Introducere

Conceptul de bibliotec colecie de clone

ADN dintr-o celul, esut sau organism 3 categorii de biblioteci 1.genomice alctuite din ADN-ul genomic total al unui organism 2.ADNc colecia de clone obinute pe baza ADN complementar 3. Cromozomiale specifice fiecrui cromozom n parte

1.Biblioteci genomice
O bibliotec genomic conine toate
secvenele prezente n genomul unui organism. Procedura cuprinde 5 etape: pregtirea ADN-ului fragmentarea ADN-ului pregtirea vectorului ligaturarea i introducerea n gazd amplificarea

 bibliotec genomic - util pentru a gsi o

gen de interes prin screening cu sonde specifice.

Bibliotecile genomice se obin prin 2 tehnici:

1. ADN genomic este digerat complet cu o enzim de restricie, iar fragmentele rezultate sunt clonate fie printr-un vector derivat din bacteriofagul , fie ntr-un vector cosmidic.

 Cosmidele - vectori hibrizi ce conin ADN

plasmidial i situsul cos din genomul fagului .

Prezentnd secvena din plasmidul EcoRI i

gena de rezistenla ampicilin (Ampr), cosmidele se pot replica i mentine n celula bacterian n forma plasmidial i permit selecia transformanilor pe mediu cu ampicilin

2. O alt cale este digestia parial cu ER, care recunosc secvene de 4 pb. Prin digestie parial doar o parte din SR este tiat de ER.

2.Biblioteci de ADNc
Colecia de clone obinute pe baza ADN complementar se numete bibliotec ADNc. Din bibliotecile de ADNc se produc copii ADN din secvene ARN (ARNm) care apoi se cloneaz

Extrem de utile: nu reprezint doar colectarea de

secvene exprimate, ci i pe acele secvene de dup orice modificare post-transcripional depunerea ntr-o baz de date - etape de caracterizare a genomului unui organism

Secvenierea parial a unei colecii mari de ADNc ,

Fiind sintetizat pe matria moleculelor de ARNm, ADNc va corespunde numai genelor aflate n stare de activitate transcripional, reproducnd doar genele funcionale specifice celulei respective. ADNc este clonat n vectori plasmidici sau n vectori derivai din bacteriofagul . Spre deosebire de fragmentele obinute prin digestie cu ER, moleculele de ADNc nu posed capete adezive, de aceea pentru introducerea n vector, la moleculele de ADNc se adaug adaptori care conin capete adezive.

Alegerea vectorului Niciunul din vectorii derivai din fagul nu este adecvat pentru toate experimentele de clonare molecular Este necesar alegerea vectorului cel mai adecvat scopului urmrit

Trebuie luai n considerare 3 factori:

enzima (enzimele) de restricie folosite dimensiunea fragmentului de ADN ce va fi clonat dac vectorul va fi folosit i pentru exprimarea ADN n E.coli

3.Biblioteci cromozomiale
Dimensiunea genomului uman este att de mare, nct sunt necesare mii de clone pentru a reprezenta ntregul genom. pentru om sunt necesare 24 de biblioteci diferite dac o gen este localizat pe un cromozom cunoscut cu metode genetice, cercetarea va fi limitat la biblioteca acelui cromozom.

izolarea cromozomilor este posibil datorit dimensiunii i morfologiei diferite ale cromozomilor, care pot fi separai cu ajutorul citometriei n flux. n prezent sunt disponibile biblioteci preparate din toi cromozomii umani.

Sortarea cromozomilor
gena de interes poate fi cartografiat la un cromozom particular separarea cromozomilor PFGE(pulsed field gel electrophoresis), dar pentru clonare se utilizeaz aparatul cu fluorescena cromozomii trebuie s fie n metafaza sunt izolai, apoi colorai cu EtBr i condui printr-un cmp electric la un fascicul laser care duce apoi la fluorescen

 cantitatea de fluorescen se msoar cu un detector iar filtrul utilizat identific cromozomii particulari aplicarea unui cmp electric ntre plcile de deflecie prin care cromozomii vor trece, permite devierea i colectarea lor dup colectarea unei cantiti suficiente, pot fi deproteinizai i utilizai pentru prepararea bibliotecilor cromozomiale

Microdisecia - dac o gen a fost cartografiat la un cromozom particular, se utilizeaz microdisectia pentru a obine materialul corespunztor - cromozomii colorai sunt examinai la microscop si sunt mutai cu ajutorul unui micromanipulator - materialul este apoi colectat n pipete i utlizat pentru clonri ulterioare