MODALITĂȚI DE OBTINERE A

MOLECULELOR DE ADN
RECOMBINANT
Obținerea organismelor recombinate presupune
parcurgerea următoarelor etape:
1. izolarea genelor naturale sau sinteza chimică a unor molecule de
ADN ce codifică proteinele dorite sau a căror funcție urmează a fi
identificată;
2. selecţia unui vehicul sau vector adecvat care să transporte
secvențele respective şi apt să se replice autonom în celula
receptoare;
3. inserţia fragmentelor de ADN străin în structura genetică a moleculei
vector şi obţinerea unei himere moleculare;
4. introducerea acesteia într-o gazdă specifică şi transformarea
genetică a acesteia;
5. asigurarea condiţiilor care permit exprimarea informaţiei străine
(transcrierea și/sau traducerea informației genetice noi) în celula
acceptoare;
6. selectarea celulelor modificate genetic din populaţia celulară
rezultată prin multiplicare;
7. evidenţierea produsului genei în celulele modificate sau în mediul de
cultură al acestora şi purificarea lui pentru a fi folosit în scopurile
pentru care s-au realizat tehnicile respective.
Obţinerea fragmentelor de ADN ce servesc pentru
clonare se poate realiza pe mai multe căi:
– izolarea genelor din ADN natural cu ajutorul
enzimelor de restricţie
– izolarea şi amplificarea genelor prin tehnologia PCR
– sinteza enzimatică a ADN dublu catenar
complementar (ADNc)
– sinteza chimică a genei.
Vectorii de clonare sunt molecule de ADN obţinute „in vitro” care
permit integrarea unui fragment de ADN de interes la nivelul unui situs
specific, de obicei un „situs multiplu de clonare” (MCS), molecula
rezultată putând fi introdusă într-o gazdă specifică unde se multiplică
generând un număr mare de clone de ADN recombinant.
Caracteristicile generale ale vectorilor de clonare sunt:
- replicare autonomă în celula gazdă (secvența ori)
- să prezinte markeri genetici selectabili (
- să aibă mai multe situsuri unice de clivare cu enzime de restricţie
- să aibă o greutate moleculară mică şi să prezinte cât mai multe copii
per celulă
- să fie uşor de purificat
- să conţină secvenţe specifice de ADN care să permită selecţia
rapidă a clonelor recombinate)
Clonarea moleculară reprezintă procesul de
construire a unor molecule de ADN hibride
(himere) prin inserţie de informaţie genetică străină
într-un vector (vehicul) adecvat, capabil să se
replice independent. Hibridul molecular respectiv
este utilizat pentru a transforma celulele bacteriilor
receptoare (de exemplu, Escherichia coli, gazda
obişnuită a experimentelor de clonare).
Pentru integrarea fragmentelor de ADN străin în
vector se pot folosi mai multe variante
experimentale, ce presupun sau nu prelucrarea "in
vitro" a fragmentului de ADN dorit, după care se
realizează legarea covalentă a acestor fragmente
cu ajutorul ADN-ligazelor.
 1. Metoda legării extremităților coezive ale
fragmentelor de restricție de interes și ale
vectorului de clonare

• Modalitatea cea mai simplă de incorporare este aceea

care utilizează fragmentele obţinute cu ajutorul
enzimelor de restricţie de tipul II, care clivează ADN la
situsuri specifice palindromice, producând capete
monocatenare complementare.
• Fragmentul de ADN util pentru clonare poate fi obținut
prin digestia enzimatică a ADN genomic (sau plasmidial
în anumite cazuri) fie totală fie parțială. In primul caz,
toate situsurile de recunoaștere pentru enzima de
restricție folosită sunt clivate, iar în a doua situație sunt
clivate, la întâmplare, doar o parte dintre respectivele
situsuri, astfel că fragmentele rezultate au dimensiuni
mai mari comparativ cu cele rezultate prin digestie totală
Utilizând aceeaşi enzimă de restricţie
atât pentru clivarea ADN exogen cât şi
a vectorului de clonare, se pot obţine
molecule hibride indiferent de
provenienţa ADN de interes, datorită
extremităţilor monocatenare
complementare identice. Unirea iniţială
a segmentelor de restricţie se face pe
bază de complementaritate, prin
formarea legăturilor de hidrogen la
nivelul capetelor monocatenare, după
care amestecul se tratează cu ligază,
de obicei de fag T4, care reuneşte
covalent moleculele respective
In anumite experimente, pentru
obținerea ADN de interes sunt
folosite două enzime de restricție
care produc, preferabil extremități
monocatenare complementare
(ceea ce asigură obținerea unei
gene complete sau a unei
fragment din aceasta – de
exemplu secvența promotor). In
acest caz, și vectorul de clonare
trebuie clivat cu aceleași enzime
de restricție, iar pentru realizarea
vectorului recombinat se folosește
ADN ligaza.
• Transformarea bacteriilor gazdă se poate face direct cu
amestec de fragmente de restricţie fără a utiliza ligaza de
fag T4, refacerea legăturilor fosfodiesterice fiind produsă de
ligaza endogenă, specifică celulei transformate. În acest
sistem de ligare "in vivo" a moleculelor, proporţia de celule
transformate ce conţin molecule hibride este, de
aproximativ 1000 ori, mai mică comparativ cu sistemul care
utilizează ligarea "in vitro".
• Eficienţa de obţinere a moleculelor hibride poate fi mărită
prin tratarea cu fosfatază alcalină a vectorului linearizat.
Acest tratament determină îndepărtarea grupărilor 5' P
terminale de la nivelul vectorului linearizat, prevenindu-se
recircularizarea şi formarea dimerilor plasmidiali. În acest
caz, circularizarea vectorului se produce numai prin inserţia
ADN exogen netratat cu fosfatază alcalină, care va furniza
capătul 5' fosfat necesar ligazei, la nivelul fiecărei legături.
Cu toate acestea, la fiecare joncţiune rămâne câte o catenă
nelegată, refacerea legăturilor fosfodiesterice fiind realizată
în final de sistemele specifice (reparatorii) ale gazdei
 2. Metoda legării fragmentelor de ADN ce
prezintă extremități homopolimere
O altă metodă utilizată frecvent în experimentele de clonare moleculară este cea a
adăugării de extremităţi homopolimere complementare la secvenţele de ADN
de origine diferită. Această metodă permite inserţia fragmentelor de ADN tăiate
drept, fără extremităţi monocatenare complementare, produse de anumite enzime
de restricţie (Hae III, Hind II), într-un vector de clonare corespunzător.

In cazul unor fragmente diferite de ADN cu capete netede (necoezive), pentru

refacerea legăturilor fosfodiesterice se poate utiliza direct ligaza de fag T4 care are
capacitatea de a uni asemenea molecule, dar eficienţa de legare este scăzută.

Tehnica adăugării de capete homopolimere complementare se bazează pe

proprietatea unei enzime, terminal-deoxinucleotidil transferaza, izolată din timus de
viţel, de a extinde extremităţile 3'OH ale ADN, prin adăugarea progresivă de
dezoxiribonucleotide (dNTP). Enzima poate forma o catenă homopolimeră sau
"coadă" cu o lungime definită, la ambele extremităţi 3'OH ale unui ADN dublu
catenar complementar (sintetizat pe baza ARNm). Dacă asemenea extremităţi
complementare se produc şi la capetele unei plasmide linearizate, prin amestecul
lor se pot obţine molecule recombinante, stabile. Formarea acestor molecule
recombinante nu este dependentă de legarea enzimatică a celor două componente
 3. Metoda utilizării linkerilor și adaptorilor
• O altă metodă, larg utilizată în ultimii ani, este aceea a folosirii
moleculelor linker pentru unirea segmentelor de ADN lipsite de
extremităţi coezive, indiferent de modul cum au fost obţinute.
• Linkerii, comercializaţi într-o gamă foarte variată de tipuri, sunt
oligonucleotide sintetice, dublucatenare, cu capete drepte cu
secvenţe, în general, palindromice, care corespund situsurilor de
recunoaştere ale unor enzime de restricţie. După legarea lor la
extremităţile moleculelor de ADN tăiate drept (de exemplu obținute
prin acțiunea enzime SmaI), ele se reunesc cu ajutorul ligazei de fag
T4 în structuri bicatenare, cu secvenţe simetrice, care reconstituie
situsul de recunoaştere al unei enzime de restricţie (de exemplu,
BamHI).
• Prin adăugarea lor la extremităţile moleculelor de ADN se creează
situsuri ţintă pentru acţiunea enzimelor de restricţie cu care se
tratează atât ADN heterolog cât şi molecula vectorului, apărând astfel
extremităţi adezive complementare pentru clonare. Acest lucru
permite, ulterior, reizolarea genei (genelor) din molecula de ADN
recombinant prin folosirea enzimelor de restricţie ce recunosc
situsurile marginale.
• O varietate de linkeri o constituie cea care a primit
denumirea de linkeri "adaptativi" (= adaptori).
Aceştia sunt secvenţe oligonucleotidice, sintetizate
chimic, în general decamere, care permit legarea a
două molecule de ADN prevăzute cu extremităţi
coezive (rezultate însă prin acţiunea unor enzime
de restricţie diferite) sau un capăt drept și unul
coeziv. Ei pot face să fuzioneze două situsuri de
restricţie diferite: unul se leagă la extremitatea
3'OH a unei molecule, iar celălalt la extremitatea 5'
P a celeilalte, reconstituind ambele secvenţe.
Prezenţa la nivelul adaptorilor a extremităţilor
monocatenare 5’OH împiedică „recircularizarea”
secvenţelor de interes.
 4. Clonarea în cosmide
Strategia generală de clonare în vectorii de tip cosmide este următoarea:
• se izolează vectorul în forma sa de plasmidă şi se linearizează prin
clivare cu o enzimă de restricţie specifică. Aceeaşi enzimă este folosită
pentru obţinerea fragmentelor de ADN de clonat.
• vectorul linearizat şi fragmentele de ADN genomic se amestecă, se
tratează cu ligază, obţinându-se molecule lineare recombinate de tipul
cos-ori-Apr-ADN heterolog-cos.
• moleculele recombinate sunt supuse unui proces de împachetare "in
vitro" prin tratarea cu un "extract de împachetare" sau cu un fag 
mutant (helper); se obţin în acest fel particule fagice () ce conţin
cosmida recombinată.
• prin infectarea unei gazde corespunzătoare (E.coli), cosmida se
recircularizează şi funcţionează ca plasmidă. Selecţia clonelor
recombinate se face pe baza rezistenţei la antibiotice conferită de
cosmidă.