriană
poate infecta cu succes bacterii care aparţin aceleiaşi
tulpini, deoarece prezintă acelaşi model de modificare ca
şi ADN-ul gazdei.
• În cazul în care fagii menţinuţi pe o anumită tulpină
bacteriană sunt transferaţi pe alta, ADN-ul fagic este
atacat de enzimele de restricţie ale noii gazde:
bacteriofagul este restricţionat la o tulpină bacteriană.
 Endonucleaze de restrictie
• Endonucleazele de restricţie sunt enzime care recunosc secvenţe de
ADN specifice, scurte, se leaga de ele apoi le de cliveaza, fie la situsul
de recunoastere, fie la o distanţă oarecare de acesta, în funcţie de tipul
de enzimă.
• Nomenclatura: cod de 3 litere, prima litera semnificând genul, iar
celelalte 2 specia bacteriană de la care a fost izolată enzima (Eco –
Escherichia coli); în unele cazuri, o a patra literă-indică tulpina bacteriană
(ex: EcoR )
• 3 categorii: Tipul I, Tipul II şi Tipul III.
• Tipurile I şi III constau în enzime care au atât funcţii de restricţie cât şi
funcţii de modificare; ambele tipuri recunosc secvenţe specifice,
nemetilate, de ADN dc; enzimele de tip I clivează ADN-ul într-o manieră
randomizată (situs-nespecific), pe când cele de tip III taie la situsuri
specifice
• Sistemele de tip II constau în enzime separate care îndeplinesc funcţiile
de metilare, respectiv, restricţie.
 Endonucleaze de restrictie
• EcoRI recunoaşte o secvenţa hexanucleotidică:
5’-G-A-A-T-T-C-3’ 5’-G-3’ 5’-A-A-T-T-C-3’
3’-C-T-T-A-A-G-5’ 3’-C-T-T-A-A-5’ 3’-G-5’
 Vectori de clonare
Clasificare
1. posibilitatea studierii exprimării fragmentelor de ADN heterolog:
vectori de clonare şi vectori de exprimare
2. tehnica de clonare folosită: vectori de clonare inserţională - ADN
heterolog este clonat prin inserţie la un situs unic de restricţie din
vector şi vectori de clonare prin inlocuire (substituţie) - ADN clonat
inlocuieşte un fragment din vector, în urma digestiei cu 2
endonucleaze de restricţie.
3. structura şi modul de funcţionare:
- vectori plasmidiali (sunt derivaţi din, şi au structură de plasmide)
- vectori virali (sunt derivaţi din, şi au structura de genom viral)
-vectori hibrizi - fagimide (au structură hibridă, de genom de fag
filamentos şi de plasmid) şi cosmide (au structură hibridă, de genom
de fag λ şi de plasmid).
 Plasmidele ca vectori de clonare
Plasmidele sunt definite ca fiind repliconi neesenţiali, capabili să se
replice fizic independent de cromozom şi transmişi în formă
extracromosomală, pe verticală (de la o generaţie de indivizi la alta)
sau pe orizontală (de la un individ la altul în cadrul aceleiaşi
generaţii).
Principalele categorii de gene codificate de plasmide
- gene de rezistenţă la antibiotice
- gene de toleranţă la metale grele
- gene de rezistenţă la agenţi intercalanţi, radiaţii UV, radiaţii X,
bacteriofagi, bacteriocine
- gene ce codifică antibiotice
- gene fixatoare de azot
- gene ce codifică enzime proteolitice, amilolitice etc
 Plasmidele ca vectori de clonare
Clasificare
• 1. structura moleculara:
- plasmide circulare: ADN d.c. circular, iar forma in vivo pare sa fie CCC
(“circular covalently closed”); foarte rar şi temporar se întâlneşte forma
CO (“circular open”), în care una din cele două catene nu este continuă
având o legătură fosfodierica lipsă.
- plasmide lineare: cu telomere hair-pin si cu telomere de tip invertroni
• 2. criteriul autotransferabilităţii
- plasmide conjugative
- plasmide non-conjugative
- plasmide mobilizabile
• 3. criteriul numărului de copii plasmidiale
- plasmide ce se găsesc în număr mare de copii per celulă, 10- sute; (“high-
copy”)
- plasmide ce se găsesc în număr mic de copii per celulă, între 1-10
(plasmide “low-copy”).
 Plasmidele ca vectori de clonare
Pentru a putea fi folosite ca vectori de clonare, plasmidele necesită o serie
de caracteristici:
• a) Să nu conţină gene tra, deci să nu genereze proces de conjugare
bacteriană à nu fie autotransmisibile. Această caracteristică este
esenţială atât, pentru diversele etape de cercetare, cât şi pentru
securitatea cercetătorului (foarte mulţi vectori de clonare plasmidiali
prezintă ca markeri de selectie gene de rezistentă la antibiotice, iar dacă
vectorii ar fi autotransferabili ar exista/creşte riscul ca gene de
antibiorezistentă să ajungă în diverse microorganisme patogene).
• b) Să conţină situsuri unice pentru un număr cât mai mare de
endonucleaze de restricţie (la acest nivel se efectuează insertia ADN
heterolog).
• c) Situsul de inserţie să nu fie localizat în genele implicate în replicarea
şi partiţia plasmidului.
• d) Să prezinte markeri genetici absenţi în celula receptoare
• e) Să aiba o greutate moleculară mică àuşor de izolat şi de manipulat
• f) Să prezinte cât mai multe copii per celulă
 Vectori plasmidiali

- primul plasmid natural folosit în

experimente de clonare genetică este
plasmidul Col E1 de la Escherichia coli
- greutate moleculară de 4.6 x 106 Da,
- este neconjugativ, produce colicina E1 şi
conferă gazdei imunitate la această colicină
- selecţia celulelor transformate de E coli
(care au primit plasmidul) pe baza acestui
marker (imunitatea la colicina) este o tehnică
dificilă
- contine si gene mob care îi conferă
capacitatea de transfer à riscul diseminarii
necontrolate a plasmidului Col E1 recombinat

Ulterior, au fost folosite alte plasmide naturale - pSC101 şi pRS2124 - care, datorită
genei de rezistenţă la tetraciclină şi, respectiv, rezistenţă la ampicilină, permit o
selecţie mai uşoară a transformanţilor.
 Vectori plasmidiali
pUC 18/19 sunt vectori doar de clonare,
nepermiţând şi exprimarea ADN clonat.
-au o dimensiune de 2.69 kb.
Aceşti vectori au 2 tipuri de markeri
genetici:
gena Apr - caracter pe care se bazează
selecţia iniţială (screeningul) a celulelor ce
poartă vector;
gena lacZ′- este o genă defectivă ce
exprimă doar capătul NH2-terminal al β-
galactozidazei; Această genă incompletă
este capabilă de complementaţie intra-
alelică cu o altă formă defectivă a genei
lacZ (ce codifică capătul COOH-terminal al
β-galactozidazei) dintr-o gazdă bacteriană
adecvată. În urma procesului de
complementaţie, tulpina bacteriană
defectivă dar purtătoare a vectorului
nerecombinat este capabilă să refacă
integral β-galactozidaza.
 pUC 18/19
Sub inducţia IPTG (isopropil-tio-β−D-galactosid, care este un inductor al genei
lacZ), o asemenea tulpină formează colonii albastre pe un mediu ce
contine X-gal (5-Br-4-Cl-3-indolil-β−D-galactosid).
Inserţia unui ADN heterolog în situsul de policlonare (PCS, MCS) - care este
inclus în promotorul lui lacZ′ - determină imposibilitatea exprimării genei
lacZ′ şi, ca atare, gena lacZ defectivă din cromosomul gazdei nu mai este
complementată de cea din vectorul recombinat şi, ca urmare, nu se mai
formează β-galactozidaza activă care să scindeze complexul X-gal cu
formarea compusului indolic albastru. Coloniile ce poarta vectorul
recombinat au culoarea albă. Este cea mai folosită variantă histochimică
de selectie a clonelor recombinate.
!!!!!!! colonii albastre = celule ce poartă vector nerecombinat;
colonii albe = celule ce poartă vector recombinat
 pUC 18/19
Strategia de clonare în vectorii pUC18/19 şi derivaţii săi
• a – Inserţia ADN heterolog în PCS prin digestia vectorului şi a ADN
heterolog cu aceeaşi endonuclează de restricţie (sau cu enzime
izoschizomere), amestecarea fragmentelor şi, respectiv, adăugarea
unei ADN-ligaze;
• b - Introducerea vectorului recombinat în tulpini bacteriene adecvate
(au pe cromosom o gena lacZ defectivă ce complementează gena
lacZ′ .
• Selectarea clonelor celulare cu vector recombinat se realizeaza în 2
etape:
• 1 - cultivare pe mediu cu Ap şi screeningul clonelor ce poartă vector
(Apr)
• 2 - cultivarea acestor clone celulare pe mediu cu IPTG şi X-gal şi
selecţia coloniilor ce poartă vector recombinat (= colonii albe)